Name: evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Detta arbete stöddes av utbildningsbidrag från institutionen för obstetrik och gynekologi, Baylor College of Medicine (ALG) och R-01 forskningsanslag (Anslag # DK114689) för CSB, SC och JM från National Institutes of Health.

Alla djurprocedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Baylor College of Medicine.
1. Beredning av [6,6-2H2]glukos
<ol><li>En dag före proceduren, förbered den stabila isotop glukosspåraren i normal saltlösning. För detta experiment användes [6,6-2H2]glukos som en spårämne för att mäta plasma glukos utseende. OBS: I detta experiment mättes glukosproduktion under fasta och glukosrika ...

<ol>
	<li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria.">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li><li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria.">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome.">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li><li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome:+etiology,+pathogenesis+and+diagnosis.">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li><li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome.">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li><li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic-pituitary,+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome.">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li><li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease.">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li><li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population.">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome.">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li><li>H&#248;jlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment.">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li><li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome.">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li><li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance,+polycystic+ovary+syndrome,+and+type+2+diabetes+mellitus.">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+peripheral+insulin+resistance,+independent+of+obesity,+in+polycystic+ovary+syndrome.">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li><li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome.">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li><li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp.">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li><li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+&amp;#34;mild&amp;#34;+and+&amp;#34;severe&amp;#34;+type+2+diabetes.">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &amp;#34;mild&amp;#34; and &amp;#34;severe&amp;#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li><li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats.">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).</li><li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+reproductive,+metabolic,+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models.">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li><li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes.">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide.">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li><li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&amp;#34;true&amp;#34;+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6,6-dideuteroglucose.">Measurement of &amp;#34;true&amp;#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li><li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition.">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice.">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice.">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li><li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice.">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).</li><li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model.">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice.">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li><li>Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+hepatic+insulin+resistance.">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).</li></ol>

Hyperglykemi och onormal glukosmetabolism/homeostas är funktioner i PCOS. Blodsockernivån upprätthålls av en kombination av glukos från kost- och glukosproduktion via glykogenolys och glukoneogenes och glykogenes, under kontroll av hormon och enzymer. Lever glukosproduktion undertrycks av närvaron av ökade cirkulerande glukosnivåer. Vid störningar av onormal glukosmetabolism äventyras regleringen av undertryckandet av glukosproduktionen vilket leder till hyperglykemi. Medan många studier har visat ind...

Polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) är en vanlig sjukdom som förekommer hos 12-20% av reproduktiva kvinnor1,2. det är en komplex sjukdom som resulterar i varierande fenotyper som omfattar polycystiska äggstockar, oregelbundna menstruationer och kliniska eller laboratorium bevis på hyperandrogenemia, och diagnostiseras vanligtvis när en kvinna uppfyller två av de tre kriterierna3. En dominerande aspekt av PCOS, och en nyckelfaktor i dess patogenes, är metaboliska derangements som finns hos kvinnor som har sjukdomen. Kvinnor med PCOS har högre förekomster av insulinresistens, glukosintolerans, fetma och metaboliskt syndrom3,4,5,6. Insulinresistens är inte bara en manifestation av sjukdomen, men det tros bidra till dess patogenes genom att förstärka verkan av luteiniserande hormon i äggstocken och därmed leda till ökad androgenproduktion7,8. Insulinresistens tros ha flera möjliga ursprung men studier tyder på att det kan bero på onormala mönster av insulinreceptorsignalering9,10. Studier har utvärderat insulinresistens hos PCOS-patienter med hjälp av guldstandardtekniken hyperinsulinisk-euglykemisk klämma11,12,13,14,15. Kvinnor med PCOS, oavsett BMI, har högre nivåer av insulinresistens jämfört med kontroller. Insulinkontrollen över glukosproduktionen är nedsatt vid störningar i insulinresistens som leder till överdriven glukosproduktion. Till exempel har diabetiker patienter ökad frekvens av glukoneogenes och nedsatt undertryckande av glykogenolys16. Dessutom har nedsatt undertryckande av glukosproduktionen observerats hos diabetiker råttor17. Även om klämstudier kan ge en mätning av insulinresistens, fokuserar få studier i PCOS på direkt mätning av glukosproduktion i fasta och matade tillstånd. Detta kräver användning av en icke-radioaktiv isotopisk glukosspårare infusion och mätning via masspektrometri.
Djurmodeller har använts i stor utsträckning i PCOS-forskning. Både mager och överviktig PCOS murine modeller har skapats genom att administrera androgener prenatally, prepubertally, eller post-pubertally18. Gnagare PCOS-modeller visar också metaboliska skillnader jämfört med deras respektive kontroller. Tidigare data från vårt labb visat onormal glukos tolerans tester (GTT) i PCOS mus modeller (mager och överviktig), överensstämmer med mänskliga PCOS litteratur19. Användning av en mager och överviktig djurmodell möjliggör ytterligare undersökning av metaboliska skillnader. Specifikt tillåter denna modell utvärdering av glukosproduktionens hastighet direkt med isotopiska glukosspårare. En av de vanligaste stabila isotopiska glukosspåraren är [6,6-2H2]glukos. [6,6-2H2]glukosberikning kan mätas med hjälp av ett pentaacetatderivat som tidigare beskrivits20.
I denna studie var vårt mål att mäta hastigheten på lever glukosproduktion i fasta och glukos-rikt tillstånd i PCOS möss med hjälp av isotopisk glukos infusion. Dessa tekniker kan tillämpas på ett brett spektrum av experiment som involverar glukoskinetik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride solution</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>275595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75846-756</td>
			<td>Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch clear transpore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200400169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch Labeling tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe containing heparanized saline flush</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>191-MIH-2235</td>
			<td>One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9891620</td>
			<td>5 mm if animal is between 2 and 6 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced hot plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-602</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 27 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Health Warehouse</td>
			<td>A283952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Medvet</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 1000 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caging pellets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear VOA glass vials with closed-top cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-719-120</td>
			<td>For storage of acetone and blood draw samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper toothless alligator clamp for tourniquet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-349-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62999-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Ohaus Adventurer Pro</td>
			<td>AV264C</td>
			<td>Any similar model with 0.0001g accuracy can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bottle, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0158-12EA</td>
			<td>Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra multi-syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheets and dividers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; used to cage mice during infusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model

Polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) är en vanlig sjukdom som resulterar i störningar i glukosmetabolismen, såsom insulinresistens och glukosintolerans. Dysreglerad glukosmetabolism är en viktig manifestation av sjukdomen och är nyckeln till dess patogenes. Därför är studier som involverar utvärdering av glukosmetabolism i PCOS av yttersta vikt. Mycket få studier har kvantifierat lever glukosproduktion direkt i PCOS-modeller med icke-radioaktiva glukosspårare. I denna studie diskuterar vi steg-för-steg instruktioner för kvantifiering av graden av lever glukos produktion i en PCOS musmodell genom att mäta M +2 berikning av [6,6-2H2]glukos, en stabil isotopisk glukos tracer, via gas kromatografi - masspektrometri (GCMS). Denna procedur innebär skapandet av stabil isotopisk glukosspårare lösning, användning av svansveter kateter placering och infusion av glukosspåraren i både fasta och glukosrika tillstånd i samma mus i tandem. Berikningen av [6,6-2H2]glukos mäts med pentaacetatderivat i GCMS. Denna teknik kan tillämpas på en mängd olika studier som involverar direkt mätning av graden av lever glukosproduktion.

Med hjälp av tidigare beskrivna isotop utspädningsekvationer beräknades den totala plasma glukoshastigheten (glukosRa) från M +2 berikning av [6,6-2H2]glukos i fasta och glukos-rika villkor med hjälp av pentaacetate derivat21. Under steady-state förhållanden antas det att glukosens utseende är lika med graden av försvinnande av glukos. I kontrollgruppen var den totala glukosRa 19,98 ± 2,53 mg/(kg·min) efter 6 h fasta och 25,80 ± 1,76 mg/(kg·...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Denna studie beskriver direkt mätning av lever glukos produktion i en polycystiskt äggstock syndrom mus modell genom att använda en stabil isotopisk glukos tracer via svans ven i både fasta och glukos-rika stater i tandem.

