Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Vi takker Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang, og Mrs Josephine W. Mitchell i Institut for Biokemi, University of Wisconsin, Madison for generøst at dele elav-Gal4, UAS-CD8:: GFP flyve stamme (Bloomington stock center, # 5146). Vi vil også gerne takke Dr. Aurélien Duboin, Mr. Laurent Siquier, og Ms Marie-Charlotte Manus fra Alvéole og Mr. Serge Kaddoura fra Nanoscale Labs for deres generøse støtte i løbet af dette projekt. Dette arbejde blev delvist støttet af University of Wisconsin, Madison, Institut for Biokemi ved University of Wisconsin, Madison, og offentlige sundhedsydelser tilskud R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1, og U24 GM139168 til E.R.W. og R01 AI150475 til PW fra NIH. En del af denne forskning blev støttet af NIH tilskud U24 GM129547 og udført på PNCC på OHSU og tilgås via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsoreret af Office of Biological and Environmental Research. Vi er også taknemmelige for brugen af faciliteter og instrumentering på Cryo-EM Research Center i Institut for Biokemi ved University of Wisconsin, Madison.

<ol>
	<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM:+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity.">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+electron+crystallography+of+2D+crystals+to+MicroED+of+3D+crystals.">From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals.</a> Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-the+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>B&#228;uerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+native+Drosophila+tissues+vitrified+by+plunge+freezing.">Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing.</a> bioRxiv. , 437159 (2021).</li><li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells.">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).</li><li>Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+Electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).</li><li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> Elife. 8, 45919 (2019).</li><li>Wu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+neuronal+networks.">Micropatterning neuronal networks.</a> Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+micropatterning+technology+for+whole+cell+cryogenic+electron+microscopy+studies.">Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+micropatterning+for+cryo-electron+tomography+studies+of+cell-cell+contacts.">Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts.</a> bioRxiv. , 272237 (2021).</li><li>Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+cryo-electron+tomography+of+cultured+and+primary+eukaryotic+cells+on+micropatterned+TEM+grids.">Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids.</a> bioRxiv. , 447251 (2021).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons.">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+assembly+of+respiratory+syncytial+virus+revealed+by+cryo-electron+tomography.">The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography.</a> Viruses. 10 (8), (2018).</li><li>Stobart, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+RSV+vaccine+with+engineered+thermostability+is+immunogenic+in+cotton+rats+despite+high+attenuation.">A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation.</a> Nature Communications. 7, 13916 (2016).</li><li>Hotard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stabilized+respiratory+syncytial+virus+reverse+genetics+system+amenable+to+recombination-mediated+mutagenesis.">A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis.</a> Virology. 434 (1), 129-136 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+virus+assembly+and+organization+by+the+measles+virus+matrix+protein.">Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein.</a> Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).</li><li>Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+situ+neuronal+model+for+cryo-ET.">A new in situ neuronal model for cryo-ET.</a> Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition.">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+method+for+cryo-electron+tomography:+Characterizing+stage+behavior+during+FISE+acquisition.">Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).</li><li>Anderson, D. E., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+micropatterning:+methods,+effects,+and+applications.">Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications.</a> Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+components+for+cell+culture.">Use of extracellular matrix components for cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).</li><li>Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy.">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).</li><li>Schellenberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+correlative+fluorescence+and+electron+cryo+microscopy+using+two+independent+alignment+markers.">High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers.</a> Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Moderne, avancerede elektronmikroskoper og softwarepakker understøtter nu strømlinet automatiseret kryo-EM og kryo-ET dataindsamling, hvor hundreder til tusinder af positioner kan målrettes og afbildes inden for få dage32,33,34,35. En væsentlig begrænsende faktor for hele celle cryo-ET arbejdsgange har været at opnå et tilstrækkeligt antal samlerobjekter pr nettet. For nylig har en række grupper udviklet protokoller for mikropatteringsnet til kryo-EM, hvor en fordel er forbedret dataindsamlingseffektivitet16,17,18. Her præsenteres en protokol for brug af et kommercielt tilgængeligt mikropatterningssystem til mikropattern TEM-gitre til kryo-ET-undersøgelser af primære Drosophila neuroner og dyrkede menneskelige cellelinjer (ikke-inficerede eller RSV-inficerede). Dette micropatterningssystem er alsidigt, og mange trin kan optimeres og skræddersys til at passe til specifikke eksperimentelle mål. En bruger med TEM og fluorescensmikroskopi erfaring kan hurtigt blive dygtig i gitter forberedelse og micropatterning. Med omhyggelig praksis bør gode resultater være opnåelige efter et par gentagelser. Nedenfor diskuteres nogle af de tilgængelige muligheder, brugerovervejelser, potentielle fordele og fremtidige anvendelser af micropatterning til kryo-EM.
