Name: evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Эта работа была поддержана учебными грантами Департамента акушерства и гинекологии Медицинского колледжа Бейлора (ALG) и исследовательским грантом R-01 (грант No DK114689) для CSB, SC и JM от Национальных институтов здравоохранения.

Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского колледжа Бейлора.
1. Получение [6,6-2H2] глюкозы
<ol><li>За день до процедуры приготовьте индикатор стабильного изотопа глюкоз?...

<ol>
	<li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria.">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li><li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria.">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome.">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li><li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome:+etiology,+pathogenesis+and+diagnosis.">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li><li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome.">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li><li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic-pituitary,+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome.">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li><li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease.">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li><li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population.">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome.">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li><li>H&#248;jlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment.">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li><li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome.">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li><li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance,+polycystic+ovary+syndrome,+and+type+2+diabetes+mellitus.">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+peripheral+insulin+resistance,+independent+of+obesity,+in+polycystic+ovary+syndrome.">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li><li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome.">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li><li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp.">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li><li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+&amp;#34;mild&amp;#34;+and+&amp;#34;severe&amp;#34;+type+2+diabetes.">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &amp;#34;mild&amp;#34; and &amp;#34;severe&amp;#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li><li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats.">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).</li><li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+reproductive,+metabolic,+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models.">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li><li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes.">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide.">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li><li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&amp;#34;true&amp;#34;+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6,6-dideuteroglucose.">Measurement of &amp;#34;true&amp;#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li><li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition.">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice.">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice.">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li><li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice.">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).</li><li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model.">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice.">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li><li>Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+hepatic+insulin+resistance.">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).</li></ol>

Гипергликемия и аномальный метаболизм глюкозы / гомеостаз являются особенностями СПКЯ. Уровень глюкозы в крови поддерживается комбинацией глюкозы из рациона и производства глюкозы посредством гликогенолиза и глюконеогенеза и гликогенеза под контролем гормонов и ферментов. Про?...

