Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

אנו מודים לד"ר ג'יל ווילדונגר, ד"ר סיהוי ז. יאנג, וגברת ג'וזפין ו. מיטשל במחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת ויסקונסין, מדיסון על שיתוף נדיב של אלב-גל4, UAS-CD8::GFP זן זבובים (מרכז מלאי בלומינגטון, #5146). ברצוננו גם להודות לד"ר אורליאן דובוין, מר לורנט סיקייר, וגברת מארי-שרלוט מאנוס מאלבול ומר סרג' קדורה ממעבדות ננומטרי על תמיכתם הנדיבה במהלך פרויקט זה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי אוניברסיטת ויסקונסין, מדיסון, המחלקה לביוכימיה באוניברסיטת ויסקונסין, מדיסון, ושירות בריאות הציבור מעניק R01 GM1114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1, ו U24 GM139168 ל- E.R.W. ו R01 AI150475 ל- P.W.S. מה- NIH. חלק ממחקר זה נתמך על ידי מענק NIH U24 GM129547 ובוצע ב- PNCC ב- OHSU ונגיש באמצעות EMSL (רשת.436923.9), משרד DOE של מתקן משתמש מדעי בחסות המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי. אנו מודים גם על השימוש במתקנים ומכשורים במרכז המחקר Cryo-EM במחלקה לביוכימיה באוניברסיטת ויסקונסין, מדיסון.

<ol>
	<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM:+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity.">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+electron+crystallography+of+2D+crystals+to+MicroED+of+3D+crystals.">From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals.</a> Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-the+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>B&#228;uerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+native+Drosophila+tissues+vitrified+by+plunge+freezing.">Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing.</a> bioRxiv. , 437159 (2021).</li><li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells.">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).</li><li>Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+Electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).</li><li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> Elife. 8, 45919 (2019).</li><li>Wu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+neuronal+networks.">Micropatterning neuronal networks.</a> Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+micropatterning+technology+for+whole+cell+cryogenic+electron+microscopy+studies.">Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+micropatterning+for+cryo-electron+tomography+studies+of+cell-cell+contacts.">Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts.</a> bioRxiv. , 272237 (2021).</li><li>Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+cryo-electron+tomography+of+cultured+and+primary+eukaryotic+cells+on+micropatterned+TEM+grids.">Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids.</a> bioRxiv. , 447251 (2021).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons.">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+assembly+of+respiratory+syncytial+virus+revealed+by+cryo-electron+tomography.">The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography.</a> Viruses. 10 (8), (2018).</li><li>Stobart, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+RSV+vaccine+with+engineered+thermostability+is+immunogenic+in+cotton+rats+despite+high+attenuation.">A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation.</a> Nature Communications. 7, 13916 (2016).</li><li>Hotard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stabilized+respiratory+syncytial+virus+reverse+genetics+system+amenable+to+recombination-mediated+mutagenesis.">A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis.</a> Virology. 434 (1), 129-136 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+virus+assembly+and+organization+by+the+measles+virus+matrix+protein.">Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein.</a> Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).</li><li>Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+situ+neuronal+model+for+cryo-ET.">A new in situ neuronal model for cryo-ET.</a> Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition.">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+method+for+cryo-electron+tomography:+Characterizing+stage+behavior+during+FISE+acquisition.">Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).</li><li>Anderson, D. E., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+micropatterning:+methods,+effects,+and+applications.">Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications.</a> Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+components+for+cell+culture.">Use of extracellular matrix components for cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).</li><li>Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy.">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).</li><li>Schellenberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+correlative+fluorescence+and+electron+cryo+microscopy+using+two+independent+alignment+markers.">High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers.</a> Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מיקרוסקופ אלקטרונים וחבילות תוכנה מודרניות ומתקדמות תומכות כעת באיסוף נתוני קריו-EM והקפאה-ET אוטומטיים יעילים שבהם ניתן לפלח ולדמיין מאות עד אלפי משרות בתוך ימים ספורים32,33,33,34,35. אחד הגורמים המגבילים המשמעותיים לזרימות עבודה של קריו-ET של תאים שלמים היה השגת מספר מספיק של יעדי אספנות לכל רשת. לאחרונה, מספר קבוצות פיתחו פרוטוקולים עבור רשתות micropatterning עבור cryo-EM, עם יתרון אחד להיות יעילות איסוף נתונים משופרת16,17,18. כאן מוצג פרוטוקול לשימוש במערכת micropatterning זמינה מסחרית לרשתות TEM micropattern למחקרי קריו-ET של נוירונים Drosophila ראשוניים וקווי תאים אנושיים מתורבתים (נגועים או נגועים RSV). מערכת micropatterning זו היא רב-תכליתית וניתן למטב שלבים רבים ולהתאים אותם כך שיתאימו למטרות ניסיוניות ספציפיות. משתמש עם ניסיון במיקרוסקופיה של TEM ופלואורסצנטיות יכול להיות מיומן במהירות בהכנת רשת ובמיקרו-פצפוצים. עם תרגול זהיר, תוצאות טובות צריכות להיות ברות השגה לאחר כמה איטרציות. להלן, חלק מהאפשרויות הזמינות, שיקולי משתמש, יתרונות פוטנציאליים, ויישומים עתידיים של micropatterning עבור cryo-EM נדונים.
