Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

We bedanken Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang en Mevrouw Josephine W. Mitchell van de afdeling Biochemie, University of Wisconsin, Madison voor het genereus delen van de elav-Gal4, UAS-CD8::GFP vliegensoort (Bloomington stock center, #5146). We willen ook Dr. Aurélien Duboin, De heer Laurent Siquier en Mevrouw Marie-Charlotte Manus van Alvéole en de heer Serge Kaddoura van Nanoscale Labs bedanken voor hun genereuze steun tijdens dit project. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Wisconsin, Madison, de afdeling Biochemie aan de Universiteit van Wisconsin, Madison, en de volksgezondheid verleent R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 en U24 GM139168 aan E.R.W. en R01 AI150475 aan P.W.S. van de NIH. Een deel van dit onderzoek werd ondersteund door NIH-subsidie U24 GM129547 en uitgevoerd bij de PNCC bij OHSU en toegankelijk via EMSL (grid.436923.9), een DOE Office of Science User Facility gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research. We zijn ook dankbaar voor het gebruik van faciliteiten en instrumentatie in het Cryo-EM Research Center in de afdeling Biochemie aan de Universiteit van Wisconsin, Madison.

<ol>
	<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM:+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity.">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+electron+crystallography+of+2D+crystals+to+MicroED+of+3D+crystals.">From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals.</a> Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-the+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>B&#228;uerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+native+Drosophila+tissues+vitrified+by+plunge+freezing.">Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing.</a> bioRxiv. , 437159 (2021).</li><li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells.">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).</li><li>Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+Electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).</li><li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> Elife. 8, 45919 (2019).</li><li>Wu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+neuronal+networks.">Micropatterning neuronal networks.</a> Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+micropatterning+technology+for+whole+cell+cryogenic+electron+microscopy+studies.">Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+micropatterning+for+cryo-electron+tomography+studies+of+cell-cell+contacts.">Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts.</a> bioRxiv. , 272237 (2021).</li><li>Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+cryo-electron+tomography+of+cultured+and+primary+eukaryotic+cells+on+micropatterned+TEM+grids.">Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids.</a> bioRxiv. , 447251 (2021).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons.">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+assembly+of+respiratory+syncytial+virus+revealed+by+cryo-electron+tomography.">The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography.</a> Viruses. 10 (8), (2018).</li><li>Stobart, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+RSV+vaccine+with+engineered+thermostability+is+immunogenic+in+cotton+rats+despite+high+attenuation.">A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation.</a> Nature Communications. 7, 13916 (2016).</li><li>Hotard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stabilized+respiratory+syncytial+virus+reverse+genetics+system+amenable+to+recombination-mediated+mutagenesis.">A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis.</a> Virology. 434 (1), 129-136 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+virus+assembly+and+organization+by+the+measles+virus+matrix+protein.">Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein.</a> Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).</li><li>Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+situ+neuronal+model+for+cryo-ET.">A new in situ neuronal model for cryo-ET.</a> Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition.">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+method+for+cryo-electron+tomography:+Characterizing+stage+behavior+during+FISE+acquisition.">Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).</li><li>Anderson, D. E., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+micropatterning:+methods,+effects,+and+applications.">Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications.</a> Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+components+for+cell+culture.">Use of extracellular matrix components for cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).</li><li>Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy.">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).</li><li>Schellenberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+correlative+fluorescence+and+electron+cryo+microscopy+using+two+independent+alignment+markers.">High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers.</a> Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Moderne, geavanceerde elektronenmicroscopen en softwarepakketten ondersteunen nu gestroomlijnde geautomatiseerde cryo-EM- en cryo-ET-gegevensverzameling waarbij honderden tot duizenden posities binnen enkele dagen kunnen worden gericht en in beeld gebracht32,33,34,35. Een belangrijke beperkende factor voor cryo-ET-workflows met hele cellen is het verkrijgen van voldoende verzamelbare doelen per raster. Onlangs hebben een aantal groepen protocollen ontwikkeld voor micropatterning-rasters voor cryo-EM, met als voordeel een verbeterde efficiëntie van gegevensverzameling16,17,18. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het gebruik van een commercieel beschikbaar micropatterningsysteem om TEM-rasters te micropatttern voor cryo-ET-studies van primaire Drosophila-neuronen en gekweekte menselijke cellijnen (niet-geïnfecteerd of RSV-geïnfecteerd). Dit micropatterningsysteem is veelzijdig en vele stappen kunnen worden geoptimaliseerd en afgestemd op specifieke experimentele doelen. Een gebruiker met TEM- en fluorescentiemicroscopie-ervaring kan snel bekwaam worden in rastervoorbereiding en micropatterning. Met zorgvuldige oefening moeten goede resultaten haalbaar zijn na een paar iteraties. Hieronder worden enkele van de beschikbare opties, gebruikersoverwegingen, potentiële voordelen en toekomstige toepassingen van micropatterning voor cryo-EM besproken.