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является распространенным расстройством, встречающимся у 12%-20% женщин репродуктивного возраста1,2. Это сложное заболевание, приводящее к переменным фенотипам, включающим поликистоз яичников, нерегулярные менструации и клинические или лабораторные доказательства гиперандрогении, и обычно диагностируется, когда женщина соответствует двум из трех критериев3. Преобладающим аспектом СПКЯ и ключевым фактором его патогенеза являются метаболические нарушения, которые обнаруживаются у женщин, страдающих этим заболеванием. Женщины с СПКЯ имеют более высокие показатели резистентности к инсулину, непереносимости глюкозы, ожирения и метаболического синдрома3,4,5,6. Инсулинорезистентность является не только проявлением заболевания, но и, как полагают, способствует его патогенезу, потенцируя действие лютеинизирующего гормона в яичнике, что приводит к увеличению выработки андрогенов7,8. Считается, что резистентность к инсулину имеет несколько возможных истоков, но исследования показывают, что это может быть связано с аномальными паттернами передачи сигналов рецепторов инсулина9,10. Исследования оценивали резистентность к инсулину у пациентов с СПКЯ с использованием метода золотого стандарта гиперинсулинемико-эугликемического зажима11,12,13,14,15. Женщины с СПКЯ, независимо от ИМТ, имеют более высокие уровни резистентности к инсулину по сравнению с контрольной группой. Инсулиновый контроль над выработкой глюкозы нарушается при нарушениях инсулинорезистентности, приводящих к избыточной выработке глюкозы. Например, у больных сахарным диабетом повышены показатели глюконеогенеза и нарушено подавление гликогенолиза16. Кроме того, нарушение подавления выработки глюкозы наблюдалось у крыс с диабетом17. Хотя исследования зажима могут дать измерение резистентности к инсулину, немногие исследования при СПКЯ сосредоточены на прямом измерении производства глюкозы в состоянии голодания и кормления. Это требует использования нерадиоактивного изотопного индикатора глюкозы и инфузии и измерения с помощью масс-спектрометрии.
Животные модели широко используются в исследованиях СПКЯ. Как худые, так и тучные модели СПКЯ были созданы путем введения андрогенов пренатально, препубертально или постпубертально18. Модели Грызунов СПКЯ также демонстрируют метаболические различия по сравнению с их соответствующими контрольными группами. Предыдущие данные из нашей лаборатории продемонстрировали аномальные тесты на толерантность к глюкозе (ГТТ) в моделях мышей с СПКЯ (худые и тучные), что согласуется с литературой по СПКЯ человека19. Использование модели бережливого и тучного животного позволяет дополнительно исследовать метаболические различия. В частности, эта модель позволяет оценить скорость производства глюкозы непосредственно с использованием изотопных индикаторов глюкозы. Одним из наиболее часто используемых стабильных изотопных индикаторов глюкозы является [6,6-2H2]глюкоза. Обогащение [6,6-2H2] глюкозой может быть измерено с использованием производного пентаацетата, как описано ранее20.
В этом исследовании наша цель состояла в том, чтобы измерить скорость производства глюкозы в печени при голодании и богатом глюкозой состоянии у мышей с СПКЯ с использованием изотопной инфузии глюкозы. Эти методы могут быть применены к широкому спектру экспериментов, связанных с кинетикой глюкозы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride solution</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>275595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75846-756</td>
			<td>Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch clear transpore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200400169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch Labeling tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe containing heparanized saline flush</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>191-MIH-2235</td>
			<td>One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9891620</td>
			<td>5 mm if animal is between 2 and 6 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced hot plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-602</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 27 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Health Warehouse</td>
			<td>A283952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Medvet</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 1000 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caging pellets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear VOA glass vials with closed-top cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-719-120</td>
			<td>For storage of acetone and blood draw samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper toothless alligator clamp for tourniquet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-349-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62999-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Ohaus Adventurer Pro</td>
			<td>AV264C</td>
			<td>Any similar model with 0.0001g accuracy can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bottle, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0158-12EA</td>
			<td>Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra multi-syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheets and dividers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; used to cage mice during infusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является распространенным заболеванием, которое приводит к нарушениям метаболизма глюкозы, таким как резистентность к инсулину и непереносимость глюкозы. Дисрегулируемый метаболизм глюкозы является важным проявлением заболевания и является залогом его патогенеза. Поэтому исследования, включающие оценку метаболизма глюкозы при СПКЯ, имеют первостепенное значение. Очень немногие исследования количественно оценивали производство глюкозы в печени непосредственно в моделях СПКЯ с использованием нерадиоактивных индикаторов глюкозы. В этом исследовании мы обсудим пошаговые инструкции по количественной оценке скорости производства глюкозы в печени в мышиной модели СПКЯ путем измерения обогащения M+2 [6,6-2H2]глюкозы, стабильного изотопного индикатора глюкозы, с помощью газовой хроматографии - масс-спектрометрии (GCMS). Эта процедура включает в себя создание стабильного изотопного раствора индикатора глюкозы, использование катетера хвостовой вены и инфузию индикатора глюкозы как в состоянии натощак, так и в состояниях, богатых глюкозой, у одной и той же мыши в тандеме. Обогащение [6,6-2H2]глюкозы измеряют с использованием производного пентаацетата в GCMS. Этот метод может быть применен к широкому спектру исследований, включающих прямое измерение скорости производства глюкозы в печени.

Используя ранее описанные уравнения разбавления изотопов, общая скорость глюкозы в плазме (глюкозаRa) была рассчитана из обогащения M+2 [6,6-2H2]глюкозой в условиях голодания и богатых глюкозой состояний с использованием производного пентаацетата21. В стацион?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Это исследование описывает прямое измерение производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников с использованием стабильного изотопного индикатора глюкозы через хвостовую вену как натощак, так и в богатых глюкозой состояниях в тандеме.