En af de vigtige overvejelser for hele celle cryo-ET er EM gitter udvælgelse. EM-gitre består af to dele: en maskeramme (eller strukturel støtte) og folien (eller filmen), som er den kontinuerlige eller hullede filmoverflade, hvor cellerne vil vokse. Kobbernetgitre bruges almindeligvis til kryo-EM af proteiner og isolerede komplekser. Men de er uegnede til hele celle cryo-ET på grund af cytotoksicitet af kobber. I stedet er et guldnet almindeligt anvendt til cellulær tomografi. Andre muligheder omfatter nikkel eller titanium, som kan give fordele i forhold til guld såsom øget stivhed16. EM-gitre fås med forskellige maskedimensioner, der understøtter en række applikationer. Større maskestørrelser giver mere plads til celler til at vokse mellem gitterstænger og flere områder, der er modtagelige for tilt-serien indsamling, men på bekostning af øget samlet prøve skrøbelighed. Den mest almindeligt anvendte folie er perforeret eller holey amorf kulstof, såsom Quantifoils eller C-flade net. Biologiske mål kan afbildes enten gennem hullerne i kulstof eller gennem elektron-gennemskinnelige kulstof. Gitre som R 2/1 eller R 2/2, hvor hullerne er 2 μm brede, der er fordelt med henholdsvis 1 og 2 μm fra hinanden, giver et stort antal huller og dermed et stort antal potentielle områder til dataindsamling. Nogle celler kan dog vokse og udvide sig bedre på mere ensartede overflader som R 1.2/20-gitre eller kontinuerligt kulstof. Ved downstream-prøvebehandling ved hjælp af fokuseret ionstrålefræsning (cryo-FIB) fjernes folien gennem fræsning, hvilket mindsker bekymringerne over den underliggende films fortsatte tilstedeværelse. Som med masken er folier fra andre materialer også tilgængelige, med mønsterprotokollen, der præsenteres her, lige så velegnet til SiO2-gitre . Almindeligt anvendte gitre omfatter guld Quantifoil, kontinuerlig kulstof, eller SiO2 film 200-mesh gitre (~ 90 μm afstand mellem gitre barer) for hele celle cryo-ET.
Der er en række overvejelser, når du designer et mønster. Et flertal af disse beslutninger styres af eksperimentets celletype og formål. Et godt udgangspunkt er at vælge et mønster, der tilnærmer form og dimensioner af cellerne i kulturen. Mange undersøgelser har vist betydelige virkninger af mønsterform på cellevækst og cytoskeletal arrangement13,36,37. Der bør udvises særlig omhu under mønsterdesignet, hvis dette kan ændre målet for interesse. Flere mønstre for hver celletype blev testet for at bestemme, hvilke mønstre fremmes cellulære vedhæftning og vækst. Mikropatterningssystemets fleksibilitet gør det muligt at teste flere mønstre på et enkelt gitter og ændre mønstre for forskellige gitre i et enkelt eksperiment. Større mønstre (~50-90 μm), som dem, der anvendes her, øger sandsynligheden for, at flere celler klæber til et enkelt område af mønsteret og tillader celler at udvide og udvide efter vedhæftning. Mere begrænsede mønstre (20-30 μm) kan være hensigtsmæssige i forsøg, hvor celleisolation er mere kritisk end celleudvidelse, f.eks. For tomografi applikationer, kan man nødt til at overveje virkningen af tilt-aksen. Hvis et mønster er placeret således, at alle celler vokser parallelt med hinanden i en enkelt retning, er det muligt, at alle cellerne vil være vinkelret på tilt-aksen, når de indlæses på mikroskopstadiet, hvilket resulterer i en lavere datakvalitet.
