Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

نشكر الدكتور جيل ويلدونجر والدكتور سيهوي ز. يانغ والسيدة جوزفين دبليو ميتشل في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة ويسكونسن في ماديسون على مشاركتهم بسخاء سلالة ذبابة elav-Gal4 و UAS-CD8::GFP (مركز بلومنغتون للأوراق المالية ، # 5146). ونود أيضا أن نشكر الدكتور أوريليان دوبوين، والسيد لوران سيكوييه، والسيدة ماري شارلوت مانوس من ألفيول والسيد سيرج قدورا من مختبرات نانوسكيل على دعمهم السخي خلال هذا المشروع. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل جامعة ويسكونسن ، ماديسون ، قسم الكيمياء الحيوية في جامعة ويسكونسن ، ماديسون ، ومنح خدمات الصحة العامة R01 GM114561 ، R01 GM104540 ، R01 GM104540-03W1 ، و U24 GM139168 إلى E.R.W. و R01 AI150475 إلى P.W.S. من المعاهد الوطنية للصحة. تم دعم جزء من هذا البحث من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة U24 GM129547 وتم إجراؤه في PNCC في OHSU وتم الوصول إليه من خلال EMSL (grid.436923.9) ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة برعاية مكتب البحوث البيولوجية والبيئية. نحن ممتنون أيضا لاستخدام المرافق والأجهزة في مركز أبحاث Cryo-EM في قسم الكيمياء الحيوية في جامعة ويسكونسن ، ماديسون.

<ol>
	<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM:+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity.">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+electron+crystallography+of+2D+crystals+to+MicroED+of+3D+crystals.">From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals.</a> Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-the+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>B&#228;uerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+native+Drosophila+tissues+vitrified+by+plunge+freezing.">Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing.</a> bioRxiv. , 437159 (2021).</li><li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells.">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).</li><li>Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+Electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).</li><li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> Elife. 8, 45919 (2019).</li><li>Wu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+neuronal+networks.">Micropatterning neuronal networks.</a> Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+micropatterning+technology+for+whole+cell+cryogenic+electron+microscopy+studies.">Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+micropatterning+for+cryo-electron+tomography+studies+of+cell-cell+contacts.">Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts.</a> bioRxiv. , 272237 (2021).</li><li>Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+cryo-electron+tomography+of+cultured+and+primary+eukaryotic+cells+on+micropatterned+TEM+grids.">Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids.</a> bioRxiv. , 447251 (2021).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons.">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+assembly+of+respiratory+syncytial+virus+revealed+by+cryo-electron+tomography.">The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography.</a> Viruses. 10 (8), (2018).</li><li>Stobart, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+RSV+vaccine+with+engineered+thermostability+is+immunogenic+in+cotton+rats+despite+high+attenuation.">A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation.</a> Nature Communications. 7, 13916 (2016).</li><li>Hotard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stabilized+respiratory+syncytial+virus+reverse+genetics+system+amenable+to+recombination-mediated+mutagenesis.">A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis.</a> Virology. 434 (1), 129-136 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+virus+assembly+and+organization+by+the+measles+virus+matrix+protein.">Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein.</a> Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).</li><li>Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+situ+neuronal+model+for+cryo-ET.">A new in situ neuronal model for cryo-ET.</a> Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition.">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+method+for+cryo-electron+tomography:+Characterizing+stage+behavior+during+FISE+acquisition.">Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).</li><li>Anderson, D. E., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+micropatterning:+methods,+effects,+and+applications.">Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications.</a> Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+components+for+cell+culture.">Use of extracellular matrix components for cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).</li><li>Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy.">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).</li><li>Schellenberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+correlative+fluorescence+and+electron+cryo+microscopy+using+two+independent+alignment+markers.">High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers.</a> Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