אחד השיקולים החשובים עבור קריו-ET תא שלם הוא בחירת רשת EM. רשתות EM מורכבות משני חלקים: מסגרת רשת שינוי (או תמיכה מבנית) ונייר הכסף (או הסרט), שהוא משטח הסרט הרציף או החורי שעליו יגדלו התאים. רשתות רשת נחושת משמשות בדרך כלל להקפאה-EM של חלבונים ומתחמים מבודדים. עם זאת, הם אינם מתאימים להקפאה-ET של תאים שלמים בשל הציטוטוקסיות של נחושת. במקום זאת, רשת זהב משמשת בדרך כלל לטומוגרפיה תאית. אפשרויות אחרות כוללות ניקל או טיטניום, אשר עשוי לספק יתרונות על פני זהב כגון קשיחות מוגברת16. רשתות EM זמינות עם מידות רשת שינוי שונות כדי לתמוך במגוון יישומים. גדלי רשת גדולים יותר מספקים יותר מקום לתאים לגדול בין סרגלי רשת ואזורים נוספים הניתנים לאיסוף סדרות הטיה, אם כי במחיר של שבריריות דגימה כוללת מוגברת. רדיד הכסף הנפוץ ביותר הוא פחמן אמורפי מחורר או חורי, כגון Quantifoils או רשתות C שטוחות. ניתן לדמיין מטרות ביולוגיות דרך החורים בפחמן או דרך הפחמן שקוף האלקטרונים. רשתות כגון R 2/1 או R 2/2, שבו החורים הם 2 מיקרומטר רוחב כי הם מרווחים 1 ו 2 מיקרומטר זה מזה בהתאמה, לספק מספר רב של חורים ובכך מספר רב של אזורים פוטנציאליים לאיסוף נתונים. עם זאת, תאים מסוימים עשויים לגדול ולהתרחב טוב יותר על משטחים אחידים יותר כגון רשתות R 1.2/20 או פחמן רציף. לעיבוד מדגם במורד הזרם על ידי כרסום קרן יונים ממוקד (קריו-FIB), נייר הכסף מוסר באמצעות כרסום, מה שמפחית את החששות לגבי המשך הנוכחות של הסרט הבסיסי. כמו עם הרשת, רדידים מחומרים אחרים זמינים גם, עם פרוטוקול דפוס המוצג כאן להיות מתאים באותה מידה עבור רשתות SiO2 . רשתות נפוצות כוללות Quantifoil זהב, פחמן רציף, או SiO2 סרט 200-רשת רשתות (~ 90 מיקרומטר מרווח בין סרגלי רשתות) עבור קריו-ET של תאים שלמים.
ישנם מספר שיקולים בעת עיצוב תבנית. רוב ההחלטות הללו מונחות על ידי סוג התא ומטרתו של הניסוי. נקודת התחלה טובה היא לבחור תבנית שמעריכה את הצורה והממדים של התאים בתרבית. מחקרים רבים הראו השפעות משמעותיות של צורת דפוס על צמיחת התאים וסידור ציטו-שלד13,36,37. יש לנקוט בזהירות מיוחדת במהלך עיצוב דפוס אם זה יכול לשנות את היעד של עניין. מספר דפוסים עבור כל סוג תא נבדקו כדי לקבוע אילו דפוסים קידמו הידבקות וצמיחה תאית. הגמישות של מערכת micropatterning מאפשרת בדיקה של דפוסים מרובים על רשת אחת ושינוי דפוסים עבור רשתות שונות בתוך ניסוי אחד. דפוסים גדולים יותר (~ 50-90 מיקרומטר), כגון אלה המשמשים כאן, להגדיל את הסבירות כי תאים מרובים לדבוק באזור אחד של התבנית ולאפשר לתאים להרחיב ולהאריך לאחר הידבקות. דפוסים מוגבלים יותר (20-30 מיקרומטר) עשויים להיות מתאימים בניסויים שבהם בידוד תאים הוא קריטי יותר מאשר הרחבת תאים, כגון לניסויים ממוקדים של כרסום קרן יונים (קריו-FIB). עבור יישומי טומוגרפיה, ייתכן שיהיה צורך לשקול את ההשפעה של ציר ההטיה. אם תבנית ממוקמת כך שכל התאים גדלים במקביל זה לזה בכיוון אחד, ייתכן שכל התאים יהיו מאונכים לציר ההטיה כאשר הם נטענים על במת המיקרוסקופ, וכתוצאה מכך איכות נמוכה יותר של נתונים.
