Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

我们感谢威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系的Jill Wildonger博士，Sihui Z. Yang博士和Josephine W. Mitchell夫人慷慨地分享了elav-Gal4，UAS-CD8：：GFP苍蝇菌株（布卢明顿股票中心，#5146）。我们还要感谢Alvéole的Aurélien Duboin博士，Laurent Siquier先生和Marie-Charlotte Manus女士以及Nanoscale Labs的Serge Kaddoura先生在该项目期间的慷慨支持。这项工作得到了威斯康星大学麦迪逊分校，威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系的部分支持，以及公共卫生服务拨款R01 GM114561，R01 GM104540，R01 GM104540-03W1和U24 GM139168到E.R.W.和R01 AI150475到P.W.S.从NIH。这项研究的一部分得到了NIH拨款U24 GM129547的支持，并在OHSU的PNCC进行，并通过EMSL（grid.436923.9）访问，EMSL是由生物和环境研究办公室赞助的DOE科学用户设施办公室。我们也感谢威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系冷冻电镜研究中心的设施和仪器的使用。

<ol>
	<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM:+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity.">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+electron+crystallography+of+2D+crystals+to+MicroED+of+3D+crystals.">From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals.</a> Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-the+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>B&#228;uerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+native+Drosophila+tissues+vitrified+by+plunge+freezing.">Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing.</a> bioRxiv. , 437159 (2021).</li><li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells.">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).</li><li>Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+Electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).</li><li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> Elife. 8, 45919 (2019).</li><li>Wu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+neuronal+networks.">Micropatterning neuronal networks.</a> Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+micropatterning+technology+for+whole+cell+cryogenic+electron+microscopy+studies.">Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+micropatterning+for+cryo-electron+tomography+studies+of+cell-cell+contacts.">Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts.</a> bioRxiv. , 272237 (2021).</li><li>Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+cryo-electron+tomography+of+cultured+and+primary+eukaryotic+cells+on+micropatterned+TEM+grids.">Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids.</a> bioRxiv. , 447251 (2021).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons.">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+assembly+of+respiratory+syncytial+virus+revealed+by+cryo-electron+tomography.">The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography.</a> Viruses. 10 (8), (2018).</li><li>Stobart, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+RSV+vaccine+with+engineered+thermostability+is+immunogenic+in+cotton+rats+despite+high+attenuation.">A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation.</a> Nature Communications. 7, 13916 (2016).</li><li>Hotard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stabilized+respiratory+syncytial+virus+reverse+genetics+system+amenable+to+recombination-mediated+mutagenesis.">A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis.</a> Virology. 434 (1), 129-136 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+virus+assembly+and+organization+by+the+measles+virus+matrix+protein.">Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein.</a> Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).</li><li>Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+situ+neuronal+model+for+cryo-ET.">A new in situ neuronal model for cryo-ET.</a> Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition.">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+method+for+cryo-electron+tomography:+Characterizing+stage+behavior+during+FISE+acquisition.">Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).</li><li>Anderson, D. E., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+micropatterning:+methods,+effects,+and+applications.">Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications.</a> Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+components+for+cell+culture.">Use of extracellular matrix components for cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).</li><li>Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy.">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).</li><li>Schellenberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+correlative+fluorescence+and+electron+cryo+microscopy+using+two+independent+alignment+markers.">High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers.</a> Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