Een van de belangrijke overwegingen voor cryo-ET voor hele cellen is EM-rasterselectie. EM-rasters bestaan uit twee delen: een gaasframe (of structurele ondersteuning) en de folie (of film), het continue of gatenachtige filmoppervlak waarop cellen zullen groeien. Koperen gaasroosters worden vaak gebruikt voor cryo-EM van eiwitten en geïsoleerde complexen. Ze zijn echter ongeschikt voor cryo-ET met hele cellen vanwege de cytotoxiciteit van koper. In plaats daarvan wordt een gouden gaas vaak gebruikt voor cellulaire tomografie. Andere opties zijn nikkel of titanium, wat voordelen kan bieden ten opzichte van goud, zoals een verhoogde stijfheid16. EM-roosters zijn verkrijgbaar met verschillende maasafmetingen om een reeks toepassingen te ondersteunen. Grotere maaswijdten bieden meer ruimte voor cellen om te groeien tussen roosterbalken en meer gebieden die geschikt zijn voor het verzamelen van kantelseries, hoewel dit ten koste gaat van een verhoogde algehele kwetsbaarheid van het monster. De meest gebruikte folie is geperforeerde of holey amorfe koolstof, zoals Quantifoils of C-flat roosters. Biologische doelen kunnen worden afgebeeld door de gaten in de koolstof of door de elektrondoorschijnende koolstof. Rasters zoals R 2/1 of R 2/2, waarbij de gaten 2 μm breed zijn en respectievelijk 1 en 2 μm uit elkaar staan, bieden een groot aantal gaten en dus een groot aantal potentiële gebieden voor gegevensverzameling. Sommige cellen kunnen echter beter groeien en uitbreiden op meer uniforme oppervlakken zoals R 1.2 / 20-rasters of continue koolstof. Voor downstream monsterverwerking door focused-ion beam milling (cryo-FIB) wordt de folie verwijderd door middel van frezen, waardoor zorgen over de voortdurende aanwezigheid van de onderliggende film worden verminderd. Net als bij het gaas zijn er ook folies van andere materialen beschikbaar, waarbij het hier gepresenteerde patroonprotocol even geschikt is voor SiO2-roosters . Veelgebruikte rasters zijn goud Quantifoil, continue koolstof of SiO2-film 200-mesh roosters (~ 90 μm afstand tussen rasterstaven) voor cryo-ET voor hele cellen.
Er zijn een aantal overwegingen bij het ontwerpen van een patroon. Een meerderheid van deze beslissingen wordt geleid door het celtype en het doel van het experiment. Een goed uitgangspunt is om een patroon te kiezen dat de vorm en afmetingen van de cellen in cultuur benadert. Veel studies hebben significante effecten van patroonvorm op celgroei en cytoskeletale arrangementen aangetoond13,36,37. Speciale zorg moet worden genomen tijdens het ontwerpen van het patroon als dit het doel van belang kan veranderen. Verschillende patronen voor elk celtype werden getest om te bepalen welke patronen cellulaire adhesie en groei bevorderden. De flexibiliteit van het micropatterningsysteem maakt het mogelijk om meerdere patronen op één raster te testen en patronen voor verschillende rasters binnen één experiment te veranderen. Grotere patronen (~ 50-90 μm), zoals die hier worden gebruikt, verhogen de kans dat meerdere cellen zich aan een enkel gebied van het patroon hechten en laten cellen uitzetten en uitbreiden na adhesie. Meer beperkte patronen (20-30 μm) kunnen geschikt zijn in experimenten waar celisolatie kritischer is dan celuitbreiding, zoals voor experimenten met gericht ionenbundelfrezen (cryo-FIB). Voor tomografietoepassingen moet men mogelijk rekening houden met de impact van de kantelas. Als een patroon zo is gepositioneerd dat alle cellen parallel aan elkaar in één richting groeien, is het mogelijk dat alle cellen loodrecht op de kantelas staan wanneer ze op de microscooptrap worden geladen, wat resulteert in een lagere kwaliteit van de gegevens.