ברשתות לא מרוסנות, תאים לעתים קרובות מעדיפים לדבוק בפסי הרשת, שם לא ניתן לדמיין אותם על-ידי TEM. אפילו על רשתות בדוגמת דפוס, תאים נצפים לעתים קרובות להיות ממוקם בפינות של ריבועי רשת חלקית על רדיד פחמן דפוס וסרגל רשת. לאחרונה, micropatterning שימש בכוונה למקם חלק מהתא מעל סרגל הרשת18. זה יכול להיחשב לניסויים שבהם זה לא קריטי יש פריפריה התא כולו על נייר הכסף. זה יכול להיות חשוב במיוחד עבור תאים שיכולים לגדול גדול יותר מאשר ריבוע רשת יחיד, כגון נוירונים ראשוניים גדל על פני מספר ימים.
ישנם כלים רבים שניתן להשתמש בהם לעיצוב תבנית. כאן, התבנית הוגבלה לפחות מ-800 פיקסלים בכל ממד, כך שניתן לסובב את התבנית לכל זווית ועדיין להתאים אותה לאזור המרבי שיכול להיות מעוצב בהקרנה אחת על ידי מערכת מיקרו-פצפוצים זו. זה מאפשר למשתמש לסובב את התבנית כדי להיות מכוון כראוי עם הרשת ללא קשר לכיוון הרשת במיקרוסקופ. כאן, הרשת חולקה לשישה אזורי דפוס. בראש ובראשונה, הדבר מאפשר התאמת מוקד בין אזורים שונים של הרשת. רשתות זהב, בפרט, הן נזילות מאוד ולא יכול לשכב לגמרי שטוח על הזכוכית. מיקוד נכון חיוני לתוצאות תבניות נקיות ומעודנות. על-ידי שימוש בתבניות מפולחות, יש לבצע רק התאמות קלות למיקום התבנית אם הרשת משתנה מעט במהלך תהליך התבנית, אם כי בדרך כלל זו אינה בעיה בעת שימוש בג'ל PLPP עם סטנסילים PDMS. לבסוף, ארבעת ריבועי הרשת המרכזיים של הרשת נותרו לא מרוסנים. זה תומך משתמש להיות מסוגל לזהות בבירור את מרכז הרשת, וזה מאוד שימושי עבור ניסויי הדמיה מתאם.
תוכנת דפוס עבור מערכת micropatterning זו, לאונרדו, יש גם תכונות מתקדמות יותר כגון תפירה ואת היכולת לייבא דפוסים כמו מסמכי PDF, אשר מעבר להיקף של פרוטוקול זה. תוכנה זו כוללת גם זיהוי מיקרו-מבנים ומיקום דפוס אוטומטי שניתן להשתמש בו ברשתות TEM. תכונה זו שימושית ביותר כאשר הרשת שטוחה מאוד וניתן לעצב אותה ללא צורך להתאים את המוקד בין אזורים שונים.
בחירת חלבון ECM יכולה להשפיע באופן משמעותי על הידבקות והתרחבות התאים. תאים מסוימים ידועים לעבור שינויים פיזיולוגיים כאשר גדל על מצעים ספציפיים38. חלבונים וריכוזים מרובים של ECM נבדקו עבור כל סוג תא חדש בהתבסס על עבודה קודמת שדווחה בספרות. למינין, פיברינוגן, פיברונקטין וקולגן נמצאים בשימוש נרחב עבור תאים בתרבית וניתן להשתמש בהם כנקודת התחלה אם נתונים אחרים אינם זמינים. עם זאת, חלבוני ECM אחרים חייבים להיחשב גם אם חלבוני ECM הנפוצים אינם מצליחים להעניק תכונות דבקות נאותות לתאים. זה היה נכון במיוחד עבור נוירונים Drosophila העיקריים, כמו ריכוז גבוה של הצמח lectin concanavalin A היה הכרחי לדבקות תאית נכונה. התאימות של הידבקות סלולרית וצמיחה עם ECM ניתן לבדוק על ידי דפוס על צלחות זכוכית או שקופיות לפני המעבר לרשתות TEM. גישת טרום הקרנה זו היא זמן וחסכוני אם יש צורך לבחון מספר רב של שילובים. הכללת חלבון ECM מצומד פלואורסצנטי היא בעלת ערך להערכת ההצלחה והאיכות של דפוסי דפוס.