På ikke-asfalterede gitre klæber cellerne ofte fortrinsvis til gitterstængerne, hvor de ikke kan afbildes af TEM. Selv på mønstrede gitre observeres celler ofte at være placeret i hjørnerne af gitter firkanter delvist på både den mønstrede carbonfolie og gitterstang. For nylig blev micropatterning brugt til bevidst at placere en del af cellen over gitterstangen18. Dette kunne overvejes til eksperimenter, hvor det ikke er afgørende at have hele celle periferien på folien. Dette kan især være vigtigt for celler, der kan vokse sig større end en enkelt gitter firkant, såsom primære neuroner vokser over flere dage.
Der er mange værktøjer, der kan bruges til at designe et mønster. Her var mønsteret begrænset til mindre end 800 pixels i enhver dimension, således at mønsteret kan roteres til enhver vinkel og stadig passer inden for det maksimale område, der kan mønstres i en enkelt projektion af dette mikropatterningssystem. Dette gør det muligt for brugeren at rotere mønsteret for at være korrekt orienteret med gitteret uanset retningen af gitteret på mikroskopet. Her blev gitteret opdelt i seks mønsterområder. Dette giver primært mulighed for fokusjustering mellem forskellige områder af nettet. Især guldgitre er meget formbare og må ikke lægge sig helt fladt ned på glasset. Korrekt fokus er afgørende for rene, raffinerede mønstre resultater. Ved at bruge segmenterede mønstre skal der kun foretages mindre justeringer af mønsterpositionen, hvis gitteret skifter lidt under mønsterprocessen, selvom dette normalt ikke er et problem, når du bruger PLPP-gelen med PDMS-stencilerne. Endelig forblev de centrale fire gitter firkanter af nettet ikke asfalteret. Dette understøtter, at en bruger er i stand til klart at identificere midten af gitteret, hvilket er meget nyttigt til korrelative billeddiagnostiske eksperimenter.
Mønstresoftwaren til dette mikropatterningssystem, Leonardo, har også mere avancerede funktioner såsom syninger og evnen til at importere mønstre som PDF-filer, som ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. Denne software omfatter også mikrostrukturdetektering og automatiseret mønsterpositionering, der kan bruges på TEM-gitre. Denne funktion er mest nyttig, når gitteret er meget fladt og kan mønstres uden at skulle justere fokus mellem forskellige områder.
Udvælgelse af et ECM-protein kan have en betydelig indvirkning på celle vedhæftning og ekspansion. Nogle celler er kendt for at gennemgå fysiologiske ændringer, når de dyrkes på specifikke substrater38. Flere ECM-proteiner og koncentrationer blev testet for enhver ny celletype baseret på tidligere arbejde rapporteret i litteraturen. Laminin, fibrinogen, fibronectin, og kollagen er meget udbredt til dyrkede celler og kan bruges som udgangspunkt, hvis andre data ikke er tilgængelige. Andre ECM-proteiner skal dog også tages i betragtning, hvis de almindeligt anvendte ECM-proteiner ikke giver cellerne korrekte tilslutningsegenskaber. Dette var især tilfældet for primære Drosophila neuroner, som en høj koncentration af planten lectin concanavalin A var nødvendig for korrekt cellulær tilslutning. Kompatibiliteten af cellulær vedhæftning og vækst med ECM kan testes ved at mønstre på glasskåle eller dias, før de overgår til TEM-gitre. Denne præscreeningsmetode er tids- og omkostningseffektiv, hvis et stort antal kombinationer skal undersøges. Inkluderingen af et fluorescerende konjugeret ECM-protein er værdifuldt til vurdering af mønstrenes succes og kvalitet.