تدعم المجاهر الإلكترونية الحديثة والمتقدمة وحزم البرامج الآن جمع بيانات cryo-EM و cryo-ET المؤتمتة حيث يمكن استهداف مئات إلى آلاف المواقع وتصويرها في غضون أيام قليلة32,33,34,35. أحد العوامل المحددة الهامة لسير عمل cryo-ET كامل الخلية هو الحصول على أعداد كافية من الأهداف القابلة للتحصيل لكل شبكة. في الآونة الأخيرة ، طور عدد من المجموعات بروتوكولات لشبكات الأنماط الدقيقة ل cryo-EM ، مع ميزة واحدة تتمثل في تحسين كفاءة جمع البيانات 16،17،18. هنا يتم تقديم بروتوكول لاستخدام نظام النمط الدقيق المتاح تجاريا لشبكات TEM micropattern لإجراء دراسات cryo-ET للخلايا العصبية الأولية لذبابة الفاكهة وخطوط الخلايا البشرية المستزرعة (غير المصابة أو المصابة بفيروس RSV). نظام الأنماط الدقيقة هذا متعدد الاستخدامات ويمكن تحسين العديد من الخطوات وتخصيصها لتناسب أهدافا تجريبية محددة. يمكن للمستخدم الذي يتمتع بخبرة TEM والفحص المجهري الفلوري أن يصبح ماهرا بسرعة في إعداد الشبكة والنمط الدقيق. مع الممارسة الدقيقة ، يجب أن تكون النتائج الجيدة قابلة للتحقيق بعد بضع تكرارات. فيما يلي ، تتم مناقشة بعض الخيارات المتاحة ، واعتبارات المستخدم ، والفوائد المحتملة ، والتطبيقات المستقبلية للنمط المصغر ل cryo-EM.
أحد الاعتبارات المهمة ل cryo-ET للخلية بأكملها هو اختيار شبكة EM. تتكون شبكات EM من جزأين: إطار شبكي (أو دعم هيكلي) ورقائق معدنية (أو فيلم) ، وهو سطح الفيلم المستمر أو الهولي الذي ستنمو عليه الخلايا. تستخدم الشبكات الشبكية النحاسية بشكل شائع في cryo-EM للبروتينات والمجمعات المعزولة. ومع ذلك ، فهي غير مناسبة ل cryo-ET كامل الخلية بسبب السمية الخلوية للنحاس. بدلا من ذلك ، يتم استخدام شبكة ذهبية بشكل شائع للتصوير المقطعي الخلوي. وتشمل الخيارات الأخرى النيكل أو التيتانيوم، والتي قد توفر فوائد على الذهب مثل زيادة الصلابة16. تتوفر شبكات EM بأبعاد شبكية مختلفة لدعم مجموعة من التطبيقات. توفر أحجام الشبكات الأكبر مساحة أكبر للخلايا للنمو بين قضبان الشبكة والمزيد من المناطق القابلة لجمع سلسلة الإمالة ، على الرغم من ذلك على حساب زيادة هشاشة العينة الإجمالية. الرقائق الأكثر استخداما هي الكربون غير المتبلور المثقب أو الثقب ، مثل Quantifoils أو شبكات C-flat. يمكن تصوير الأهداف البيولوجية إما من خلال الثقوب الموجودة في الكربون أو من خلال الكربون الشفاف للإلكترون. توفر شبكات مثل R 2/1 أو R 2/2 ، حيث يبلغ عرض الثقوب 2 ميكرومتر والمتباعدة 1 و 2 ميكرومتر على التوالي ، عددا كبيرا من الثقوب وبالتالي عددا كبيرا من المناطق المحتملة لجمع البيانات. ومع ذلك ، قد تنمو بعض الخلايا وتتوسع بشكل أفضل على الأسطح الأكثر اتساقا مثل شبكات R 1.2 / 20 أو الكربون المستمر. لمعالجة العينات النهائية عن طريق طحن الحزمة الأيونية المركزة (cryo-FIB) ، تتم إزالة الرقائق من خلال الطحن ، مما يقلل من المخاوف بشأن استمرار وجود الفيلم الأساسي. كما هو الحال مع الشبكة ، تتوفر أيضا رقائق من مواد أخرى ، مع كون بروتوكول النقش المعروض هنا مناسبا بنفس القدر لشبكات SiO2 . تشمل الشبكات شائعة الاستخدام شبكات Quantifoil الذهبية أو الكربون المستمر أو SiO2 film 200-mesh (تباعد 90 ميكرومتر تقريبا بين قضبان الشبكات) للتبريد الخلوي الكامل ET.