זריעת תאים היא אחד השלבים החשובים ביותר עבור קריו-ET תא שלם, עם או בלי micropatterning6,16,39. עבור Drosophila העיקרי או נוירונים אחרים, אשר שבירים, לא יציבים בהשעיה, ועשויים להיות מוגבלים בכמות, גישות זריעה בודדות עדיפות על פני זריעת תאים מנוטרת ורציפה. שלב זריעה יחיד בצפיפות תאים ממוטבת, כמתואר בפרוטוקול עבור נוירונים Drosophila, הוא אפשרות מעשית עבור רוב סוגי התאים. עם זאת, ניתן גם לזרוע תאים על המצע בריכוז ראשוני נמוך יותר ולהוסיף תאים נוספים בצורה מנוטרת כמתואר כאן ובספרות אחרת18. זריעה רציפה זו יכולה לספק תוצאות עקביות יותר במקרים מסוימים. בדומה לתרבות תאים סטנדרטית, תמיד יש להקפיד לשמור על כדאיות התא ולמזער את גושי התאים במהלך הבידוד.
כאשר מתחילים לראשונה עם micropatterning, יש כמה מלכודות פוטנציאליות כי הם מזיקים לתוצאה הסופית. טיפול זהיר ברשת וטכניקה סטרילית, הפצה אחידה של ג'ל PLPP, מינון ומיקוד נכונים במהלך דפוס, ושמירה על הכדאיות של התא לפני זריעה הם בין השיקולים החשובים ביותר להצלחה. רשימה של חלק מהבעיות הפוטנציאליות וכן פתרונות הורכבו בטבלה 1.
ניתן להשתמש ברשתות micropatterned כדי לסייע במיקום תאים כדי ליצור צפיפות תאים עקבית ברחבי הרשת ולמקם אזורי עניין באזורים המתאימים לאיסוף סדרת הטיה16,18. המיקום והמיצוב של תאים יכול לשמש כסמנים fiducial למתאם בניסויים קריו-CLEM, הפחתת הצורך ברשתות תיווך פתיל שבירות סמנים fiducial פלואורסצנטי. עם זאת, יש לציין כי סמנים fiducial כאלה עדיין עשויים להיות שימושיים עבור מתאם דיוק תת מיקרומטר29,40. יתר על כן, התפלגות אחידה של תאים מבודדים מועילה מאוד גם לניסויי כרסום קרן מיקוד-יון (קריו-FIB) כדי למקסם את מספר התאים שמהם ניתן לחתוך lamella16.
התוספת של מיקרו-מפזרינג לזרימות עבודה של קריו-EM תגרום לשיפורים מדידים בתפוקת הנתונים ועשויה לאפשר ניסויים חדשים. ככל שהטכניקה מאומצת ומפותחת עוד יותר, יישומים מתקדמים יותר של מיקרו-פטרנינג כולל שיפועי ECM, תצהירי ECM מרובים והרכבת מיקרו-מבנה ירחיבו עוד יותר את היכולות של cryo-ET ללמוד מטרות ותהליכים ביולוגיים בהקשר תאי מלא.

עם ההתפתחות, ההתרחבות והרב-תכליתיות של מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM), החוקרים בחנו מגוון רחב של דגימות ביולוגיות במצב כמעט מקומי ממקרומולקולרי (~ 1 ננומטר) ועד רזולוציה גבוהה (~ 2 Å). טכניקות הקפאה-EM ועקיפת אלקטרונים של חלקיקים בודדים מוחלות בצורה הטובה ביותר על מקרומולקולות מטוהרות בתמיסה או במצב גבישי, בהתאמה 1,2. בעוד טומוגרפיה קריו-אלקטרונים (קריו-ET) מתאימה באופן ייחודי למחקרים מבניים ואולטרה-מבניים כמעט מקומיים של עצמים הטרולוגיים גדולים כגון חיידקים, וירוסים פלומורפיים ותאים אוקריוטים3. בהקפאה-ET, מידע תלת מימדי (3D) מתקבל על ידי הטיה פיזית של המדגם על במת המיקרוסקופ ורכישת סדרה של תמונות דרך המדגם בזוויות שונות. תמונות אלה, או סדרת הטיה, מכסות לעתים קרובות טווח של +60/-60 מעלות במרווחים של דרגה אחת עד שלוש מעלות. לאחר מכן ניתן לשחזר את סדרת ההטיה באופן חישובי לאמצעי אחסון תלת-ממדי, הידוע גם בשם טומוגרמה4.