Op niet-gepatterde rasters hechten cellen zich vaak bij voorkeur aan de rasterbalken, waar ze niet door TEM kunnen worden afgebeeld. Zelfs op rasters met patronen worden cellen vaak waargenomen in de hoeken van rastervierkanten, gedeeltelijk op zowel de koolstoffolie als de rasterbalk met patroon. Onlangs werd micropatterning gebruikt om opzettelijk een deel van de cel over de rasterbalk te plaatsen18. Dit kan worden overwogen voor experimenten waarbij het niet van cruciaal belang is om de hele celrand op de folie te hebben. Dit kan vooral belangrijk zijn voor cellen die groter kunnen worden dan een enkel rastervierkant, zoals primaire neuronen die gedurende meerdere dagen groeien.
Er zijn veel tools die kunnen worden gebruikt om een patroon te ontwerpen. Hier was het patroon beperkt tot minder dan 800 pixels in elke dimensie, zodat het patroon onder elke hoek kan worden gedraaid en nog steeds past binnen het maximale gebied dat door dit micropatterningsysteem in een enkele projectie kan worden gemodelleerd. Hierdoor kan de gebruiker het patroon roteren om goed te worden georiënteerd met het raster, ongeacht de oriëntatie van het raster op de microscoop. Hier werd het raster verdeeld in zes patroongebieden. Dit maakt in de eerste plaats focusaanpassing tussen verschillende regio's van het raster mogelijk. Vooral gouden roosters zijn zeer kneedbaar en mogen niet helemaal plat op het glas liggen. De juiste focus is essentieel voor schone, verfijnde patroonresultaten. Door gesegmenteerde patronen te gebruiken, hoeven slechts kleine aanpassingen aan de patroonpositie te worden aangebracht als het raster enigszins verschuift tijdens het patroonproces, hoewel dit meestal geen probleem is bij het gebruik van de PLPP-gel met de PDMS-stencils. Tot slot bleven de centrale vier rastervierkanten van het raster ongepatterd. Dit ondersteunt een gebruiker om het centrum van het raster duidelijk te identificeren, wat erg handig is voor experimenten met correlatieve beeldvorming.
De patroonsoftware voor dit micropatterningsysteem, Leonardo, heeft ook meer geavanceerde functies zoals stiksels en de mogelijkheid om patronen als PDF's te importeren, die buiten het bereik van dit protocol vallen. Deze software omvat ook microstructuurdetectie en geautomatiseerde patroonpositionering die kan worden gebruikt op TEM-rasters. Deze functie is het handigst wanneer het raster erg vlak is en kan worden gemodelleerd zonder dat de focus tussen verschillende gebieden hoeft te worden aangepast.
Selectie van een ECM-eiwit kan een aanzienlijke invloed hebben op de hechting en expansie van cellen. Van sommige cellen is bekend dat ze fysiologische veranderingen ondergaan wanneer ze op specifieke substraten worden gekweekt38. Meerdere ECM-eiwitten en concentraties werden getest op elk nieuw celtype op basis van eerder werk dat in de literatuur werd gerapporteerd. Laminine, fibrinogeen, fibronectine en collageen worden veel gebruikt voor gekweekte cellen en kunnen als uitgangspunt worden gebruikt als andere gegevens niet beschikbaar zijn. Andere ECM-eiwitten moeten echter ook worden overwogen als de veelgebruikte ECM-eiwitten er niet in slagen om de juiste hechtingseigenschappen voor de cellen te verlenen. Dit gold met name voor primaire Drosophila-neuronen , omdat een hoge concentratie van het plantaardige lectine concanavaline A noodzakelijk was voor een goede cellulaire hechting. De compatibiliteit van cellulaire hechting en groei met de ECU kan worden getest door patronen op glazen schalen of dia's te maken voordat ze overgaan op TEM-rasters. Deze pre-screening aanpak is tijd- en kosteneffectief als een groot aantal combinaties moet worden onderzocht. De opname van een fluorescerend geconjugeerd ECM-eiwit is waardevol voor het beoordelen van het succes en de kwaliteit van patronen.