هناك عدد من الاعتبارات عند تصميم نمط. تسترشد غالبية هذه القرارات بنوع الخلية والغرض من التجربة. نقطة البداية الجيدة هي اختيار نمط يقترب من شكل وأبعاد الخلايا في الثقافة. أظهرت العديد من الدراسات تأثيرات كبيرة لشكل النمط على نمو الخلايا وترتيب الهيكل الخلوي13,36,37. يجب توخي الحذر بشكل خاص أثناء تصميم النمط إذا كان هذا يمكن أن يغير هدف الاهتمام. تم اختبار عدة أنماط لكل نوع من أنواع الخلايا لتحديد الأنماط التي تعزز الالتصاق الخلوي والنمو. تسمح مرونة نظام الأنماط الدقيقة باختبار أنماط متعددة على شبكة واحدة وتغيير الأنماط للشبكات المختلفة في تجربة واحدة. الأنماط الأكبر (~ 50-90 ميكرومتر) ، مثل تلك المستخدمة هنا ، تزيد من احتمال التصق خلايا متعددة بمنطقة واحدة من النمط وتسمح للخلايا بالتوسع والتمدد بعد الالتصاق. قد تكون الأنماط الأكثر تقييدا (20-30 ميكرومتر) مناسبة في التجارب التي يكون فيها عزل الخلايا أكثر أهمية من توسع الخلية ، مثل تجارب طحن الحزمة الأيونية المركزة (cryo-FIB). بالنسبة لتطبيقات التصوير المقطعي ، قد يحتاج المرء إلى النظر في تأثير محور الميل. إذا تم وضع نمط بحيث تنمو جميع الخلايا بالتوازي مع بعضها البعض في اتجاه واحد ، فمن الممكن أن تكون جميع الخلايا عمودية على محور الميل عند تحميلها على مرحلة المجهر ، مما يؤدي إلى انخفاض جودة البيانات.
على الشبكات غير المتناثرة ، غالبا ما تلتصق الخلايا بشكل تفضيلي بأشرطة الشبكة ، حيث لا يمكن تصويرها بواسطة TEM. حتى على الشبكات المنقوشة ، غالبا ما يلاحظ أن الخلايا توضع في زوايا مربعات الشبكة جزئيا على كل من رقائق الكربون المنقوشة وشريط الشبكة. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام النمط المصغر لوضع جزء من الخلية عمدا فوق شريط الشبكة18. يمكن النظر في ذلك في التجارب التي لا يكون فيها من الأهمية بمكان وجود محيط الخلية بالكامل على الرقاقة. يمكن أن يكون هذا مهما بشكل خاص للخلايا التي يمكن أن تنمو أكبر من مربع شبكة واحد ، مثل الخلايا العصبية الأولية التي تنمو على مدار عدة أيام.
هناك العديد من الأدوات التي يمكن استخدامها لتصميم نمط. هنا ، كان النمط مقتصرا على أقل من 800 بكسل في أي بعد بحيث يمكن تدوير النمط إلى أي زاوية ولا يزال مناسبا للمساحة القصوى التي يمكن أن تنقش في إسقاط واحد بواسطة نظام النمط الدقيق هذا. هذا يسمح للمستخدم بتدوير النمط ليكون موجها بشكل صحيح مع الشبكة بغض النظر عن اتجاه الشبكة على المجهر. هنا ، تم تقسيم الشبكة إلى ست مناطق نمط. في المقام الأول ، يسمح هذا بتعديل التركيز البؤري بين مناطق مختلفة من الشبكة. شبكات الذهب ، على وجه الخصوص ، مرنة للغاية وقد لا تستلقي مسطحة تماما على الزجاج. التركيز السليم ضروري للحصول على نتائج نقش نظيفة ومكررة. باستخدام الأنماط المجزأة ، يجب إجراء تعديلات طفيفة فقط على موضع النمط إذا تحولت الشبكة قليلا أثناء عملية النقش ، على الرغم من أن هذه ليست مشكلة عادة عند استخدام هلام PLPP مع استنسل PDMS. وأخيرا ، ظلت مربعات الشبكة الأربعة المركزية للشبكة غير منقوشة. هذا يدعم المستخدم أن يكون قادرا على تحديد مركز الشبكة بوضوح ، وهو أمر مفيد جدا لتجارب التصوير المرتبط.
يحتوي برنامج النقش لنظام الأنماط الدقيقة هذا ، Leonardo ، أيضا على ميزات أكثر تقدما مثل الخياطة والقدرة على استيراد الأنماط كملفات PDF ، والتي تقع خارج نطاق هذا البروتوكول. يتضمن هذا البرنامج أيضا اكتشاف البنية المجهرية وتحديد المواقع التلقائي للنمط الذي يمكن استخدامه على شبكات TEM. تكون هذه الميزة مفيدة للغاية عندما تكون الشبكة مسطحة للغاية ويمكن نقشها دون الحاجة إلى ضبط التركيز البؤري بين المناطق المختلفة.