כל טכניקות ההקפאה-EM דורשות שהדגימה תהיה מוטבעת בשכבה דקה של קרח אמורפי, לא גבישי, זגוגי. אחת מטכניקות ההקפאה הנפוצות ביותר היא הקפאת צלילה, שם המדגם מוחל על רשת EM, מוכתם, וצולל במהירות לתוך אתאן נוזלי או תערובת של אתאן נוזלי פרופן. טכניקה זו מספיקה עבור vitrification של דגימות מ 100 ננומטר < ~ 10 מיקרומטר בעובי, כולל תאים אנושיים בתרבית, כגון תאי HeLa5,6. דגימות עבות יותר, כגון מיני אורגנוידים או ביופסיות רקמות, בעובי של עד 200 מיקרומטר, יכולות להיות vitrified על ידי הקפאה בלחץ גבוה7. עם זאת, בשל פיזור אלקטרונים מוגבר של דגימות עבות יותר, מדגם ועובי קרח עבור cryo-ET מוגבל ~ 0.5 - 1 מיקרומטר ב 300 kV שידור מיקרוסקופים אלקטרונים. לכן, קריו-ET של תאים של תאים שלמים של תאים אוקריוטים רבים מוגבל לפריפריה של התא או הרחבות של תאים אלא אם כן נעשה שימוש בשלבי הכנה מדגם נוספים, כגון cryo-sectioning8 או כרסום קרן יון ממוקדת9,10,11.
מגבלה של ניסויים רבים בהדמיית קריו-ET של תאים שלמים היא תפוקת איסוף נתונים12. שלא כמו cryo-EM חלקיק יחיד, שבו אלפי חלקיקים מבודדים לעתים קרובות ניתן לדמיין מתוך ריבוע רשת TEM יחיד, תאים הם גדולים, להתפשט, ויש לגדל בצפיפות נמוכה מספיק כדי לאפשר את התאים להישמר בשכבה דקה של קרח זגוגית. לעתים קרובות אזור העניין מוגבל לתכונה מסוימת או לאזור משנה מסוים של התא. תפוקה מגבילה נוספת היא הנטייה של תאים לגדול באזורים שאינם נוחים להדמיית TEM, כגון בסרגלי רשת TEM או בקרבתם. בשל גורמים בלתי צפויים הקשורים לתרבות התאים ברשתות TEM, יש צורך בפיתוחים טכנולוגיים כדי לשפר את הנגישות והתפוקה לדוגמה לרכישת נתונים.
מיקרו-פסטיבל מצע עם חלבוני מטריצה חוץ-תאית דבקים (ECM) היא טכניקה מבוססת היטב למיקרוסקופיה של אור חי כדי לכוון את צמיחת התאים על משטחים קשיחים, עמידים ושקופים אופטית כגון זכוכית ומצעים אחרים של תרבית רקמות 13,14. Micropatterning בוצע גם על משטחים רכים ו /או תלת מימדיים (3D). טכניקות כאלה לא רק אפשרו מיקום מדויק של תאים; הם גם תמכו ביצירת רשתות רב-תאיות, כגון מעגלי תאים עצביים בדפוס15. הבאת micropatterning כדי cryo-ET לא רק להגדיל את התפוקה, אבל זה יכול גם לפתוח מחקרים חדשים לחקר microenvironments הסלולר מורכב ודינמי.
לאחרונה, מספר קבוצות החלו להשתמש בטכניקות micropatterning ברשתות TEM באמצעות גישות מרובות16,17. כאן, השימוש בטכניקת photopatterning ללא מסכה עבור רשתות TEM מתואר באמצעות מערכת micropatterning Alvéole PRIMO, הכוללת תבניות ברזולוציה גבוהה וללא מגע. עם מערכת micropatterning זו, שכבה נגד עכירות מוחלת על החלק העליון של המצע, ואחריו היישום של photocatalyst אבלציה של שכבת אנטי עכירות בדפוסים המוגדרים על ידי המשתמש עם לייזר UV. לאחר מכן ניתן להוסיף חלבוני ECM לתבניות של תרבית התאים המתאימה. שיטה זו שימשה מספר קבוצות למחקרי קריו-ET של אפיתל הפיגמנט הרשתית-1 (RPE1), מאדין-דארבי כלב כליות-II (MDCKII), פיברובלסט עורלה אנושית (HFF), וקווי תאי אנדותל16,17,18. מערכת micropatterning זו תואמת עם מצעים מרובים נגד עכירות שכבה, כמו גם ריאגנט פוטוקטליסט נוזלי או ג'ל. ניתן לבחור מגוון חלבוני ECM ולהתאים אותם לספציפיות של קו התא, המעניקים רב-תכליתיות למשתמש.