现代、先进的电子显微镜和软件包现在支持简化的自动冷冻电镜和冷冻电子断层扫描数据收集，可在几天内对数百至数千个位置进行定位和成像32，33，34，35。全细胞冷冻 ET 工作流程的一个重要限制因素是每个网格获得足够数量的可收集靶标。最近，许多小组已经开发了用于冷冻电镜的微图案网格的方案，其中一个优点是提高了数据收集效率16，17，18。这里提出了一种方案，用于使用市售的微图案系统到微模式TEM网格，用于原发 性果蝇 神经元和培养的人类细胞系（未感染或RSV感染）的冷冻ET研究。这种微图案系统用途广泛，许多步骤可以优化和定制，以适应特定的实验目标。具有TEM和荧光显微镜经验的用户可以快速掌握网格准备和微图案化。通过仔细练习，经过几次迭代后应该可以获得良好的结果。下面讨论了一些可用的选项，用户考虑因素，潜在好处以及微图案化在冷冻电镜中的未来应用。
全细胞冷冻电子断层扫描的重要考虑因素之一是EM网格选择。EM网格由两部分组成：网格框架（或结构支撑）和箔（或薄膜），这是细胞将在其上生长的连续或多孔薄膜表面。铜网网格通常用于蛋白质和分离复合物的冷冻电镜。然而，由于铜的细胞毒性，它们不适合全细胞冷冻电子检测。相反，金网通常用于细胞断层扫描。其他选择包括镍或钛，它们可能比黄金更有利，例如增加刚度16。EM 网格具有不同的网格尺寸，以支持各种应用。较大的网格尺寸为细胞在网格条和更多适合倾斜系列收集的区域之间生长提供了更大的空间，但代价是增加了整体试样脆性。最常用的箔是穿孔或多孔无定形碳，如量子硅或C-flat网格。生物靶标可以通过碳中的空穴或通过电子半透明碳成像。诸如 R 2/1 或 R 2/2 之类的网格，其中孔宽为 2 μm，间隔分别为 1 和 2 μm，提供大量孔，从而为数据收集提供大量潜在区域。然而，一些细胞可能会在更均匀的表面上更好地生长和膨胀，例如R 1.2 / 20网格或连续碳。对于通过聚焦离子束研磨（cryo-FIB）进行的下游样品处理，通过研磨去除箔片，从而减少了对底层薄膜持续存在的担忧。与网格一样，也可以使用来自其他材料的箔片，此处介绍的图案化方案同样适用于SiO2 网格。常用的网格包括用于全细胞冷冻-ET的金Quantifoil，连续碳或SiO2 薄膜200目网格（网格条之间的间距约为90μm）。
设计模式时有许多注意事项。这些决定中的大多数都是由实验的细胞类型和目的指导的。一个好的起点是选择一种接近培养物中细胞形状和尺寸的模式。许多研究表明，图案形状对细胞生长和细胞骨架排列有显著影响13，36，37。在图案设计过程中应特别注意，如果这可能会改变感兴趣的目标。测试每种细胞类型的几种模式，以确定哪些模式促进细胞粘附和生长。微图案系统的灵活性允许在单个网格上测试多个模式，并在单个实验中更改不同网格的模式。较大的图案（〜50-90μm），例如这里使用的图案，增加了多个细胞粘附在图案的单个区域的可能性，并允许细胞在粘附后膨胀和延伸。更受约束的模式（20-30μm）可能适用于细胞分离比细胞扩增更关键的实验，例如聚焦离子束铣削（cryo-FIB）实验。对于层析成像应用，可能需要考虑倾斜轴的影响。如果将图案定位为所有细胞在单个方向上平行生长，则当加载到显微镜载物台上时，所有细胞都可能垂直于倾斜轴，从而导致数据质量降低。
在无图案网格上，单元通常优先粘附在网格条上，在那里它们不能通过TEM成像。即使在图案网格上，也经常观察到细胞位于网格正方形的角落，部分位于图案碳箔和网格条上。最近，微图案化被用来故意将部分单元放置在网格条18上。这可以考虑用于将整个细胞外围放在箔上并不重要的实验。这对于可以生长大于单个网格正方形的细胞尤其重要，例如在多天内生长的原代神经元。