يمكن أن يكون لاختيار بروتين ECM تأثير كبير على التصاق الخلايا وتوسعها. من المعروف أن بعض الخلايا تخضع لتغيرات فسيولوجية عندما تنمو على ركائز محددة38. تم اختبار بروتينات وتركيزات ECM متعددة لأي نوع جديد من الخلايا بناء على العمل السابق المبلغ عنه في الأدبيات. يستخدم اللامينين والفيبرينوجين والفيبرونيكتين والكولاجين على نطاق واسع للخلايا المستزرعة ويمكن استخدامه كنقطة انطلاق إذا لم تكن البيانات الأخرى متوفرة. ومع ذلك ، يجب أيضا مراعاة بروتينات ECM الأخرى إذا فشلت بروتينات ECM شائعة الاستخدام في منح خصائص الالتزام المناسبة للخلايا. كان هذا صحيحا بشكل خاص بالنسبة للخلايا العصبية الأولية لذبابة الفاكهة ، حيث كان التركيز العالي لنبات اللكتين كونكانافالين A ضروريا للالتصاق الخلوي السليم. يمكن اختبار توافق الالتصاق الخلوي والنمو مع ECM عن طريق النقش على الأطباق الزجاجية أو الشرائح قبل الانتقال إلى شبكات TEM. هذا النهج قبل الفحص فعال من حيث الوقت والتكلفة إذا كان هناك حاجة إلى فحص عدد كبير من المجموعات. يعد تضمين بروتين ECM المترافق مع الفلورسنت أمرا قيما لتقييم نجاح وجودة النقش.
يعد بذر الخلايا أحد أهم الخطوات ل cryo-ET للخلية بأكملها ، سواء مع أو بدون نمط دقيق6,16,39. بالنسبة لذبابة الفاكهة الأولية أو الخلايا العصبية الأخرى ، التي تكون هشة وغير مستقرة في التعليق ، وقد تكون محدودة الكمية ، يتم تفضيل نهج البذر الفردي على بذر الخلايا المتتابعة الخاضعة للمراقبة. تعد خطوة البذر الواحدة بكثافة الخلايا المحسنة ، كما هو موضح في بروتوكول الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة ، خيارا قابلا للتطبيق لمعظم أنواع الخلايا. ومع ذلك ، من الممكن أيضا زرع الخلايا على الركيزة بتركيز أولي أقل وإضافة المزيد من الخلايا بطريقة مراقبة كما هو موضح هنا وفي أدبيات أخرى18. يمكن أن يوفر هذا البذر المتسلسل نتائج أكثر اتساقا في بعض الحالات. على غرار زراعة الخلايا القياسية ، يجب توخي الحذر دائما للحفاظ على صلاحية الخلية وتقليل تكتل الخلايا أثناء العزل.
عند البدء لأول مرة بالنمط المصغر ، هناك بعض المزالق المحتملة التي تضر بالنتيجة النهائية. من بين أهم الاعتبارات للنجاح التعامل الدقيق مع الشبكة والتقنية المعقمة ، والتوزيع الموحد لهلام PLPP ، والجرعة المناسبة والتركيز أثناء النقش ، والحفاظ على صلاحية الخلية قبل البذر. وجمعت في الجدول 1 قائمة ببعض المسائل والحلول المحتملة.
يمكن استخدام الشبكات ذات النمط الدقيق للمساعدة في وضع الخلايا لإنشاء كثافة خلايا متسقة عبر الشبكة ووضع المناطق ذات الأهمية في المناطق المناسبة لجمع سلسلة الإمالة16,18. يمكن استخدام موضع الخلايا وتحديد مواقعها كعلامات ائتمانية للارتباط في تجارب cryo-CLEM ، مما يقلل من الحاجة إلى شبكات البحث الهشة وعلامات الفلورسنت الائتمانية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هذه العلامات الائتمانية قد لا تزال مفيدة لارتباط دقة الميكرومتر الفرعي29,40. وعلاوة على ذلك، فإن التوزيع المتساوي للخلايا المعزولة مفيد للغاية أيضا لتجارب طحن الحزم الأيونية المركزة (cryo-FIB) لزيادة عدد الخلايا التي يمكن قطع الصفيحة منها16.
وستؤدي إضافة النمط المصغر إلى سير عمل cryo-EM إلى تحسينات قابلة للقياس في إنتاجية البيانات ومن المحتمل أن تمكن من إجراء تجارب جديدة. ومع اعتماد هذه التقنية وتطويرها بشكل أكبر، فإن التطبيقات الأكثر تقدما للمرضى المجهريين بما في ذلك تدرجات ECM، وترسبات ECM المتعددة، وتجميع البنية المجهرية ستزيد من توسيع قدرات cryo-ET لدراسة الأهداف والعمليات البيولوجية في السياق الخلوي الكامل.