Cell seeding is een van de belangrijkste stappen voor cryo-ET voor hele cellen, met of zonder micropatterning6,16,39. Voor primaire Drosophila of andere neuronen, die fragiel zijn, onstabiel in suspensie en beperkt in hoeveelheid, hebben single seeding-benaderingen de voorkeur boven gecontroleerde, sequentiële celzaaiing. Een enkele seeding-stap bij een geoptimaliseerde celdichtheid, zoals beschreven in het protocol voor Drosophila-neuronen, is een haalbare optie voor de meeste celtypen. Het is echter ook mogelijk om cellen in een lagere beginconcentratie op het substraat te zaaien en meer cellen toe te voegen op een gecontroleerde manier zoals hier en in andere literatuur beschreven18. Deze sequentiële zaaiing kan in sommige gevallen consistentere resultaten opleveren. Net als bij standaard celkweek moet er altijd voor worden gezorgd dat de levensvatbaarheid van de cel behouden blijft en dat celklontering tijdens isolatie wordt geminimaliseerd.
Wanneer je voor het eerst begint met micropatterning, zijn er een paar mogelijke valkuilen die schadelijk zijn voor het eindresultaat. Zorgvuldige rasterbehandeling en steriele techniek, een uniforme verdeling van de PLPP-gel, de juiste dosis en focus tijdens het patroon en het behoud van de levensvatbaarheid van de cel voorafgaand aan het zaaien behoren tot de belangrijkste overwegingen voor succes. Een lijst van enkele van de mogelijke problemen en oplossingen werd verzameld in tabel 1.
Microgepatterde rasters kunnen worden gebruikt om cellen te helpen bij het positioneren van een consistente celdichtheid over het raster en om interessante gebieden te positioneren in gebieden die geschikt zijn voor het verzamelen van tilt-series16,18. De plaatsing en positionering van cellen kan worden gebruikt als fiduciale markers voor correlatie in cryo-CLEM-experimenten, waardoor de behoefte aan fragiele finder-grids en fluorescerende fiduciale markers wordt verminderd. Er moet echter worden opgemerkt dat dergelijke fiduciale markers nog steeds nuttig kunnen zijn voor de correlatie van de nauwkeurigheid van submicrometer29,40. Bovendien is een gelijkmatige verdeling van geïsoleerde cellen ook zeer gunstig voor focused-ion beam milling (cryo-FIB) experimenten om het aantal cellen waaruit lamellen kunnen worden gesneden te maximaliseren16.
De toevoeging van micropatterning aan cryo-EM-workflows zal resulteren in meetbare verbeteringen in de gegevensdoorvoer en mogelijk nieuwe experimenten mogelijk maken. Naarmate de techniek verder wordt toegepast en ontwikkeld, zullen meer geavanceerde toepassingen van micropatterning, waaronder ECM-gradiënten, meerdere ECM-deposities en microstructuurassemblage, de mogelijkheden van cryo-ET verder uitbreiden om biologische doelen en processen in volledige cellulaire context te bestuderen.

Met de ontwikkeling, uitbreiding en veelzijdigheid van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) hebben onderzoekers een breed scala aan biologische monsters onderzocht in een bijna-inheemse toestand van macromoleculaire (~ 1 nm) tot hoge (~ 2 Å) resolutie. Cryo-EM- en elektronendiffractietechnieken met één deeltje kunnen het beste worden toegepast op gezuiverde macromoleculen in oplossing of in kristallijne toestand, respectievelijk1,2. Terwijl cryo-elektronentomografie (cryo-ET) bij uitstek geschikt is voor near-native structurele en ultrastructurele studies van grote, heterologe objecten zoals bacteriën, pleomorfe virussen en eukaryote cellen3. In cryo-ET wordt driedimensionale (3D) informatie verkregen door het monster fysiek op het microscoopstadium te kantelen en een reeks beelden onder verschillende hoeken door het monster te verkrijgen. Deze beelden, of tilt-series, bestrijken vaak een bereik van +60/-60 graden in stappen van één tot drie graden. De tilt-serie kan vervolgens computationeel worden gereconstrueerd tot een 3D-volume, ook wel tomogram4 genoemd.