有许多工具可用于设计模式。在这里，图案在任何维度上都限制在小于800像素，以便图案可以旋转到任何角度，并且仍然适合该微图案系统可以在单个投影中图案化的最大区域内。这允许用户旋转图案以与网格正确定向，而不管显微镜上网格的方向如何。在这里，网格被分为六个图案区域。首先，这允许在网格的不同区域之间调整焦点。特别是金网格，具有很强的延展性，可能不会完全平放在玻璃上。正确对焦对于干净、精致的图案效果至关重要。通过使用分段图案，如果网格在图案化过程中略有变化，则只需对图案位置进行微小的调整，尽管在将PLPP凝胶与PDMS模板一起使用时，这通常不是问题。最后，网格的中央四个网格正方形保持不变。这支持用户能够清楚地识别网格的中心，这对于相关成像实验非常有用。
该微图案系统的图案化软件Leonardo还具有更高级的功能，例如拼接以及将图案作为PDF导入的能力，这超出了该协议的范围。该软件还包括可用于TEM网格的微观结构检测和自动图案定位。当网格非常平坦并且无需在不同区域之间调整焦点即可进行图案化时，此功能最有用。
选择ECM蛋白可以对细胞粘附和扩增产生重大影响。已知一些细胞在特定底物上生长时会发生生理变化38。根据文献中报道的先前工作，对任何新细胞类型测试了多种ECM蛋白和浓度。层粘连蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白和胶原广泛用于培养细胞，如果没有其他数据，可以用作起点。然而，如果常用的ECM蛋白不能为细胞赋予适当的粘附特性，也必须考虑其他ECM蛋白。对于原发 果蝇 神经元尤其如此，因为高浓度的植物凝集素康纳瓦林A对于适当的细胞粘附是必要的。细胞粘附和生长与ECM的兼容性可以通过在过渡到TEM网格之前在玻璃盘或载玻片上进行图案化来测试。如果需要检查大量组合，这种预筛选方法具有时间和成本效益。包含荧光偶联的ECM蛋白对于评估图案化的成功和质量很有价值。
细胞接种是全细胞冷冻ET最重要的步骤之一，无论是否使用微模式6，16，39。对于原发 性果蝇 或其他神经元，它们脆弱，悬浮液不稳定，并且数量可能有限，单一播种方法优于监测的顺序细胞接种。正如 果蝇 神经元方案中所述，在优化的细胞密度下进行单个接种步骤是大多数细胞类型的可行选择。然而，也可以将细胞以较低的初始浓度接种到底物上，并以监测的方式添加更多细胞，如本文和其他文献中所述18。在某些情况下，这种顺序播种可以提供更一致的结果。与标准细胞培养类似，应始终注意保持细胞活力并尽量减少分离过程中的细胞聚集。
当第一次从微模式开始时，有一些潜在的陷阱对最终结果有害。仔细的网格处理和无菌技术，PLPP凝胶的均匀分布，图案化过程中的适当剂量和焦点，以及在接种前维持细胞活力是成功的最重要考虑因素。表1列出了一些潜在问题和解决方案。
微图案网格可用于帮助定位像元，以在整个格网中建立一致的像元密度，并将感兴趣的区域定位在适合倾斜系列收集的区域16，18。细胞的放置和定位可用作冷冻-CLEM实验中相关性的基准标记，从而减少了对脆弱的发现网格和荧光基准标记物的需求。但是，应该注意的是，这种基准标记对于亚微米级精度相关性可能仍然有用29，40。此外，分离细胞的均匀分布也非常有利于聚焦离子束铣削（cryo-FIB）实验，以最大限度地增加可以从中切割薄片的细胞数量16。
在冷冻电镜工作流程中添加微图案化将带来数据通量的可衡量改进，并可能实现新的实验。随着该技术的进一步采用和发展，更先进的微图案应用，包括ECM梯度，多个ECM沉积和微观结构组装，将进一步扩展冷冻ET在全细胞环境中研究生物靶标和过程的能力。