Utvärdering av leverglukosproduktion i en polycystisk äggstockssyndrom musmodell

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Målet med denna procedur är att bestämma lever glukos produktion i en polycystiskt äggstock syndrom, eller PCOS mus modell. Dysreglerad glukosmetabolism är en viktig manifestation av PCOS och är nyckeln till dess patogenes. Därför är studier som involverar utvärdering av glukosmetabolism i PCOS av yttersta vikt.I denna studie diskuterar vi steg-för-steg instruktioner för kvantifiering av hastigheten på lever glukos produktion i en PCOS mus modell genom att mäta M plus två anrikning av sex sex deuterated glukos, en stabil isotopisk glukos tracer, via gas kromatografi, masspektrometri eller GCMS. Detta förfarande innebär skapandet av en stabil isotopisk glukosspårare lösning, användning av svansveter kateter placering och infusion av glukosspåraren i både fasta och glukosrika tillstånd i samma mus i tandem. En dag före proceduren, förbered den stabila isotop glukosspåraren i normal saltlösning.För detta experiment mättes glukosproduktion under fasta i glukosrika förhållanden så glukosisotopen förbereddes i två olika preparat. Spårämnet framställdes under sterila förhållanden genom att lösa sterila och pyrogenfria sex sex deutererade glukos och sterila 0,9%natriumkloridlösning med eller utan glukos. Den första infundatet förbereddes med endast spårämnet.Den andra infusate innehöll både tracer tillsammans med nonisotopic glukos. När lösningarna var förberedda filtrerades de sterilt med 0,22 mikronfiltret och lagrades vid fyra grader Celsius. Lösningarna utarbetades på ett sådant sätt att den slutliga infunderingsdosen var nära ett milligram per kilo respektive minut och två milligram per kilo respektive minut.För mätning av glukos utseende hastighet under basala villkor i glukos-rika villkor, en primed genomsnittlig konstant hastighet infusion av sex sex deuterated glukos på 1,08 milligram per kilo och minut och 1,9 milligram per kilo i minuten respektive. För att efterlikna matat tillstånd använde vi en genomsnittlig D-glukos infusionshastighet på 18,8 milligram per kilo och minut under glukosrikt tillstånd. Ta bort mössen från deras hemburar och placera dem i sina fasta burar tre timmar före experimentets början.För detta experiment använde vi fyra månader gamla kvinnliga möss från C57BL6J stammen. Montera hylsutrustningen genom att gruppera mössen i ett visst antal möss per insulinpump. Placera skiljeväggar ovanpå en platt, stabil bas för att göra enskilda bås för mössen.Burar är tydliga och gjorda av plexiglas. Det finns en platt, stabil bas på vilken skiljeväggarna sitter. Dörren till buret glider för att stänga och har ett hack i botten för att låta svansen passa igenom.Montera sprutorna som innehåller en milliliter basal infusat och anslut sedan till infusionspumpslangar med hjälp av polyetenslangen. Förbered infusionspumpen genom att ställa in hastigheten på 150 mikroliter i timmen, vilket är basalhastigheten. Värm ett vattenbad till 48 grader Celsius.Förbered kateterinsättningsstationen intill vattenbadet som innehåller 30-gauge halvtumsnålar, silastiska slangar och en tum, tydlig transporttejp. Välj en mus och placera den i en säker hållare med tillgång till svansen. Placera en tejpbit över den proximala delen av svansen så att kateterns införing får utrymme mer distally.Ta musen till vattenbadet och sätt in svansen i vattenbadet i cirka 30 till 45 sekunder. Detta hjälper till att vidga svansvaskulaturen för kateterplacering. Kateterinsättningen måste ske under sterila förhållanden.När svansen är uppvärmd, rengör svansen och placera en liten koppar tandlös alligatorklämma som en stass i svansens proximala ände. Visualisera den laterala svansvenen under ett förstoringsglas. Sätt sedan försiktigt in katetern i svansven och spola försiktigt lösningen för att säkerställa kateterns patency.Linda en bit transporttejp runt införingsstället för att säkra katetern och ta bort den lilla stassen från svansen. Placera musen i sin individuella bur och stäng skjutdörren, se till att svansen sticker ut genom skåran och förblir utanför buret. Placera ytterligare en tejpbit över hela katetern och svansen för att fästa den på burets bottenplatta.Koppla bort spolningen från svansvetetern och placera den lilla klämman på kateterns silastiska slangar för att förhindra återflöde samtidigt som infusatledningen ansluts från pumpen. När du är ordentligt ansluten, ta bort klämman och spola priminglösningen som består av infusatet. Se till att lösningen är klar i röret och inte blodfläckad.När infusionslinjerna har noterats fungera korrekt, ta bort locket från musen. Placera standardsängkläder runt musen. Starta infusionen med infusatet som innehåller spåraren och kör den i tre timmar kontinuerligt.Under infusionen, fortsätt att kontrollera mössens välbefinnande, liksom infusionslinjerna. Se till att infusionsslangen är ordentligt fastsatt och att det inte finns några