Оценка производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Целью этой процедуры является определение производства глюкозы в печени при синдроме поликистозных яичников или мышиной модели СПКЯ. Дисрегулируемый метаболизм глюкозы является важным проявлением СПКЯ и является ключом к его патогенезу. Поэтому исследования, включающие оценку метаболизма глюкозы при СПКЯ, имеют первостепенное значение.В этом исследовании мы обсуждаем пошаговые инструкции по количественной оценке скорости производства глюкозы в печени в мышиной модели СПКЯ путем измерения M плюс два обогащения шести шести дейтерированных глюкоз, стабильного изотопного индикатора глюкозы, с помощью газовой хроматографии, масс-спектрометрии или GCMS. Эта процедура включает в себя создание стабильного изотопного раствора индикатора глюкозы, использование установки катетера хвостовой вены и инфузию индикатора глюкозы как в состоянии голодания, так и в состояниях, богатых глюкозой, у одной и той же мыши в тандеме. За день до процедуры приготовьте индикатор стабильного изотопа глюкозы в обычном физиологическом растворе.Для этого эксперимента измеряли выработку глюкозы во время голодания в условиях, богатых глюкозой, поэтому изотоп глюкозы готовили в двух разных препаратах. Индикатор получали в стерильных условиях путем растворения стерильных и не содержащих пирогенов шести шести дейтерированных глюкоз и стерильных 0,9% раствора натрия хлорида с глюкозой или без нее. Первый настой готовили только с помощью индикатора.Второй инфузия содержала как индикатор, так и неизотопную глюкозу. После того, как растворы были приготовлены, их стерильно фильтровали фильтром 0,22 микрона и хранили при четырех градусах Цельсия. Растворы готовили таким образом, чтобы конечная доза инфузии была близка к одному миллиграмму на килограмм и минуту и двум миллиграммам на килограмм и минуту соответственно.Для измерения скорости появления глюкозы во время базального состояния в богатом глюкозой состоянии использовалась средняя постоянная скорость инфузии шести шести дейтерированных глюкозы по 1,08 миллиграмма на килограмм и минуту и 1,9 миллиграмма на килограмм в минуту соответственно. Чтобы имитировать кормовое состояние, мы использовали среднюю скорость инфузии D-глюкозы 18,8 миллиграммов на килограмм с минутой во время состояния, богатого глюкозой. Выньте мышей из их домашних клеток и поместите их в клетки для голодания за три часа до начала эксперимента.Для этого эксперимента мы использовали четырехмесячных самок мышей из штамма C57BL6J. Соберите оборудование для клетки, сгруппировав мышей в определенное количество мышей на инсулиновую помпу. Поместите перегородки поверх плоского, стабильного основания, чтобы сделать отдельные стойла для мышей.Клетки прозрачные и сделаны из оргстекла. Есть плоское, устойчивое основание, на котором сидят перегородки. Дверь в клетку скользит, чтобы закрыться, и имеет выемку внизу, чтобы позволить хвосту пройти.Соберите шприцы, содержащие один миллилитр базального инфузизата, затем подключите к трубке инфузионного насоса с помощью полиэтиленовой трубки. Подготовьте инфузионный насос, установив скорость до 150 микролитров в час, что является базальной нормой. Нагрейте водяную баню до 48 градусов по Цельсию.Подготовьте станцию установки катетера, прилегающую к водяной бане, содержащую полудюймовые иглы 30 калибра, силастические трубки и однодюймовую прозрачную транспортную ленту. Выберите одну мышь и поместите ее в защищенный держатель с доступом к хвосту. Поместите кусок ленты на проксимальную часть хвоста, чтобы освободить место для введения катетера более дистально.Подведите мышь к водяной бане и вставьте хвост на водяную баню примерно на 30-45 секунд. Это помогает расширить сосудистую систему хвоста для установки катетера. Установка катетера должна производиться в стерильных условиях.Как только хвост нагреется, очистите хвост и поместите небольшой медный беззубый зажим аллигатора в качестве жгута на проксимальном конце хвоста. Визуализируйте боковую хвостовую жилку под увеличительным стеклом. Затем осторожно вставьте катетер в хвостовую вену, и аккуратно промойте раствор, чтобы обеспечить проходимость катетера.Оберните кусок транспортной ленты вокруг места введения, чтобы закрепить катетер, и снимите небольшой жгут с хвоста. Поместите мышь в ее индивидуальную клетку и закройте раздвижную дверь, убедившись, что хвост выступает через выемку и остается за пределами клетки. Поместите дополнительный кусок ленты на весь катетер и хвост, чтобы закрепить его на опорной пластине клетки.Отсоедините смыв от катетера хвостовой вены и поместите небольшой зажим на силастическую трубку катетера, чтобы предотвратить обратный поток при подключении инфузионной линии к насосу. После надежного соединения снимите зажим и промойте грунтовочный раствор, который состоит из настоя. Убедитесь, что раствор прозрачен в пробирке и не окрашен кровью.Как только линии инфузии будут отмечены, что они функционируют должным образом, снимите крышку с мыши. Разместите стандартную постельную принадлежность вокруг мыши. Начните инфузию с инфузии, содержащей индикатор, и запускайте его в течение трех часов непрерывно.На время инфузии продолжайте проверять самочувствие мышей, а также линии инфузии. Убедитесь, что инфузионная трубка надежно закреплена и что нет утечек из точек подключения линии. После завершения первой инфузии остановите инфузию и поместите зажим на трубку катетера, чтобы предотвратить обратный поток.