随着冷冻电子显微镜（cryo-EM）的发展，扩展和多功能性，研究人员已经检查了从大分子（〜1nm）到高（〜2 Å）分辨率的近乎天然状态的各种生物样品。单颗粒冷冻电镜和电子衍射技术分别应用于溶液或结晶状态下的纯化大分子1，2。而冷冻电子断层扫描 （cryo-ET） 特别适用于大型异源物体（如细菌、多态病毒和真核细胞）的近天然结构和超微结构研究3。在冷冻电子断层扫描中，通过物理倾斜显微镜载物台上的样品并以不同角度通过样品获取一系列图像来获得三维（3D）信息。这些图像或倾斜系列通常以 1 到 3 度的增量覆盖 +60/-60 度的范围。然后，倾斜序列可以通过计算重建为3D体积，也称为断层扫描图4。
所有冷冻电镜技术都要求将样品嵌入一层薄薄的无定形、非结晶玻璃体冰中。最常用的冷冻固定技术之一是浸入式冷冻，其中将样品施加到EM网格上，转印并迅速浸入液体乙烷或液体乙烷和丙烷的混合物中。该技术足以对厚度为<100nm至~10μm的样品进行玻璃化，包括培养的人细胞，如HeLa细胞5，6。厚度达 200 μm 的较厚样品，如微型类器官或组织活检，可通过高压冷冻进行玻璃化7。然而，由于较厚样品的电子散射增加，在300 kV透射电子显微镜中，冷冻ET的样品和冰厚度限制为~0.5 - 1μm。因此，许多真核细胞的全细胞冷冻ET仅限于细胞的外围或细胞的延伸，除非使用额外的样品制备步骤，例如冷冻切片8 或聚焦离子束研磨9，10，11。
许多全细胞冷冻 ET 成像实验的局限性是数据收集通量12。与单颗粒冷冻电镜不同，在单颗粒冷冻电镜中，通常可以从单个TEM网格正方形成像数千个孤立的颗粒，细胞很大，分散，并且必须以足够低的密度生长，以使细胞保存在薄薄的玻璃体冰层中。通常，感兴趣的区域仅限于单元的特定特征或子区域。进一步限制通量的是细胞倾向于生长在不适合TEM成像的区域，例如TEM网格条上或附近。由于TEM网格上的细胞培养具有不可预测性，因此需要技术发展来改善样品的可访问性和数据采集的通量。
使用贴壁细胞外基质（ECM）蛋白进行底物微图案化是一种成熟的活细胞光学显微镜技术，用于指导细胞在刚性，耐用和光学透明的表面上的生长，例如玻璃和其他组织培养底物13，14。在柔软和/或三维（3D）表面上也进行了微图案化。这种技术不仅允许细胞的精确定位;他们还支持多细胞网络的创建，例如模式化神经细胞回路15。将微图案引入冷冻ET不仅可以提高通量，还可以为探索复杂和动态的细胞微环境开辟新的研究。
最近，一些小组已经开始通过多种方法在TEM网格上使用微图案化技术16，17。在这里，使用Alvéole PRIMO微图案系统描述了TEM网格的无掩模光图案技术的使用，该系统具有高分辨率和非接触式图案化。使用这种微图案系统，在基板顶部施加防污层，然后应用光催化剂并用紫外激光在用户定义的图案中烧蚀防污层。然后可以将ECM蛋白添加到模式中以进行适当的细胞培养。该方法已被几个小组用于视网膜色素上皮-1（RPE1），Madin-Darby犬肾-II（MDCKII），人包皮成纤维细胞（HFF）和内皮细胞系的冷冻ET研究16，17，18。该微图案系统与多种防污层基板以及液体或凝胶光催化剂试剂兼容。可以从细胞系的特异性中选择并适应各种ECM蛋白，从而为用户提供多功能性。
微图案化已成功应用于实验室内的多个项目19。本文提出了一种微模式方案，包括研究培养的HeLa细胞，呼吸道合胞病毒（RSV）感染的BEAS-2B细胞和原代幼虫 果蝇黑色素加星 神经元的特定适应性20。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