Celle såning er et af de vigtigste skridt for hele celle cryo-ET, enten med eller uden micropatterning6,16,39. For primære Drosophila eller andre neuroner, som er skrøbelige, ustabile i suspension, og kan være begrænset i mængde, enkelt såning tilgange foretrækkes frem for overvågede, sekventiel celle såning. Et enkelt såning trin på en optimeret celletæthed, som beskrevet i protokollen for Drosophila neuroner, er en levedygtig mulighed for de fleste celletyper. Det er dog også muligt at så celler på substratet ved en lavere indledende koncentration og tilføje flere celler på en overvåget måde som beskrevet her og i anden litteratur18. Denne sekventielle såning kan give mere konsekvente resultater i nogle tilfælde. I lighed med standardcellekulturen skal man altid være forsigtig med at opretholde celle levedygtighed og minimere celleklumpning under isolation.
Når du først starter med micropatterning, er der et par potentielle faldgruber, der er skadelige for det endelige resultat. Omhyggelig nethåndtering og steril teknik, en ensartet fordeling af PLPP gel, korrekt dosis og fokus under mønstre, og vedligeholdelse af celle levedygtighed før såning er blandt de vigtigste overvejelser for succes. En liste over nogle af de potentielle problemer samt løsninger blev samlet i tabel 1.
Mikropatterned gitre kan bruges til at hjælpe med at placere celler til at etablere en ensartet celletæthed på tværs af nettet og til at placere områder af interesse i områder, der er egnede til tilt-serien indsamling16,18. Placering og placering af celler kan bruges som fiducial markører for korrelation i kryo-CLEM eksperimenter, hvilket reducerer behovet for skrøbelige finder-net og fluorescerende fiducial markører. Det skal dog bemærkes, at sådanne fiducial markører stadig kan være nyttige for sub-mikrometer nøjagtighed korrelation29,40. Desuden er en jævn fordeling af isolerede celler også meget gavnlig for fokuseret-ion stråle fræsning (cryo-FIB) eksperimenter for at maksimere antallet af celler, hvorfra lameller kan skæres16.
Tilføjelsen af micropatterning til cryo-EM-arbejdsgange vil resultere i målbare forbedringer i dataoverførselshastigheden og potentielt muliggøre nye eksperimenter. Efterhånden som teknikken er yderligere vedtaget og udviklet, vil mere avancerede anvendelser af mikropatterning, herunder ECM-gradienter, flere ECM-aflejringer og mikrostrukturmontering, yderligere udvide mulighederne i cryo-ET til at studere biologiske mål og processer i fuld cellulær kontekst.

Med udviklingen, ekspansionen og alsidigheden af kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) har forskere undersøgt en bred vifte af biologiske prøver i en næsten indfødt tilstand fra makromolektær (~ 1 nm) til høj (~ 2 Å) opløsning. Enkelt-partikel cryo-EM og elektron diffraktion teknikker anvendes bedst til renset makromolekyler i opløsning eller i en krystallinsk tilstand, henholdsvis1,2. Mens kryo-elektrontomografi (kryo-ET) er unikt velegnet til næsten indfødte strukturelle og ultrastrukturelle undersøgelser af store, heterologe objekter som bakterier, pleomorfe vira og eukaryote celler3. I cryo-ET opnås tredimensionelle (3D) oplysninger ved fysisk at vippe prøven på mikroskopstadiet og erhverve en række billeder gennem prøven i forskellige vinkler. Disse billeder, eller tilt-serien, dækker ofte et interval på +60/-60 grader i en-til-tre-graders intervaller. Tilt-serien kan derefter beregningsmæssigt rekonstrueres til et 3D-volumen, også kendt som et tomogram4.