Alle cryo-EM-technieken vereisen dat het monster wordt ingebed in een dunne laag amorf, niet-kristallijn glasachtig ijs. Een van de meest gebruikte cryofixatietechnieken is plunge freezing, waarbij het monster op het EM-rooster wordt aangebracht, uitgeveegd en snel wordt ondergedompeld in vloeibaar ethaan of een mengsel van vloeibaar ethaan en propaan. Deze techniek is voldoende voor de vitrificatie van monsters van <100 nm tot ~10 μm dik, inclusief gekweekte menselijke cellen, zoals HeLa-cellen5,6. Dikkere monsters, zoals mini-organoïden of weefselbiopten, tot 200 μm dik, kunnen worden verglaasd door hogedrukbevriezing7. Vanwege de toegenomen elektronenverstrooiing van dikkere monsters is de monster- en ijsdikte voor cryo-ET echter beperkt tot ~ 0,5 - 1 μm in 300 kV transmissie-elektronenmicroscopen. Daarom is cryo-ET voor hele cellen van veel eukaryote cellen beperkt tot de celrand of uitbreidingen van cellen, tenzij aanvullende monstervoorbereidingsstappen worden gebruikt, zoals cryo-sectioning8 of focused-ion beam milling9,10,11.
Een beperking van veel cryo-ET-beeldvormingsexperimenten met hele cellen is de doorvoersnelheid van gegevensverzameling12. In tegenstelling tot cryo-EM met één deeltje, waar duizenden geïsoleerde deeltjes vaak kunnen worden afgebeeld vanuit een enkel TEM-rastervierkant, zijn cellen groot, verspreid en moeten ze met een voldoende lage dichtheid worden gekweekt om de cellen te kunnen bewaren in een dunne laag glasachtig ijs. Vaak is het gebied van belang beperkt tot een bepaald kenmerk of deelgebied van de cel. Verdere beperking van de doorvoer is de neiging van cellen om te groeien op gebieden die niet vatbaar zijn voor TEM-beeldvorming, zoals op of in de buurt van TEM-rasterbalken. Vanwege onvoorspelbare factoren die verband houden met celcultuur op TEM-rasters, zijn technologische ontwikkelingen nodig om de toegankelijkheid en doorvoer van monsters voor gegevensverzameling te verbeteren.
Substraatmicropatterning met aanhangende extracellulaire matrix (ECM) eiwitten is een gevestigde techniek voor live-cell lichtmicroscopie om de groei van cellen op stijve, duurzame en optisch transparante oppervlakken zoals glas en andere weefselkweeksubstraten te sturen13,14. Micropatterning is ook uitgevoerd op zachte en/of driedimensionale (3D) oppervlakken. Dergelijke technieken hebben niet alleen de precieze positionering van cellen mogelijk gemaakt; ze hebben ook de creatie van meercellige netwerken ondersteund, zoals patroonvormige neurale celcircuits15. Het brengen van micropatterning naar cryo-ET zal niet alleen de doorvoer verhogen, maar het kan ook nieuwe studies openen voor het verkennen van complexe en dynamische cellulaire micro-omgevingen.
Onlangs zijn verschillende groepen begonnen met het gebruik van micropatterningtechnieken op TEM-rasters via meerdere benaderingen16,17. Hier wordt het gebruik van een maskerloze fotopatterningtechniek voor TEM-rasters beschreven met behulp van het Alvéole PRIMO-micropatterningsysteem, dat beschikt over hoge resolutie en contactloze patronen. Met dit micropatterningsysteem wordt een aangroeiwerende laag aangebracht op de bovenkant van het substraat, gevolgd door het aanbrengen van een fotokatalysator en ablatie van de aangroeiwerende laag in door de gebruiker gedefinieerde patronen met een UV-laser. ECM-eiwitten kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de patronen voor de juiste celkweek. Deze methode is door verschillende groepen gebruikt voor cryo-ET-studies van retinale pigmentepitheel-1 (RPE1), Madin-Darby canine kidney-II (MDCKII), humane voorhuidfibroblast (HFF) en endotheelcellijnen16,17,18. Dit micropatterningsysteem is compatibel met meerdere aangroeiwerende laagsubstraten en met een vloeibaar of gelfotokatalysatorreagens. Een verscheidenheid aan ECM-eiwitten kan worden geselecteerd uit en aangepast aan de specificiteit van de cellijn, waardoor veelzijdigheid voor de gebruiker wordt verleend.