全细胞冷冻电子断层扫描（cryo-ET）是一种强大的技术，用于产生存在于细胞环境中的大分子的纳米级分辨率结构，并以近乎天然的冷冻水合状态保存。然而，以适合断层扫描的方式培养和/或粘附细胞到TEM网格上，同时保持细胞处于生理状态也存在挑战。在这里，提出了一个关于使用微图案化来指导和促进TEM网格上真核细胞生长的详细分步方案。在微模式化过程中，细胞生长是通过在TEM网格的箔片上的指定模式和位置内沉积细胞外基质（ECM）蛋白来指导的，而其他区域仍然涂有防污层。表面涂层和图案设计的灵活性使微图案广泛适用于各种电池类型。微模式化可用于研究单个细胞内的结构以及更复杂的实验系统，例如宿主 - 病原体相互作用或分化的多细胞群落。微图案化也可以集成到许多下游的全细胞冷冻电子显微镜工作流程中，包括相关光和电子显微镜（cryo-CLEM）和聚焦离子束铣削（cryo-FIB）。

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

该协议的目标是将细胞粘附和生长引导到冷冻电子显微镜的网格目标区域。这是通过应用抗污垢层来实现的，该抗污垢层以用户指定的模式消融，然后在细胞接种之前在图案化区域沉积细胞外基质蛋白。