Micropatterning יושם בהצלחה על מספר פרויקטים בתוך המעבדה19. כאן, פרוטוקול micropatterning מוצג, כולל התאמות ספציפיות ללמוד תאי HeLa מתורבתים, וירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV) נגוע BEAS-2B תאים, נוירונים זחל ראשי Drosophila melanogaster20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

טומוגרפיה של קריו-אלקטרון של תאים שלמים (cryo-ET) היא טכנולוגיה רבת עוצמה המשמשת לייצור מבני רזולוציה ברמת ננומטר של מקרומולקולות הנמצאות בהקשר התאי ונשמרות במצב כמעט מקורי של לחות קפואה. עם זאת, ישנם אתגרים הקשורים פולחן ו /או הדבקת תאים ברשתות TEM באופן המתאים טומוגרפיה תוך שמירה על התאים במצבם הפיזיולוגי. כאן, פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד מוצג על השימוש micropatterning כדי לכוון ולקדם צמיחת תאים אאוקריוטיים על רשתות TEM. במהלך micropatterning, צמיחת התא מכוונת על ידי הפקדת חלבוני מטריצה חוץ תאית (ECM) בתוך דפוסים ומיקומים שצוינו על רדיד הכסף של רשת TEM בעוד האזורים האחרים נשארים מצופים בשכבה נגד עכירות. גמישות בבחירת ציפוי פני השטח ועיצוב התבניות הופכת את המיקרו-מפזרינג ליישום רחב עבור מגוון רחב של סוגי תאים. Micropatterning שימושי עבור מחקרים של מבנים בתוך תאים בודדים, כמו גם מערכות ניסיוניות מורכבות יותר כגון אינטראקציות מארח-פתוגן או קהילות רב תאיות מובחנות. Micropatterning עשוי גם להיות משולב בזרימות עבודה רבות במורד הזרם של קריו-ET של תאים מלאים, כולל אור מתאם ומיקרוסקופיה אלקטרונית (קריו-CLEM) וכרסום קרן יונים ממוקדת (cryo-FIB).

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

מטרת פרוטוקול זה היא לכוון הידבקות תאים וצמיחה לאזורים ממוקדים של רשתות למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. זה מושג על ידי החלת שכבה נגד עכירות כי הוא ablated בדפוסים שצוינו על ידי המשתמש ואחריו תצהיר של חלבוני מטריצה חוץ תאית באזורים בדוגמת לפני זריעת התא.

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

צוות המחקר שלנו מפתח טכנולוגיות ופרוטוקולים למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית וטומוגרפיה של קריו-אלקטרון. פיתחנו פרוטוקולים עבור רשתות TEM micropatterning כדי לכוון צמיחת תאים ומיצוב לניסויי קריו-ET. טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים משמשת לייצור מבני רזולוציה ברמת ננומטר של קומפלקסים מקרומולקולריים בתוך תאים שנשמרו במצב של לחות קפואה מקומית.Micropatterning יכול להגדיל את התפוקה של קריו-ET של תאים שלמים, מיקרוסקופיית אלקטרונים אור קריו-מתאם, וניסויים כרסום קרן-יון ממוקד קריו. המספר וההפצה של תאים ברשתות EM הם קריטיים למחקרי קריו-ET של תאים שלמים. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה, ניתנת לשחזור וניתן להתאמה רחבה כדי לכוון את צמיחת התאים ברשתות EM באמצעות מיקרו-פאטרנינג.החוקר צריך להיות נוח באמצעות פיפטות, פינצטה, טכניקות תרבית תאים בסיסית, ופלואורסצנטיות ומיקרוסקופים אלקטרונים שידור. בעת דפוס בפעם הראשונה, השתמש בסוג תא ידוע ובשילוב ECM ובדוק אותם על כיסויים או מנות MatTek. חברי צוות המחקר המעורבים בפיתוח פרוטוקול זה הם: ד"רבריאן סיברט, מר ג'וזף קים וד"ר ג'יי יאנג. כדי להתחיל, העבר את הרשתות למחזיק הכנה לרשת וזוהר לפרוק את הרשתות פחמן בצד למעלה. לאחר מכן, העבר את הרשתות עם צד הפחמן כלפי מעלה למגלשת זכוכית נקייה או כיסוי עם הפרדה של סנטימטר אחד לפחות בין הרשתות.