läckor från linjeanslutningspunkterna. När den första infusionen har slutförts, stoppa infusionen och placera en klämma på kateterns slang för att förhindra återflöde.Försiktigt avlägsnade mössen från deras höljen utan att störa katetern för att samla blod. För detta experiment genomgick mössen kind ven punktering med hjälp av en fyra millimeter lancet. Samla in cirka 75 mikroliter blod i önskad injektionsflaska.För att deproteinisera prover som förberedelse för masspektrometri, tillsätt cirka 15 mikroliter blod till 500 mikroliter aceton. Återstående blod kan användas för att kontrollera blodsockernivån via glucometer och/eller en centrifug för att separera plasma för framtida hormonanalyser. Ta bort infundatet från sprutpumparna genom att koppla bort slangen från sprutorna och byt ut den mot den andra infusate som innehåller spårämne tillsammans med glukos.Upprepa tidigare infusionssteg med den glukosrika isotopiska glukosinfusionen. För att nå stabilt tillstånd, kör en bolus av den andra infusate vid 600 mikroliter i timmen i 15 minuter. Notera starttiden för varje grupp av burar.Minska infusionshastigheten till 150 mikroliter i timmen för att slutföra de tre timmarna av den totala infusionstiden. Upprepa blodprov som tidigare beskrivits. Koppla bort infusioner, applicera tryck på kateterplatserna tills blödningen upphör och återför mössen till sina hemburar.Därefter skickas exemplen för GCMS. Beräkna den isotopiska anrikningen av glukosisotopen under glukostoppen med hjälp av pentaacetatderivatet. Kortfattat innebär denna metod beredning av pentaacetatderivatet av glukos, följt av provanalys med GCMS i det positiva kemiska joniseringsläget.Selektiv jonövervakning av förhållandet mellan massa och laddning, 171 till 169, utförs för att bestämma M plus två anrikningar av glukosisotopen. Alla kinetiska mätningar utförs under stabila förhållanden. Beräkna den totala plasmaglukosens utseendehastighet från M plus två anrikningar av glukosisotopen och plasman med hjälp av etablerade isotoputspädningsekvationer.Under stabila förhållanden antas det att glukosens utseende är lika med graden av försvinnande av glukos. Graden av endogen glukosproduktion motsvarar total plasmaglukosfrekvens minus exogen glukos. Tabell ett innehåller de representativa resultaten från studien.Alla enheter uttrycks som milligram per kilo och minut. Med hjälp av tidigare beskrivna isotop utspädningsekvationer beräknades total plasma glukos hastighet. I kontrollgruppen var den genomsnittliga glukoshastigheten för utseende 19,98 i fasta tillstånd.I glukosrika förhållanden var glukoshastigheten för utseende 25,8. Glukosproduktionshastigheten var 19,08 i fastetillståndet och 8,56 i glukosrikt tillstånd. Onormal glukosmetabolism och homeostas är vanliga i PCOS.Vid störningar av onormal glukosmetabolism äventyras regleringen av undertryckandet av glukosproduktionen vilket leder till hyperglykemi. I denna studie beskriver vi ett enkelt sätt att mäta hastigheten på lever glukosproduktion i flera möss samtidigt. De kritiska komponenterna i detta experiment är kateterinsättningen och definierar de exakta mätningarna av glukosisotopen och naturlig glukos för att utföra GCMS på ett adekvat sätt.Fördelarna med studien är att utföra infusionen på ett minimalt invasivt sätt på grund av bakvetertereterinsättning, samt användning av en lätt uppnåelig, stabil glukosspårare. Det finns vissa begränsningar i studien, inklusive den tekniska efterfrågan på förfarandet och behovet av eventuella ytterligare färdigheter. Sammantaget beskriver vi ett enkelt, exakt sätt att mäta hastigheten på den totala leverglukosproduktionen i en PCOS-musmodell.Denna teknik kan tjäna som grund för flera studier som involverar glukosmetabolism av musmodeller.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

Murina Bioluminescent Nedsatt tumör Modell

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

En Prekliniska mus modell av levermetastaser

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En möjlig Zebrafish Modell av polycystisk njursjukdom: Knockdown av<em&gt; Wnt5a</em&gt; Orsaker Cystor i Zebrafish Njurar

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Utvärdering av tumörinfiltrerande Leukocyte Subsets i en subkutan tumör Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Lavage-inducerad tensid Depletion i Pigs som en modell för den akut andnödssyndrom (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering av en humaniserad muslever Använda Human lever stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats

Invasiva hemodynamiska karakterisering av Portal-hypertensiv syndrom hos cirrotiska råttor

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

Oljesyra-injektion hos svin som modell för akut respiratoriskt distressyndrom

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Standardiserad histomorphometrisk utvärdering av artros i en kirurgisk musmodell

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...