Alle cryo-EM teknikker kræver, at prøven skal indlejres i et tyndt lag af amorf, ikke-krystallinsk, glasagtig is. En af de mest almindeligt anvendte kryo-fiksering teknikker er springet frysning, hvor prøven anvendes til EM nettet, blottet, og hurtigt kastet i flydende ethan eller en blanding af flydende ethan og propan. Denne teknik er tilstrækkelig til vitrificering af prøver fra <100 nm til ~ 10 μm i tykkelse, herunder dyrkede menneskelige celler, såsom HeLa celler5,6. Tykkere prøver, såsom mini-organoider eller vævsbiopsier, op til 200 μm i tykkelse, kan vitrificeres ved højtryksfrysning7. På grund af øget elektronspredning af tykkere prøver er prøve og istykkelse til kryo-ET dog begrænset til ~ 0,5 - 1 μm i 300 kV transmissionselektronmikroskoper. Derfor er hele celle kryo-ET af mange eukaryote celler begrænset til cellen periferien eller udvidelser af celler, medmindre yderligere prøve forberedelse trin anvendes, såsom kryo-sektion8 eller fokuseret-ion stråle fræsning9,10,11.
En begrænsning af mange helcellede cryo-ET billedeksperimenter er dataindsamling gennemløb12. I modsætning til enkelt-partikel cryo-EM, hvor tusindvis af isolerede partikler ofte kan afbildes fra en enkelt TEM gitter firkant, celler er store, spredt ud, og skal dyrkes med lav nok densitet til at tillade cellerne, der skal bevares i et tyndt lag af glasagtig is. Ofte er interesseområdet begrænset til en bestemt funktion eller underområde i cellen. Yderligere begrænsning af gennemløb er tilbøjeligheden af celler til at vokse på områder, der ikke er modtagelige for TEM-billeddannelse, såsom på eller i nærheden af TEM gitter barer. På grund af uforudsigelige faktorer, der er forbundet med cellekultur på TEM-net, er der behov for den teknologiske udvikling for at forbedre stikprøvetilgængelighed og overførselshastighed til dataindsamling.
Substratmikrning med klæbende ekstracellulære matrixproteiner (ECM) er en veletableret teknik til levende cellelysmikroskopi til at lede væksten af celler på stive, holdbare og optisk gennemsigtige overflader som glas og andre vævskultursubstrater13,14. Der er også udført mikromaling på bløde og/eller tredimensionelle (3D) overflader. Sådanne teknikker har ikke kun gjort det muligt præcist at placere celler; de har også støttet oprettelsen af flercellede netværk, såsom mønstrede neurale cellekredsløb15. At bringe mikropatterning til cryo-ET vil ikke kun øge gennemløbet, men det kan også åbne nye undersøgelser for at udforske komplekse og dynamiske cellulære mikromiljø.
For nylig er flere grupper begyndt at bruge mikropatterning teknikker på TEM gitre gennem flere tilgange16,17. Her beskrives brugen af en maskeløs fotopatterningsteknik til TEM-gitre ved hjælp af Alvéole PRIMO mikropatterningssystem, som har høj opløsning og kontaktløse mønstre. Med dette mikropatterningssystem påføres et anti-fouling lag på toppen af substratet, efterfulgt af anvendelse af en fotokatalysator og ablation af anti-fouling lag i brugerdefinerede mønstre med en UV-laser. ECM proteiner kan derefter føjes til mønstrene for den relevante cellekultur. Denne metode er blevet brugt af flere grupper til cryo-ET undersøgelser af retinale pigment epitel-1 (RPE1), Madin-Darby hunde nyre-II (MDCKII), human forhud fibroblast (HFF), og endotelcellelinjer16,17,18. Dette mikropatterningssystem er kompatibelt med flere anti-fouling lag substrater samt enten en væske eller gel photocatalyst reagens. En række ECM-proteiner kan vælges fra og tilpasses til cellelinjens specificitet, hvilket giver brugeren alsidighed.