פיפטה 10 מיקרוליטרים של 0.05 פולי-L-ליזין על כל רשת ולדגור את הרשתות בתא לח במשך 30 דקות לפחות. לאחר הדגירה, לשטוף כל רשת שלוש פעמים עם 15 microliters של 0.1 HEPES טוחן ב pH 8.5. לדגור על הרשת בכל לשטוף במשך 30 שניות, ולאחר מכן להסיר את רוב הנוזל מהרשת עם pipette מבלי לתת לרשת להתייבש.לאחר השטיפה הסופית, להשאיר כל רשת ב 15 microliters של 0.1 HEPES טוחן. לאחר מכן, הכן את פתרון PEG-SVA והחלף מיד את פתרון HEPES ברשתות עם 10 מיקרוליטרים של פתרון PEG-SVA, ולאחר מכן לדגור על הרשתות בתא לח במשך שעה אחת לפחות. לאחר הדגירה, לשטוף כל רשת שלוש פעמים עם 15 microliters של מים סטריליים, דגירה הרשת בכל לשטוף במשך 30 שניות.לאחר השטיפה הסופית, להשאיר כל רשת ב 15 microliters של מים. מניחים טיפת מים מיקרוליטר אחת על מרכז כיסוי נקי חדש, ולאחר מכן להעביר בזהירות את הרשת מ 15 טיפת מים microliter טיפה על מכסה חדש עם צד הפחמן למעלה. לאחר מכן, מקם בזהירות בסטנסיל PDMS מעל הרשת שמירה על הרשת ממורכזת ומזעור מגע סטנסיל עם רדיד הפחמן של הרשת.לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של ג'ל PLPP לרשת ופיפטה בעדינות כדי לערבב. הזז את כיסוי הכיסוי עם הרשת למיקום חשוך לייבוש. הג'ל יתייבש תוך 15 עד 30 דקות.עבור micropatterning, לפתוח את התוכנה עם תצוגה חיה ברייטפילד מן המיקרוסקופ. כדי לעצב תבנית חדשה להפעלה ראשונית, בחר הוסף החזר השקעה ובחר עיגול של 3,000 מיקרומטר. מקם את החזר ההשקעה במעגל מעל הרשת באמצעות התמונה Brightfield על המסך כמדריך, ולאחר מכן הקש Lock כדי לאבטח את ההחזר על ההשקעה.לאחר נעילת ההחזר על ההשקעה במקום, בחרו 'הוסף דוגמת מילוי' ובחרו בתבנית המתאימה. באמצעות אפשרויות השכפול, צור עותקים של התבנית ההתחלתית כדי ליצור אזור ריבוע רשת שמונה על שמונה. התאם את המרווח והזווית לפי הצורך כדי ליישר את התבניות עם ריבועי הרשת.מקם את התבנית בפינה אחת של הרשת. לאחר מכן, שכפל את התבנית ומקם עותק בכל אחת מארבע פינות הרשת המזיזות את שלב המיקרוסקופ לפי הצורך עבור כל אזור. השתמש באפשרויות השכפול כדי לשנות אזור ריבוע רשת שמונה על שמונה לאזור ריבוע רשת של שניים על שמונה שימוקמו משני צידי המרכז.השאר את ארבעת ריבועי הרשת המרכזיים לא מרוסנים. עבור כל תבנית, להתאים את המינון הכולל במידת הצורך. 30 מיליג'אול למילימטר מרובע היא נקודת התחלה טובה.תחת אפשרויות מומחה, חזור על התאמת הזווית, המיקום, הרווח בין התבנית והיחס כדי למקד את היישור של התבנית בריבועי הרשת. הזז את שלב המיקרוסקופ כדי לשנות את אזור הרשת בתצוגת ברייטפילד. לאחר מיקום התבנית והתבניות, בטל את הסימון של כל האזורים פרט לאחד בלוח הפעולה של התוכנה.השתמש בשלב המיקרוסקופ כדי לנווט לאזור זה ולהתמקד בנייר הפחמן. לחץ על סמל גלגל העין בחלונית הפעולה כדי להחליף את תצוגת שכבת-העל של התבנית. ברגע שהרשת נמצאת בפוקוס, סגור את התריס של Brightfield ולחץ על סמל ההפעלה בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה כדי להתחיל בתהליך התבנית, שניתן לפקח עליו בשידור חי.