Micropatterning is succesvol toegepast op een aantal projecten binnen het laboratorium19. Hier wordt een micropatterningprotocol gepresenteerd, inclusief specifieke aanpassingen om gekweekte HeLa-cellen, respiratoir syncytieel virus (RSV)-geïnfecteerde BEAS-2B-cellen en primaire larvale Drosophila melanogaster-neuronen20 te bestuderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is een krachtige technologie die wordt gebruikt om resolutiestructuren op nanometerniveau te produceren van macromoleculen die aanwezig zijn in de cellulaire context en bewaard blijven in een bijna inheemse bevroren gehydrateerde toestand. Er zijn echter uitdagingen verbonden aan het kweken en / of hechten van cellen op TEM-rasters op een manier die geschikt is voor tomografie met behoud van de cellen in hun fysiologische toestand. Hier wordt een gedetailleerd stapsgewijs protocol gepresenteerd over het gebruik van micropatterning om eukaryote celgroei op TEM-rasters te sturen en te bevorderen. Tijdens micropatterning wordt de celgroei gestuurd door extracellulaire matrix (ECM) eiwitten af te zetten binnen gespecificeerde patronen en posities op de folie van het TEM-raster, terwijl de andere gebieden bedekt blijven met een aangroeiwerende laag. Flexibiliteit in de keuze van oppervlaktecoating en patroonontwerp maakt micropatterning breed toepasbaar voor een breed scala aan celtypen. Micropatterning is nuttig voor studies van structuren in individuele cellen, evenals meer complexe experimentele systemen zoals gastheer-pathogeen interacties of gedifferentieerde multicellulaire gemeenschappen. Micropatterning kan ook worden geïntegreerd in veel downstream cryo-ET-workflows voor hele cellen, waaronder correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (cryo-CLEM) en focused-ion beam milling (cryo-FIB).

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Het doel van dit protocol is om celadhesie en -groei te richten op gerichte gebieden van rasters voor cryo-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door een aangroeiwerende laag aan te brengen die wordt opgeblazen in door de gebruiker gespecificeerde patronen, gevolgd door afzetting van extracellulaire matrixeiwitten in de patroongebieden voorafgaand aan het zaaien van cellen.

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Ons onderzoeksteam ontwikkelt technologieën en protocollen voor cryo-elektronenmicroscopie en cryo-elektronentomografie. We hebben protocollen ontwikkeld voor het micropatriëren van TEM-rasters om celgroei en positionering voor cryo-ET-experimenten te sturen. Hele-cel cryo-elektronentomografie wordt gebruikt om resolutiestructuren op nanometerniveau van macromoleculaire complexen te produceren in cellen die bewaard zijn gebleven in een inheemse bevroren gehydrateerde toestand.Micropatterning kan de doorvoer van cryo-ET voor hele cellen, cryo-correlatieve lichtelektronenmicroscopie en cryo-gerichte ionenbundelfreesexperimenten verhogen. Het aantal en de verdeling van cellen op EM-rasters zijn cruciaal voor cryo-ET-studies met hele cellen. Dit protocol biedt een snelle, reproduceerbare en breed aanpasbare methode om celgroei op EM-rasters te sturen door middel van micropatterning.De onderzoeker moet zich comfortabel voelen bij het gebruik van pipetten, pincetten, basiscelkweektechnieken en fluorescentie- en transmissie-elektronenmicroscopen. Gebruik bij het voor de eerste keer patroonvorming een bekende celtype- en ECM-combinatie en test ze op coverslips of MatTek-schotels. Leden van het onderzoeksteam die betrokken zijn bij deze protocolontwikkeling zijn:Dr.Brian Sibert, Mr.Joseph Kim en Dr.Jae Yang. Breng om te beginnen de roosters over naar een netvoorbereidingshouder en gloei de koolstof van de roosters naar boven. Breng vervolgens de roosters met de koolstofzijde over naar een schone glazen schuif of afdekplaat