Micropatterning er med succes blevet anvendt på en række projekter inden for laboratoriet19. Her præsenteres en mikropatterning protokol, herunder specifikke tilpasninger til at studere kultiverede HeLa-celler, respiratorisk syncytial virus (RSV)-inficerede BEAS-2B-celler og primære larve Drosophila melanogaster neuroner20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

Helcellet kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er en kraftfuld teknologi, der bruges til at producere nanometer-niveau opløsning strukturer af makromolekyler til stede i cellulære sammenhæng og bevaret i en næsten indfødt frossen-hydreret tilstand. Der er dog udfordringer forbundet med dyrkning og / eller klæbe celler på TEM gitre på en måde, der er egnet til tomografi og samtidig bevare cellerne i deres fysiologiske tilstand. Her præsenteres en detaljeret trinvis protokol om brugen af mikropattering til at lede og fremme eukaryote cellevækst på TEM-net. Under mikropatterning styres cellevæksten ved at deponere ekstra cellulære matrixproteiner (ECM) inden for bestemte mønstre og positioner på folien i TEM-gitteret, mens de andre områder forbliver belagt med et anti-fouling lag. Fleksibilitet i valget af overfladebelægning og mønsterdesign gør micropatterning bredt anvendelig for en lang række celletyper. Mikropattering er nyttig til undersøgelser af strukturer i de enkelte celler samt mere komplekse eksperimentelle systemer såsom værtspatogeninteraktioner eller differentierede multicellulære samfund. Mikropattering kan også integreres i mange downstream helcellede cryo-ET-arbejdsgange, herunder korrelativt lys og elektronmikroskopi (kryo-CLEM) og fokuseret ionstrålefræsning (cryo-FIB).

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Målet med denne protokol er at lede celle vedhæftning og vækst til målrettede områder af net til kryo-elektronmikroskopi. Dette opnås ved at anvende et anti-fouling lag, der er ablated i bruger-specificerede mønstre efterfulgt af aflejring af ekstra cellulære matrix proteiner i de mønstrede områder før celle såning.

Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Vores forskerhold udvikler teknologier og protokoller til kryo-elektronmikroskopi og kryo-elektrontomografi. Vi har udviklet protokoller for micropatterning TEM net til direkte cellevækst og positionering for cryo-ET eksperimenter. Helcellet kryo-elektrontomografi bruges til at producere nanometer-niveau opløsning strukturer af makromolekylær komplekser i celler bevaret i en indfødt frossen hydreret tilstand.Micropatterning kan øge gennemløbet af hele cellen cryo-ET, kryo-korrelativ lys elektronmikroskopi, og kryo-fokuseret-ion-beam fræsning eksperimenter. Antallet og fordelingen af celler på EM-net er afgørende for helcellede cryo-ET-undersøgelser. Denne protokol giver en hurtig, reproducerbar og bredt tilpasningsdygtig metode til direkte cellevækst på EM-net gennem mikromaling.Investigator bør være behageligt ved hjælp af pipetter, pincet, grundlæggende cellekultur teknikker, og fluorescens og transmission elektron mikroskoper. Når du mønstrer for første gang, skal du bruge en velkendt celletype og ECM-kombination og teste dem på coverslips eller MatTek-retter. Forskergruppemedlemmer, der er involveret i denne protokoludvikling, er: Dr.Brian Sibert, Mr.Joseph Kim og Dr. Jae Yang. Til at begynde med skal du overføre gitrene til en gitterforberedelsesholder og gløde udlede gitrenes kulstofside op. Overfør derefter gitrene med kulstofsiden op til en ren glasrutschebane eller coverlip med mindst en centimeter adskillelse mellem gitrene.Pipette 10 