Осторожно удалил мышей из их вольеров, не нарушая катетер, чтобы собрать кровь. Для этого эксперимента мыши подверглись проколу щечных вен с использованием четырехмиллиметрового ланцета. Соберите примерно 75 микролитров крови в желаемый флакон.Для депротеинизации образцов при подготовке к масс-спектрометрии добавляют примерно 15 микролитров крови к 500 микролитрам ацетона. Оставшаяся кровь может быть использована для проверки уровня глюкозы в крови с помощью глюкометра и / или центрифуги для разделения плазмы для будущих гормональных анализов. Удалите инфузию из шприцевых насосов, отсоединив трубку от шприцев, и замените ее вторым инфузистом, содержащим индикатор вместе с глюкозой.Повторите предыдущие этапы инфузии, используя богатую глюкозой изотопную инфузию глюкозы. Чтобы достичь устойчивого состояния, запускайте болюс второго инфузии по 600 микролитров в час в течение 15 минут. Обратите внимание на время начала для каждой группы клеток.Уменьшите скорость инфузии до 150 микролитров в час, чтобы завершить три часа общего времени инфузии. Повторный забор крови, как описано ранее. Отсоедините инфузии, надавите на участки катетера до тех пор, пока кровотечение не прекратится, и верните мышей в их домашние клетки.Далее образцы отправляются на GCMS. Рассчитать изотопное обогащение изотопа глюкозы при пике глюкозы С помощью GCCMS с использованием производного пентаацетата. Вкратце, этот метод включает в себя получение пентаацетатного производного глюкозы с последующим анализом образца с использованием GCMS в режиме положительной химической ионизации.Селективный ионный мониторинг отношения массы к заряду, 171 к 169, выполняется для определения М плюс два обогащения изотопа глюкозы. Все кинетические измерения выполняются в стационарных условиях. Рассчитайте общую скорость появления глюкозы в плазме из M плюс два обогащения изотопа глюкозы и плазмы, используя установленные уравнения разбавления изотопов.В установившихся условиях предполагается, что скорость появления глюкозы равна скорости исчезновения глюкозы. Скорость выработки эндогенной глюкозы равна общей норме глюкозы плазмы минус экзогенная глюкоза. В первую таблицу включены репрезентативные результаты исследования.Все единицы выражаются в миллиграмме на килограмм и минуту. Используя ранее описанные уравнения разбавления изотопов, была рассчитана общая норма глюкозы в плазме. В контрольной группе средний уровень глюкозы при появлении составил 19,98 в состоянии натощак.В условиях, богатых глюкозой, показатель появления глюкозы составлял 25,8. Скорость производства глюкозы составила 19,08 в состоянии натощак и 8,56 в состоянии, богатом глюкозой. Аномальный метаболизм глюкозы и гомеостаз распространены при СПКЯ.При нарушениях аномального метаболизма глюкозы нарушается регуляция подавления выработки глюкозы, что приводит к гипергликемии. В этом исследовании мы описываем простой способ измерения скорости производства глюкозы в печени у нескольких мышей одновременно. Важнейшими компонентами этого эксперимента являются введение катетера и определение точных измерений изотопа глюкозы и естественной глюкозы для адекватного выполнения GCMS.Преимуществами исследования является выполнение инфузии минимально инвазивным способом за счет введения катетера хвостовой вены, а также использование легкодоступного, стабильного индикатора глюкозы. Существуют некоторые ограничения для исследования, в том числе техническая потребность в процедуре и потребность в возможных дополнительных навыках. В целом, мы описываем простой и точный способ измерения скорости общего производства глюкозы в печени в модели мыши с СПКЯ.Этот метод может послужить основой для многочисленных исследований, включающих метаболизм глюкозы мышиных моделей.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

Мышиной модели Биолюминесцентный опухоли Печеночная

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Доклинические мышиной модели метастазами в печени

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Возможно данио рерио Модель поликистоза почек: Нокдаун<em&gt; Wnt5a</em&gt; Причины кисты у рыбок данио почек

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Оценка опухоли инфильтрирующие лейкоцитов подмножеств в подкожной опухоли модели

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Промывание индуцированных Поверхностно Истощение в Свиней в качестве модели синдрома острой дыхательной недостаточности (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Генерация гуманизированное печени мышей с помощью печени человека стволовые клетки

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats

Инвазивных гемодинамических характеристик портал гипертензивный синдром цирротической крыс

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

Олеиновая кислота инъекции в свиней как модель для острого респираторного дистресс-синдрома

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Изометрические сократимости измерение верхней брыжеечной артерии мыши, с помощью проволоки миография

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Стандартизированная гистоморфометрическая оценка остеоартрита в модели хирургической мыши

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...