met ten minste één centimeter afstand tussen de roosters.Pipetteer 10 microliter van 0,05 poly-L-lysine op elk rooster en incubeer de roosters in een vochtige kamer gedurende ten minste 30 minuten. Was na incubatie elk rooster driemaal met 15 microliter van 0,1 molaire HEPES bij pH 8,5. Incubeer het rooster in elke wasbeurt gedurende 30 seconden en verwijder vervolgens het grootste deel van de vloeistof van het rooster met een pipet zonder het rooster te laten drogen.Laat na de laatste wasbeurt elk rooster in 15 microliter van 0,1 kies HEPES. Bereid vervolgens de PEG-SVA-oplossing voor en vervang de HEPES-oplossing onmiddellijk op de roosters door 10 microliter van de PEG-SVA-oplossing en incubeer de roosters vervolgens gedurende ten minste één uur in een vochtige kamer. Was na incubatie elk rooster drie keer met 15 microliter steriel water en incubeer het rooster in elke was gedurende 30 seconden.Laat na de laatste wasbeurt elk rooster in 15 microliter water staan. Plaats een druppel water van één microliter op het midden van een nieuwe schone afdekplaat en breng vervolgens voorzichtig het rooster over van de waterdruppel van 15 microliter naar de druppel op de nieuwe afdekplaat met de koolstofzijde naar boven. Plaats vervolgens voorzichtig het PDMS-stencil over het raster om het raster gecentreerd te houden en het stencilcontact met de koolstoffolie van het raster tot een minimum te beperken.Voeg vervolgens een microliter PLPP-gel toe aan het rooster en pipetteer voorzichtig om te mengen. Verplaats de coverslip met het rooster naar een donkere locatie om te drogen. De gel droogt in 15 tot 30 minuten.Voor micropatterning opent u de software met een live Brightfield-weergave vanaf de microscoop. Als u een nieuwe sjabloon wilt ontwerpen voor een eerste uitvoering, selecteert u ROI toevoegen en kiest u een cirkel van 3.000 micrometer. Plaats de ROI van de cirkel over het raster met behulp van de Brightfield-afbeelding op het scherm als leidraad en druk vervolgens op Vergrendelen om de ROI te beveiligen.Nadat u de ROI op zijn plaats hebt vergrendeld, selecteert u Patroon toevoegen en kiest u het juiste patroon. Genereer met behulp van de replicatieopties kopieën van het initiële patroon om een vierkant gebied van acht bij acht rasters te maken. Pas de afstand en hoek zo nodig aan om de patronen uit te lijnen met de rastervierkanten.Plaats het patroon in een hoek van het raster. Dupliceer vervolgens het patroon en plaats een kopie in elk van de vier hoeken van het raster en verplaats de microscooptrap indien nodig voor elk gebied. Gebruik de replicatieopties om een vierkant gebied van acht bij acht rasters te wijzigen in een vierkant gebied van twee bij acht rasters dat aan beide zijden van het midden moet worden geplaatst.Laat de middelste vier rastervierkanten ongeparfumeerd. Pas voor elk patroon indien nodig de totale dosis aan. 30 millijoules per vierkante millimeter is een goed uitgangspunt.Herhaal onder Expertopties het aanpassen van de hoek, positie, ruimte tussen en verhouding van het patroon om de uitlijning van het patroon met de rastervierkanten te verfijnen. Verplaats de microscooptrap om het rastergebied in het Brightfield-display te wijzigen. Zodra de sjabloon en patronen zijn gepositioneerd, schakelt u op één na alle regio's in het actievenster van de software uit.Gebruik de microscoopfase om naar dat gebied te navigeren en concentreer je op de koolstoffolie. Klik op het oogbolpictogram in het actiepaneel om de patroonoverlayweergave uit te schakelen. Zodra het raster scherp is, sluit u de Brightfield-sluiter en drukt u op het pictogram Afspelen in de rechterbenedenhoek van de software om het patroonproces te starten, dat live kan worden gevolgd.Herhaal deze stap totdat alle regio's zijn gemodelleerd. Verwijder ten slotte de coverslip met het rooster uit de microscoop en voeg