مع تطور وتوسع وتنوع المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) ، فحص الباحثون مجموعة واسعة من العينات البيولوجية في حالة شبه أصلية من الجزيئات الكبيرة (~ 1 نانومتر) إلى دقة عالية (~ 2 Å). من الأفضل تطبيق تقنيات cryo-EM أحادية الجسيم وحيود الإلكترون على الجزيئات الكبيرة النقية في محلول أو في حالة بلورية ، على التوالي1,2. في حين أن التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryo-ET) مناسب بشكل فريد للدراسات الهيكلية وفوق الهيكلية شبه الأصلية للأجسام الكبيرة غير المتجانسة مثل البكتيريا والفيروسات متعددة الأشكال والخلايا حقيقية النواة3. في cryo-ET ، يتم الحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد (3D) عن طريق إمالة العينة فعليا على مرحلة المجهر والحصول على سلسلة من الصور من خلال العينة بزوايا مختلفة. غالبا ما تغطي هذه الصور، أو سلسلة الإمالة، نطاقا يتراوح بين +60/-60 درجة بزيادات من درجة إلى ثلاث درجات. يمكن بعد ذلك إعادة بناء سلسلة الإمالة حسابيا إلى حجم 3D ، المعروف أيضا باسم التصوير المقطعي 4.
تتطلب جميع تقنيات التبريد الكهرومغناطيسي أن تكون العينة مدمجة في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي غير المتبلور وغير البلوري. واحدة من تقنيات التثبيت بالتبريد الأكثر استخداما هي التجميد الغطس ، حيث يتم تطبيق العينة على شبكة EM ، وتلطخ ، وتغرق بسرعة في الإيثان السائل أو خليط من الإيثان السائل والبروبان. هذه التقنية كافية لتزجيج العينات من <100 نانومتر إلى ~ 10 ميكرومتر في السمك ، بما في ذلك الخلايا البشرية المستزرعة ، مثل خلايا HeLa5,6. يمكن تزجيج العينات الأكثر سمكا، مثل المواد العضوية الصغيرة أو خزعات الأنسجة، التي يصل سمكها إلى 200 ميكرومتر، عن طريق التجميد عالي الضغط7. ومع ذلك ، نظرا لزيادة تشتت الإلكترونات للعينات الأكثر سمكا ، تقتصر العينة وسماكة الجليد ل cryo-ET على ~ 0.5 - 1 ميكرومتر في المجاهر الإلكترونية الناقلة 300 كيلو فولت. لذلك ، يقتصر التبريد الكامل للخلايا ET للعديد من الخلايا حقيقية النواة على محيط الخلية أو امتدادات الخلايا ما لم يتم استخدام خطوات إضافية لإعداد العينة ، مثل التقسيم بالتبريد8 أو طحن الحزمة الأيونية المركزة9،10،11.
يتمثل أحد القيود المفروضة على العديد من تجارب التصوير بالتبريد ET للخلايا الكاملة في نقل البيانات12. على عكس الجسيم الواحد cryo-EM ، حيث يمكن في كثير من الأحيان تصوير الآلاف من الجسيمات المعزولة من مربع شبكة TEM واحد ، فإن الخلايا كبيرة ومنتشرة ، ويجب زراعتها بكثافة منخفضة بما يكفي للسماح بحفظ الخلايا في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي. غالبا ما تقتصر منطقة الاهتمام على ميزة معينة أو منطقة فرعية معينة من الخلية. ومما يحد من الإنتاجية أيضا ميل الخلايا إلى النمو في المناطق غير القابلة لتصوير TEM ، مثل قضبان شبكة TEM أو بالقرب منها. نظرا للعوامل غير المتوقعة المرتبطة بزراعة الخلايا على شبكات TEM ، هناك حاجة إلى تطورات تكنولوجية لتحسين إمكانية الوصول إلى العينات والإنتاجية للحصول على البيانات.