חזור על שלב זה עד שכל האזורים יעוצבו בדוגמתם. לבסוף, להסיר את כיסוי עם הרשת מן המיקרוסקופ ומיד להוסיף 10 microliters של PBS סטרילי על הרשת. לאחר 10 דקות, להסיר את הסטנסיל עם פינצטה, ולאחר מכן לשטוף את הרשת שלוש פעמים עם 15 microliters של PBS ולהשאיר כל רשת PBS במיקום חשוך.הכינו 15 מיקרוליטרים של המטריצה החוץ-תאית לכל רשת, ולאחר מכן החליפו את ה-PBS מכל רשת ב-15 מיקרוליטרים של המטריצה החוץ-תאית ודגרו את הרשת בתא לח למשך שעה לפחות. לאחר הדגירה, לשטוף כל רשת חמש פעמים עם 15 microliters של PBS סטרילי כפי שהוכח בעבר. לאחר הכביסה הסופית, להשאיר כל רשת ב- PBS.באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לזהות את פלואורופור במטריצה חוץ תאית כדי לאשר דפוס וכי רדיד הפחמן נשאר שלם. תאי HeLa שנזרעו על רשתות TEM micropatterned ולא מרוסנות נראים על ידי כתמים פלואורסצנטיים באמצעות בדיקת כדאיות תאים מבוססת calcein AM ו- ethidium homodimer-1. באמצעות מטריצה חוץ-תאית מעורבת של קולגן ופיברינוגן, תאי HeLa נצמדים בקלות לדפוסים ברחבי הרשת.המורפולוגיה הכוללת של תאים שהתרחבו לאורך התבנית דומה לזו של תאים הגדלים על רשתות לא מרוסנות. תמונה של ברייטפילד של תאי BEAS-2B נגועים RSV 18 שעות לאחר הזריעה מראה הידבקות תאים וצמיחה לאורך האזור המרכזי של התבנית. רוב התאים הנגועים ממוקמים לאורך האזור המרכזי בצפיפות גבוהה יותר של תבנית ההדרגה.וריאנטים RSV ממוקמים קרוב לפריפריה של תאי BEAS-2B נגועים גדל על רשתות micropatterned. חלבונים מבניים רבים של RSV מזוהים בתוך הטומוגרמות, כולל נוקלאוקפפסיד וחלבון היתוך ויראלי. על רשתות micropatterned, נוירונים Drosophila עם ביטוי GFP פאן עצבי ניתן לעקוב בקלות על ידי מיקרוסקופיה אור בשל תיוג פלואורסצנטי ומיקומם להיות בתוך micropatterns.נוירונים על רשתות לא מרוסנות ניתן גם לעקוב באמצעות GFP איתות על ידי מיקרוסקופיה אור. עם זאת, איתורם במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית הופך לקשה בשל פסולת תאית וזיהום מהתקשורת. בשל הממדים של גוף תא העצב וניוריטים מורחבים, סדרת הטיית טומוגרפיה קריו-אלקטרונית נאספת לאורך אזורים דקים יותר של התאים עם הגדלה גבוהה יותר.קרום התא העצבי, המיטוכונדריה, המיקרוטובולים, חוטי האקטין, מבני שלפוחית, ומקרומולקולות כגון ריבוזומים נפתרים היטב במונטאז'ים ופרוסות של תמונות הגדלה גבוהות יותר דרך טומוגרמה תלת-ממדית. תכונות תת-תאיות דומות נצפות מטומוגרמוגרמות תלת-ממדיות של נוירונים לא מרוסנים. החלת הסטנסיל על הרשת והוספת ג'ל PLPP הוא הצעד הרגיש ביותר שיכול להשפיע על תוצאות דפוס ויש לעשות זאת בזהירות.Cryo-CLEM יכול לשמש כדי לוקליזציה של מטרות עניין בתוך תאים לאיסוף נתוני קריו-ET. ניתן להשתמש ב- Cryo-FIB-SEM כדי לדלל תאים באזורים שאחרת עבים מדי לאיסוף נתונים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

חילוץ מיקרוטובולים מהונדסים מתאי יונקים לחקר קומפלקסים של מיקרוטובולים-חלבונים באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

הכנת דגימה לקריוטומוגרפיה באתרו של תאי יונקים

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...