onmiddellijk 10 microliter steriel PBS toe aan het rooster. Verwijder na 10 minuten het stencil met een pincet, was het rooster vervolgens drie keer met 15 microliter PBS en laat elk rooster in PBS op een donkere locatie staan.Bereid 15 microliter van de extracellulaire matrix voor elk raster, vervang vervolgens de PBS van elk raster door 15 microliter van de extracellulaire matrix en incubeer het rooster gedurende ten minste één uur in een vochtige kamer. Was na incubatie elk rooster vijf keer met 15 microliter steriel PBS zoals eerder aangetoond. Laat na de laatste wasbeurt elk rooster in PBS staan.Detecteer met behulp van een fluorescentiemicroscoop de fluorofoor in de extracellulaire matrix om patronen te bevestigen en dat de koolstoffolie intact blijft. HeLa-cellen gezaaid op microgepatterde en ongepatterde TEM-rasters zijn zichtbaar door fluorescerende kleuring met behulp van een op calceïne AM en ethidium homodimer-1 gebaseerde cel levensvatbaarheidstest. Met behulp van een gemengde collageen en fibrinogeen extracellulaire matrix, HeLa cellen gemakkelijk hechten aan patronen over het raster.De algemene morfologie van cellen die zich langs het patroon uitbreidden, is vergelijkbaar met die van cellen die op ongepatterde rasters zijn gegroeid. Een Brightfield-afbeelding van RSV-geïnfecteerde BEAS-2B-cellen 18 uur na het zaaien toont celadhesie en groei langs het centrale gebied van het patroon. De meeste geïnfecteerde cellen bevinden zich langs het centrale gebied met hogere dichtheid van het gradiëntpatroon.De RSV-varianten bevinden zich dicht bij de periferie van de geïnfecteerde BEAS-2B-cellen die op microgepatterde rasters worden gekweekt. Veel RSV structurele eiwitten worden geïdentificeerd in de tomogrammen, waaronder het nucleocapside en virale fusie-eiwit. Op microgepatterde rasters kunnen Drosophila-neuronen met pan-neuronale GFP-expressie gemakkelijk worden gevolgd door lichtmicroscopie vanwege fluorescerende etikettering en hun locatie binnen de micropatronen.Neuronen op ongepatterde rasters kunnen ook worden gevolgd via GFP-signalering door lichtmicroscopie. Het lokaliseren ervan in cryo-elektronenmicroscopie wordt echter moeilijk vanwege cellulair puin en verontreiniging door de media. Vanwege de afmetingen van het neuroncellichaam en uitgebreide neurieten, worden cryo-elektron tomografie tilt series verzameld langs dunnere gebieden van de cellen met een hogere vergroting.Het neuronale celmembraan, mitochondriën, microtubuli, actinefilamenten, vesiculaire structuren en macromoleculen zoals ribosomen worden goed opgelost in hogere vergrotingsbeeldmontages en plakjes door het 3D-tomogram. Vergelijkbare subcellulaire kenmerken worden waargenomen van 3D-tomogrammen van niet-gepatterde neuronen. Het aanbrengen van het stencil op het rooster en het toevoegen van de PLPP-gel is de meest gevoelige stap die de patroonresultaten kan beïnvloeden en moet met voorzichtigheid worden gedaan.Cryo-CLEM kan worden gebruikt om interessante doelen in cellen te lokaliseren voor cryo-ET-gegevensverzameling. Cryo-FIB-SEM kan worden gebruikt om cellen te verdunnen op gebieden die anders te dik zijn voor gegevensverzameling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snelle rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste cryo-elektronenmicroscopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Het extraheren van gemodificeerde microtubuli uit zoogdiercellen om microtubuli-eiwitcomplexen te bestuderen door cryo-elektronenmicroscopie

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Toepassing van monolaag grafeen op cryo-elektronenmicroscopieroosters voor structuurbepaling met hoge resolutie

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

Monstervoorbereiding voor in situ cryotomografie van zoogdiercellen

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...