النمط الدقيق للركيزة مع بروتينات المصفوفة خارج الخلية الملتصقة (ECM) هي تقنية راسخة للفحص المجهري الضوئي للخلايا الحية لتوجيه نمو الخلايا على أسطح صلبة ومتينة وشفافة بصريا مثل الزجاج وركائز زراعة الأنسجة الأخرى13,14. كما تم إجراء النمط الدقيق على الأسطح الناعمة و / أو ثلاثية الأبعاد (3D). ولم تسمح هذه التقنيات بتحديد المواقع بدقة للخلايا فحسب؛ بل سمحت أيضا بتحديد المواقع بدقة. كما دعموا إنشاء شبكات متعددة الخلايا، مثل دوائر الخلايا العصبية المنقوشة15. لن يؤدي جلب الأنماط الدقيقة إلى cryo-ET إلى زيادة الإنتاجية فحسب ، بل يمكن أن يفتح أيضا دراسات جديدة لاستكشاف البيئات الدقيقة الخلوية المعقدة والديناميكية.
في الآونة الأخيرة ، بدأت العديد من المجموعات في استخدام تقنيات النمط المصغر على شبكات TEM من خلال نهج متعددة16,17. هنا ، يتم وصف استخدام تقنية النمط الضوئي بدون قناع لشبكات TEM باستخدام نظام Alvéole PRIMO micropatterning ، والذي يتميز بنقوش عالية الدقة وبدون تلامس. باستخدام نظام الأنماط الدقيقة هذا ، يتم تطبيق طبقة مضادة للقاذورات في الجزء العلوي من الركيزة ، تليها تطبيق محفز ضوئي واستئصال الطبقة المضادة للقاذورات في أنماط يحددها المستخدم باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية. يمكن بعد ذلك إضافة بروتينات ECM إلى أنماط زراعة الخلايا المناسبة. تم استخدام هذه الطريقة من قبل عدة مجموعات لدراسات cryo-ET لصبغة الشبكية الظهارية -1 (RPE1) ، والكلى الكلبية Madin-Darby -II (MDCKII) ، والخلايا الليفية القلفة البشرية (HFF) ، وخطوط الخلايا البطانية16،17،18. يتوافق نظام الأنماط الدقيقة هذا مع ركائز طبقة متعددة مضادة للقاذورات بالإضافة إلى كاشف محفز ضوئي سائل أو هلامي. يمكن اختيار مجموعة متنوعة من بروتينات ECM وتكييفها لخصوصية خط الخلية ، مما يمنح براعة للمستخدم.
وقد تم تطبيق النمط المصغر بنجاح على عدد من المشاريع داخل المختبر19. هنا ، يتم تقديم بروتوكول للنمط الدقيق ، بما في ذلك تعديلات محددة لدراسة خلايا HeLa المستزرعة ، وخلايا BEAS-2B المصابة بالفيروس المخلوي التنفسي (RSV) ، والخلايا العصبية اليرقية الأولية Drosophila melanogaster 20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون كامل الخلية (cryo-ET) هو تقنية قوية تستخدم لإنتاج هياكل دقة على مستوى النانومتر للجزيئات الكبيرة الموجودة في السياق الخلوي والمحفوظة في حالة رطبة مجمدة شبه أصلية. ومع ذلك ، هناك تحديات مرتبطة بزراعة و / أو التمسك بالخلايا على شبكات TEM بطريقة مناسبة للتصوير المقطعي مع الاحتفاظ بالخلايا في حالتها الفسيولوجية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة حول استخدام النمط الدقيق لتوجيه وتعزيز نمو الخلايا حقيقية النواة على شبكات TEM. أثناء النمط الدقيق ، يتم توجيه نمو الخلايا عن طريق إيداع بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ضمن أنماط ومواضع محددة على رقائق شبكة TEM بينما تظل المناطق الأخرى مغلفة بطبقة مضادة للقاذورات. المرونة في اختيار طلاء السطح وتصميم النمط تجعل النمط الدقيق قابلا للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا. يعد النمط الدقيق مفيدا لدراسات الهياكل داخل الخلايا الفردية بالإضافة إلى الأنظمة التجريبية الأكثر تعقيدا مثل التفاعلات بين المضيف والممرض أو المجتمعات متعددة الخلايا المتباينة. يمكن أيضا دمج النمط الدقيق في العديد من مهام سير عمل Cryo-ET للخلايا الكاملة في المصب ، بما في ذلك المجهر الضوئي والإلكتروني المرتبط (cryo-CLEM) وطحن الحزمة الأيونية المركزة (cryo-FIB).