微图案透射电子显微镜网格，用于在全细胞冷冻电子断层扫描工作流程中指导细胞定位

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

我们的研究团队开发冷冻电子显微镜和冷冻电子断层扫描的技术和方案。我们已经开发了用于微图案TEM网格的方案，以指导冷冻ET实验的细胞生长和定位。全细胞冷冻电子断层扫描用于在天然冷冻水合状态下保存的细胞内产生纳米级大分子复合物的分辨率结构。微图案化可以提高全细胞冷冻电子显微镜、冷冻相关光电子显微镜和冷冻聚焦离子束研磨实验的通量。EM网格上细胞的数量和分布对于全细胞冷冻ET研究至关重要。该协议提供了一种快速，可重复且适应性广泛的方法，可通过微图案化引导EM网格上的细胞生长。研究者应能够舒适地使用移液器、镊子、基本细胞培养技术以及荧光和透射电子显微镜。首次进行图案化时，请使用众所周知的细胞类型和 ECM 组合，并在盖玻片或 MatTek 培养皿上进行测试。参与该协议开发的研究团队成员是：博士。Brian Sibert，Joseph Kim先生和Jae Yang博士。首先，将网格转移到网格准备支架上，然后发光将网格的碳面向上排放。接下来，将碳侧的网格转移到干净的载玻片或盖玻片上，网格之间至少相隔一厘米。将10微升0.05聚-L-赖氨酸移液到每个网格上，并将网格在潮湿的腔室中孵育至少30分钟。孵育后，用15微升0.1摩尔HEPES在pH 8.5下洗涤每个网格三次。在每次洗涤中孵育网格30秒，然后用移液器从网格中取出大部分液体，而不让网格干燥。最终洗涤后，将每个网格留在15微升0.1摩尔HEPES中。接下来，准备PEG-SVA溶液，并立即用10微升PEG-SVA溶液替换网格上的HEPES溶液，然后将网格在潮湿的室内孵育至少一小时。孵育后，用15微升无菌水洗涤每个网格三次，在每次洗涤中孵育网格30秒。最后洗完后，将每个网格留在15微升水中。将一微升水滴放在新的干净盖玻片的中心，然后小心地将网格从15微升的水滴转移到新盖玻片上的水滴上，碳侧朝上。接下来，小心地将PDMS钢网放置在网格上方，保持网格居中，并尽量减少钢网与网格碳箔的接触。然后将一微升PLPP凝胶加入网格中，轻轻移液以混合。将带有网格的盖玻片移动到黑暗位置以干燥。凝胶将在15到30分钟内干燥。对于微图案，请从显微镜打开带有实时明场视图的软件。要为初始运行设计新模板，请选择"添加 ROI"，然后选择一个 3， 000 微米圆圈。使用屏幕上的明场图像作为指导，将圆圈 ROI 放置在网格上，然后按"锁定"以确保 ROI。将 ROI 锁定到位后，选择"添加图案"并选择适当的图案。使用复制选项，生成初始模式的副本以创建八乘八的网格正方形区域。根据需要调整间距和角度，使图案与网格正方形对齐。将图案定位在网格的一角。接下来，复制图案，并根据需要在每个区域移动显微镜载物台的网格的四个角中放置一个副本。使用复制选项将八乘八的网格正方形区域修改为要放置在中心两侧的二乘八网格正方形区域。将中心的四个网格正方形保持无图案。对于每种模式，如有必要，调整总剂量。每平方毫米30毫焦耳是一个很好的起点。在"专家选项"下，迭代调整模式的角度、位置、间距和比率，以优化模式与网格正方形的对齐方式。移动显微镜载物台以更改明场显示屏中的网格区域。定位模板和模式后，在软件的操作面板中取消选中除一个区域之外的所有区域。使用显微镜载物台导航到该区域并聚焦在碳箔上。单击操作面板中的眼球图标以关闭图案叠加显示。网格对焦后，关闭明场快门，然后按软件右下角的"播放"图标开始图案化过程，可以实时监控。重复此步骤，直到所有区域都已阵列化。最后，从显微镜中取出带有网格的盖玻片，并立即将10微升无菌PBS添加到网格上。10分钟后，用镊子取下模板，然后用15微升PBS洗涤网格三次，并将PBS中的每个网格留在黑暗的位置。为每个网格准备15微升的细胞外基质，然后用15微升的细胞外基质替换每个网格中的PBS，并将网格在潮湿的腔室中孵育至少一小时。孵育后，如前所述，用15微升无菌PBS洗涤每个网格五次。最后一次洗涤后，将每个网格留在PBS中。使用荧光显微镜检测细胞外基质中的荧光团以确认图案化以及碳箔保持完整。接种在微图案和无图案TEM网格上的HeLa细胞通过使用基于钙黄素AM和乙锭同源二聚体-1的细胞活力测定的荧光染色可见。使用混合的胶原蛋白和纤维蛋白原细胞外基质，HeLa细胞很容易粘附在整个网格中的模式。沿着模式扩展的细胞的整体形态与在无图案网格上生长的细胞相似。接种后18小时RSV感染的BEAS-2B细胞的明场图像显示细胞沿模式的中心区域粘附和生长。大多数受感染的细胞位于梯度模式的高密度中心区域。RSV变体位于微图案网格上生长的受感染BEAS-2B细胞的外围附近。许多RSV结构蛋白在断层扫描中鉴定出来，包括核衣壳和病毒融合蛋白。在微图案网格上，由于荧光标记及其在微模式中的位置，具有泛神经元GFP表达的果蝇神经元可以很容易地通过光学显微镜跟踪。未图案网格上的神经元也可以通过光显微镜通过GFP信号跟踪。然而，由于细胞碎片和介质污染，在冷冻电子显微镜下定位它们变得困难。由于神经元细胞体的尺寸和扩展的神经突起，冷冻电子断层扫描倾斜系列沿着具有较高放大倍率的细胞较薄区域收集。神经元细胞膜、线粒体、微管、肌动蛋白丝、囊泡结构和大分子（如核糖体）在更高倍率的图像蒙太奇和切片中通过3D断层扫描得到很好的分辨。从无模式神经元的3D断层扫描中观察到类似的亚细胞特征。将模板涂布到网格上并添加PLPP凝胶是影响图案化结果的最敏感步骤，应谨慎进行。Cryo-CLEM可用于定位细胞内感兴趣的靶标，以进行冷冻ET数据收集。Cryo-FIB-SEM可用于在太厚而无法收集数据的区域上稀释细胞。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

快速网格准备时间解决低温电子显微镜

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

科研

生物化学

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

使用双光束扫描电子显微镜从玻璃体生物样品制备薄片进行冷冻电子断层扫描

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

冷冻电子断层扫描 的糖核 酸的准备和冷冻-FIB微加工

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

制备与DNA修复因子络合的核小体核心颗粒用于冷冻电镜结构测定

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

从哺乳动物细胞中提取修饰的微管以通过冷冻电子显微镜研究微管 - 蛋白质复合物

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

单层石墨烯在冷冻电子显微镜网格中的应用，用于高分辨率结构测定

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

哺乳动物细胞 原位 冷冻断层扫描的样品制备

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...