mikroliter på 0,05 poly-L-lysin på hvert gitter og inkubere gitrene i et fugtigt kammer i mindst 30 minutter. Efter inkubation vaskes hvert gitter tre gange med 15 mikroliter på 0,1 molar HEPES ved pH 8.5. Inkuber gitteret i hver vask i 30 sekunder, og fjern derefter det meste af væsken fra gitteret med en pipette uden at lade gitteret tørre.Efter den endelige vask skal du forlade hvert gitter i 15 mikroliter af 0,1 molar HEPES. Derefter forberede PEG-SVA-opløsningen og straks erstatte HEPES-opløsningen på gitrene med 10 mikroliter af PEG-SVA-opløsningen og derefter inkubere gitrene i et fugtigt kammer i mindst en time. Efter inkubation vaskes hvert gitter tre gange med 15 mikroliter sterilt vand og inkuberer gitteret i hver vask i 30 sekunder.Efter den endelige vask skal du forlade hvert gitter i 15 mikroliter vand. Placer en en mikroliter dråbe vand på midten af en ny ren coverlip, derefter omhyggeligt overføre nettet fra 15 mikroliter vanddråbe til dråben på den nye coverlip med kulstof side op. Derefter skal du forsigtigt placere på PDMS stencil over gitteret og holde gitteret centreret og minimere stencil kontakt med kulfolie af nettet.Derefter tilsættes en mikroliter plpp gel på nettet og pipette forsigtigt at blande. Flyt dæksleren med gitteret til et mørkt sted for at tørre. Gelen tørrer om 15 til 30 minutter.For micropatterning skal du åbne softwaren med en levende Brightfield-udsigt fra mikroskopet. Hvis du vil designe en ny skabelon til en første kørsel, skal du vælge Tilføj investeringsafkast og vælge en 3.000 mikrometercirkel. Placer cirklens investeringsafkast over gitteret ved hjælp af Brightfield-billedet på skærmen som en vejledning, og tryk derefter på Lås for at sikre investeringsafkast.Når du har låst investeringsafkast på plads, skal du vælge Tilføj mønster og vælge det relevante mønster. Ved hjælp af replikeringsindstillingerne skal du generere kopier af det oprindelige mønster for at oprette et otte efter otte gitterområde. Juster afstanden og vinklen efter behov for at justere mønstrene med gitterkvartalerne.Placer mønsteret i det ene hjørne af gitteret. Derefter skal duplikere mønsteret og placere en kopi i hvert af de fire hjørner af gitteret, der flytter mikroskopstadiet efter behov for hvert område. Brug replikeringsindstillingerne til at ændre et otte efter otte gitterområde til et to-otte gitterområde, der skal placeres på begge sider af midten.Lad de midterste fire gitter firkanter ikkepatterned. For hvert mønster justeres den samlede dosis, hvis det er nødvendigt. 30 millijoule pr. kvadratmillimeter er et godt udgangspunkt.Under Ekspertindstillinger skal du angive justering af mønsterets vinkel, position, mellemrum og forhold for at finjustere justeringen af mønsteret med gitterkvartallene. Flyt mikroskopstadiet for at ændre gitterområdet i Brightfield-skærmen. Når skabelonen og mønstrene er placeret, skal du fjerne markeringen af alle områder undtagen et af regionerne i softwarens handlingspanel.Brug mikroskopstadiet til at navigere til den pågældende region og fokusere på kulstoffolien. Klik på øjeæblet ikonet i handlingspanelet for at slå mønster overlay display off. Når gitteret er i fokus, skal du lukke Brightfield-lukkeren og trykke på Play-ikonet nederst til højre i softwaren for at starte mønsterprocessen, som kan overvåges live.Gentag dette trin, indtil alle områder er mønstrede. Endelig skal du fjerne coverlip med gitteret fra mikroskopet og straks tilføje 10 mikroliter steril PBS på nettet. Efter 10 minutter skal du fjerne stencilen med pincet, derefter vaske gitteret tre gange med 15 mikroliter