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

الهدف من هذا البروتوكول هو توجيه التصاق الخلايا ونموها إلى المناطق المستهدفة من الشبكات للفحص المجهري الإلكتروني المبرد. ويتحقق ذلك من خلال تطبيق طبقة مضادة للقاذورات يتم استئصالها في أنماط محددة من قبل المستخدم متبوعة بترسب بروتينات المصفوفة خارج الخلية في المناطق المنقوشة قبل بذر الخلايا.

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

يقوم فريق البحث لدينا بتطوير تقنيات وبروتوكولات للمجهر الإلكتروني المبرد والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. لقد طورنا بروتوكولات لشبكات TEM ذات النمط الدقيق لتوجيه نمو الخلايا وتحديد المواقع لتجارب cryo-ET. يستخدم التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون كامل الخلية لإنتاج هياكل دقة على مستوى النانومتر للمجمعات الجزيئية الكبيرة داخل الخلايا المحفوظة في حالة رطبة مجمدة أصلية.يمكن أن يزيد النمط الدقيق من إنتاجية CRYO-ET للخلية الكاملة ، والمجهر الإلكتروني الخفيف المرتبط بالتبريد ، وتجارب طحن الحزمة الأيونية التي تركز على التبريد. يعد عدد الخلايا وتوزيعها على شبكات EM أمرا بالغ الأهمية لدراسات cryo-ET كاملة الخلايا. يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وقابلة للتكرار وقابلة للتكيف على نطاق واسع لتوجيه نمو الخلايا على شبكات EM من خلال النمط المصغر.يجب أن يكون الباحث مرتاحا لاستخدام الماصات والملاقط وتقنيات زراعة الخلايا الأساسية والمجاهر الإلكترونية الفلورية والإرسال. عند النقش لأول مرة ، استخدم مجموعة معروفة من الخلايا و ECM واختبرها على أغطية أو أطباق MatTek. أعضاء فريق البحث المشاركين في تطوير هذا البروتوكول هم: الدكتور.براين سيبرت والسيد جوزيف كيم والدكتور جاي يانغ. للبدء ، انقل الشبكات إلى حامل إعداد الشبكة وقم بتفريغ جانب الكربون للشبكات لأعلى. بعد ذلك ، انقل الشبكات ذات الجانب الكربوني إلى شريحة زجاجية نظيفة أو غطاء مع فصل سنتيمتر واحد على الأقل بين الشبكات.ماصة 10 ميكرولترات من 0.05 بولي L-ليسين على كل شبكة واحتضان الشبكات في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد الحضانة ، اغسل كل شبكة ثلاث مرات ب 15 ميكرولتر من 0.1 HEPES مولي عند درجة الحموضة 8.5. احتضن الشبكة في كل غسلة لمدة 30 ثانية ، ثم قم بإزالة معظم السائل من الشبكة باستخدام ماصة دون ترك الشبكة تجف.بعد الغسيل النهائي ، اترك كل شبكة في 15 ميكرولتر من 0.1 HEPES المولي. بعد ذلك ، قم بإعداد حل PEG-SVA واستبدل على الفور حل HEPES على الشبكات ب 10 ميكرولترات من محلول PEG-SVA ، ثم احتضن الشبكات في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الحضانة ، اغسل كل شبكة ثلاث مرات ب 15 ميكرولتر من الماء المعقم ، مع احتضان الشبكة في كل غسلة لمدة 30 ثانية.بعد الغسيل النهائي ، اترك كل شبكة في 15 ميكرولتر من الماء. ضع قطرة ماء ميكرولتر واحدة في وسط غطاء نظيف جديد ، ثم انقل الشبكة بعناية من قطرة الماء 15 ميكرولتر إلى القطرة الموجودة على الغطاء الجديد مع جانب الكربون لأعلى. بعد ذلك ، ضع استنسل PDMS بعناية فوق الشبكة مع الحفاظ على تمركز الشبكة وتقليل ملامسة الاستنسل لرقائق الكربون في الشبكة.ثم أضف ميكرولتر واحد من جل PLPP على الشبكة وماصة بلطف للخلط. حرك زلة الغطاء مع الشبكة إلى مكان مظلم لتجف. سوف يجف الجل في غضون 15 إلى 30 دقيقة.بالنسبة للأنماط الدقيقة ، افتح البرنامج من خلال عرض برايتفيلد المباشر من المجهر. لتصميم قالب جديد لتشغيل أولي، حدد إضافة عائد استثمار واختر دائرة 3000 ميكرومتر. ضع عائد استثمار الدائرة فوق الشبكة باستخدام صورة Brightfield على الشاشة كدليل، ثم اضغط على Lock لتأمين عائد الاستثمار.بعد تأمين عائد الاستثمار في مكانه، حدد إضافة نمط واختر النمط المناسب. باستخدام خيارات النسخ المتماثل، قم بإنشاء نسخ من النمط الأولي لإنشاء منطقة مربعة شبكة ثمانية في ثمانية. اضبط التباعد والزاوية حسب الضرورة لمحاذاة الأنماط مع مربعات الشبكة.ضع النمط في زاوية واحدة من الشبكة. بعد ذلك ، كرر النمط وضع نسخة في كل زاوية من الزوايا الأربع للشبكة التي تحرك مرحلة المجهر حسب الضرورة لكل منطقة. استخدم خيارات النسخ المتماثل لتعديل منطقة مربعة شبكة ثمانية في ثمانية إلى منطقة مربعة شبكة اثنين في ثمانية ليتم وضعها على جانبي المركز.اترك مربعات الشبكة الأربعة المركزية دون نمط. لكل نمط ، اضبط الجرعة الإجمالية إذا لزم الأمر. 30 ملليجول لكل ملليمتر مربع هي نقطة انطلاق جيدة.ضمن خيارات الخبراء، كرر ضبط زاوية النمط وموضعه والمسافة بينه ونسبته لتحسين محاذاة النمط مع مربعات الشبكة. حرك مرحلة المجهر لتغيير منطقة الشبكة في شاشة Brightfield. بمجرد وضع القالب والأنماط ، قم بإلغاء تحديد جميع المناطق باستثناء منطقة واحدة في لوحة العمل الخاصة بالبرنامج.استخدم مرحلة المجهر للانتقال إلى تلك المنطقة والتركيز على رقائق الكربون. انقر على أيقونة مقلة العين في لوحة الحركة لتبديل شاشة تراكب الحشو. بمجرد أن تصبح الشبكة في بؤرة التركيز ، أغلق مصراع Brightfield واضغط على أيقونة Play في الزاوية اليمنى السفلى من البرنامج لبدء عملية النقش ، والتي يمكن مراقبتها مباشرة.كرر هذه الخطوة حتى يتم نقش كافة المناطق. أخيرا ، قم بإزالة الغطاء مع الشبكة من المجهر وأضف على الفور 10 ميكرولترات من PBS المعقمة إلى الشبكة. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة الاستنسل باستخدام ملاقط ، ثم اغسل الشبكة ثلاث مرات باستخدام 15 ميكرولتر من PBS واترك كل شبكة في PBS في مكان مظلم.قم بإعداد 15 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية لكل شبكة ، ثم استبدل PBS من كل شبكة ب 15 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية واحتضن الشبكة في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الحضانة ، اغسل كل شبكة خمس مرات ب 15 ميكرولتر من PBS المعقم كما هو موضح سابقا. بعد الغسيل النهائي ، اترك كل شبكة في PBS.باستخدام المجهر الفلوري ، اكتشف الفلوروفور في المصفوفة خارج الخلية لتأكيد النقش وأن رقائق الكربون لا تزال سليمة. خلايا HeLa المزروعة على شبكات TEM ذات النمط الدقيق وغير المتناثر مرئية عن طريق تلطيخ الفلورسنت باستخدام فحص صلاحية الخلايا القائمة على calcein AM و ethidium homodimer-1. باستخدام مصفوفة مختلطة من الكولاجين والفيبرينوجين خارج الخلية ، تلتصق خلايا HeLa بسهولة بالأنماط عبر الشبكة.التشكل العام للخلايا التي توسعت على طول النمط يشبه مورفولوجيا الخلايا المزروعة على شبكات غير متناثرة. تظهر صورة برايتفيلد لخلايا BEAS-2B المصابة بفيروس RSV بعد 18 ساعة من البذر التصاق الخلايا ونموها على طول المنطقة الوسطى من النمط. يتم وضع معظم الخلايا المصابة على طول المنطقة الوسطى ذات الكثافة العالية من نمط التدرج.تقع متغيرات RSV بالقرب من محيط خلايا BEAS-2B المصابة المزروعة على شبكات ذات أنماط دقيقة. يتم تحديد العديد من البروتينات الهيكلية RSV داخل التصوير المقطعي ، بما في ذلك nucleocapsid وبروتين الاندماج الفيروسي. على الشبكات ذات الأنماط الدقيقة ، يمكن تتبع الخلايا العصبية لذبابة الفاكهة ذات تعبير GFP العصبي الشامل بسهولة عن طريق المجهر الضوئي بسبب وضع العلامات الفلورية وموقعها داخل الأنماط الدقيقة.يمكن أيضا تتبع الخلايا العصبية على الشبكات غير المتناثرة من خلال إشارات GFP بواسطة المجهر الضوئي. ومع ذلك ، يصبح تحديد موقعها في المجهر الإلكتروني المبرد أمرا صعبا بسبب الحطام الخلوي والتلوث من الوسائط. نظرا لأبعاد جسم الخلية العصبية والعصبيات الممتدة ، يتم جمع سلسلة إمالة التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون على طول المناطق الأرق من الخلايا ذات التكبير العالي.يتم حل غشاء الخلية العصبية ، الميتوكوندريا ، الأنابيب الدقيقة ، خيوط الأكتين ، الهياكل الحويصلية ، والجزيئات الكبيرة مثل الريبوسومات بشكل جيد في مونتاج صور التكبير العالي والشرائح من خلال التصوير المقطعي 3D. لوحظت ميزات تحت خلوية مماثلة من التصوير المقطعي 3D للخلايا العصبية غير المتناثرة. يعد تطبيق الاستنسل على الشبكة وإضافته على هلام PLPP الخطوة الأكثر حساسية التي يمكن أن تؤثر على نتائج النقش ويجب القيام بها بحذر.يمكن استخدام Cryo-CLEM لتوطين الأهداف ذات الأهمية داخل الخلايا لجمع بيانات cryo-ET. يمكن استخدام Cryo-FIB-SEM لترقق الخلايا في المناطق السميكة جدا لجمع البيانات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

إعداد و Cryo-FIB micromachining من Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي كريو إلكترون

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

تحضير جسيمات النواة النيوكليوسوم المعقدة مع عوامل إصلاح الحمض النووي للتحديد الهيكلي للمجهر الإلكتروني بالتبريد

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

استخراج الأنابيب الدقيقة المعدلة من خلايا الثدييات لدراسة معقدات بروتين الأنابيب الدقيقة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

تحضير العينة للتصوير بالتبريد في الموقع لخلايا الثدييات

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...