pbs og efterlade hvert gitter i PBS på et mørkt sted.Forbered 15 mikroliter af den ekstracellulære matrix for hvert gitter, og udskift derefter PBS fra hvert gitter med 15 mikroliter af den ekstracellulære matrix og inkuber gitteret i et fugtigt kammer i mindst en time. Efter inkubation vaskes hvert gitter fem gange med 15 mikroliter steril PBS som tidligere påvist. Efter den endelige vask skal du forlade hvert gitter i PBS.Ved hjælp af et fluorescensmikroskop skal fluorophoren registreres i den ekstracellulære matrix for at bekræfte mønstret, og at kulstoffolien forbliver intakt. HeLa celler seedet på micropatterned og unpatterned TEM gitre er synlige ved fluorescerende farvning ved hjælp af en calcein AM og ethidium homodimer-1 baseret celle levedygtighed assay. Ved hjælp af en blandet kollagen og fibrinogen ekstracellulær matrix, HeLa celler let klæber til mønstre på tværs af nettet.Den samlede morfologi af celler, der ekspanderede langs mønsteret, svarer til cellerne, der dyrkes på ikke-asfalterede gitre. En Brightfield billede af RSV inficeret BEAS-2B celler 18 timer efter såning viser celle vedhæftning og vækst langs den centrale region af mønsteret. De fleste af de inficerede celler er placeret langs den højere tæthed centrale region af gradient mønster.RSV-varianterne er placeret tæt på periferien af de inficerede BEAS-2B-celler, der dyrkes på mikropatterned gitre. Mange RSV strukturelle proteiner er identificeret inden for tomogram, herunder nukleocapsid og viral fusion protein. På mikropatterned gitre, Drosophila neuroner med pan-neuronal GFP udtryk kan let spores af lysmikroskopi på grund af fluorescerende mærkning og deres placering er inden for micropatterns.Neuroner på ikke-asfalterede gitre kan også spores gennem GFP signalering af lysmikroskopi. Men at lokalisere dem i kryo-elektronmikroskopi bliver svært på grund af cellulær snavs og forurening fra medierne. På grund af dimensionerne af neuron celle kroppen og udvidede neurites, kryo-elektron tomografi tilt serien indsamles langs tyndere regioner af cellerne med højere forstørrelse.Den neuronale cellemembran, mitokondrier, mikrotubuler, actin filamenter, køretøjsstrukturer og makromolekyler som ribosomer er godt løst i højere forstørrelsesbillagemontage og skiver gennem 3D-tomogrammet. Lignende subcellulære træk observeres fra 3D-tomogrammer af ikke-asfalterede neuroner. Anvendelse af stencilen til nettet og tilføjelse på PLPP gel er det mest følsomme skridt, der kan påvirke mønstrende resultater og bør gøres med forsigtighed.Cryo-CLEM kan bruges til at lokalisere mål af interesse i celler til kryo-ET dataindsamling. Cryo-FIB-SEM kan bruges til at tynde celler på områder, der ellers er for tykke til dataindsamling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Hurtig gitterforberedelse til tidstilslutt kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og kryo-FIB mikromaskiner af Saccharomyces cerevisiae til Kryo-Elektron Tomografi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Fremstilling af nukleosomkernepartikler kompleksbundet med DNA-reparationsfaktorer til kryo-elektronmikroskopi strukturbestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstraktion af modificerede mikrotubuli fra pattedyrceller til undersøgelse af mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anvendelse af monolagsgrafen på kryo-elektronmikroskopigitter til strukturbestemmelse med høj opløsning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

Prøveforberedelse til in situ kryotomografi af pattedyrceller

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...