Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
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ウィスコンシン大学生化学科のジル・ワイルドンガー博士、シホイ・Z・ヤン博士、ジョセフィーヌ・W・ミッチェル夫人に感謝します。また、アウレリアン・デュボイン博士、ローラン・シキエ氏、アルヴェオールのマリー=シャーロット・マヌス氏、ナノスケール研究所のセルジュ・カドゥーラ氏の皆様に感謝申し上げます。この研究は、ウィスコンシン大学によって部分的にサポートされました, ウィスコンシン大学マディソン校生化学科のマディソンと公衆衛生サービスは、R01 GM114561、R01 GM104540、R01 GM104540-03W1、U24 GM139168をE.R.W.に付与し、R01 AI150475をI.W.S.に付与します。この研究の一部はNIH助成金U24 GM129547によって支援され、OHSUのPNCCで行われ、生物環境研究局が主催するDOE科学ユーザー施設(grid.436923.9)を通じてアクセスされました。また、ウィスコンシン大学マディソン校生化学部のクライオEM研究センターで施設や計装を利用してくれたことに感謝しています。

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著者らは開示するものは何もない。

最新の高度な電子顕微鏡とソフトウェアパッケージは、合理化された自動化されたクライオEMとクライオETデータ収集をサポートし、数日以内に数百から数千の位置をターゲットにして画像化することができます32,33,34,35。全細胞cryo-ETワークフローの重要な制限要因の1つは、グリッドごとに収集可能なターゲットの十分な数を得た。最近では、多くのグループがクライオEM用のマイクロパターニンググリッド用のプロトコルを開発しており、データ収集効率が向上する利点が16,17,18です。ここでは、市販のマイクロパターニングシステムを使用して、主要なショウジョウバエニューロンおよび培養ヒト細胞株(未感染またはRSV感染)のクライオET研究のためのTEMグリッドをマイクロパターン化するためのプロトコルが提示される。このマイクロパターン化システムは多目的で、特定の実験目標に合わせて多くのステップを最適化し、調整することができます。TEMと蛍光顕微鏡経験を持つユーザーは、グリッド調製およびマイクロパターニングにすぐに熟練することができます。慎重な練習では、数回の反復の後で良い結果を得ることができます。以下では、利用可能なオプション、ユーザーの考慮事項、潜在的な利点、およびcryo-EMのマイクロパターニングの将来の応用について説明します。
全細胞cryo-ETのための重要な考慮事項の1つは、EMグリッドの選択です。EM グリッドは、メッシュ フレーム(または構造支持)と、セルが成長する連続または穴のあいたフィルム表面であるホイル(またはフィルム)の 2 つの部分で構成されます。銅メッシュグリッドは、タンパク質および単離された複合体のクライオEMに一般的に使用されます。しかし、銅の細胞毒性のために全細胞クライオETには適していません。代わりに、細胞断層撮影には金メッシュが一般的に使用されます。その他のオプションは、ニッケルまたはチタンを含む、 剛性の増加などの金よりも利益を提供する可能性があります16。EM グリッドは、さまざまな用途をサポートするために、さまざまなメッシュ寸法で使用できます。メッシュサイズが大きいほど、グリッドバーとチルトシリーズの収集に適した領域の間でセルが成長する余地が増えますが、全体的な標本の脆弱性が高まります。最も一般的に使用される箔は、クアンチフォイルやCフラットグリッドなどの穴あきまたは穴のあいたアモルファスカーボンです。生物学的ターゲットは、炭素の正孔を通して、または電子半透明炭素を通して画像化することができる。R 2/1やR2/2などのグリッドは、穴がそれぞれ1と2μmの間隔で配置された幅2μmで、多数の穴を提供し、データ収集のための潜在的な領域を多数提供します。しかし、一部の細胞は、R 1.2/20 グリッドや連続カーボンなどのより均一な表面で成長し、より良く拡大する可能性があります。焦点イオンビームミリング(cryo-FIB)による下流のサンプル処理では、ホイルを切削によって除去し、基礎となるフィルムの継続的な存在に対する懸念を軽減します。メッシュと同様に、他の材料からの箔も利用可能で、ここで提示されるパターニングプロトコルはSiO2グリッドにも同様に適しています。一般的に使用されるグリッドには、全細胞クライオET用の金クアンチフォイル、連続カーボン、またはSiO2フィルム200メッシュグリッド(グリッドバー間の約90 μm間隔)が含まれます。
パターンを設計する際には、いくつかの考慮事項があります。これらの決定の大部分は、実験の細胞タイプと目的によって導かれます。良い出発点は、培養中の細胞の形状と寸法に近似するパターンを選択することです。多くの研究は、細胞の成長および細胞骨格配置に対するパターン形状の有意な効果を実証した13,36,37。対象を変更する可能性がある場合は、パターン設計時に特別な注意を払う必要があります。各細胞タイプのいくつかのパターンをテストし、どのパターンが細胞接着および成長を促進するかを決定した。マイクロパターン化システムの柔軟性により、単一のグリッド上で複数のパターンをテストし、1つの実験で異なるグリッドのパターンを変更できます。ここで使用されるような大きなパターン(〜50〜90μm)は、複数の細胞がパターンの単一領域に付着する可能性を高め、接着後に細胞が拡大および拡張することを可能にする。より制約のあるパターン(20~30 μm)は、細胞の拡張よりも細胞の分離が重要な実験(例えば、焦点イオンビームミリング(cryo-FIB)実験など)に適している場合があります。断層撮影アプリケーションでは、傾き軸の影響を考慮する必要があります。パターンが配置され、すべてのセルが互いに平行に単一の方向に成長する場合、すべてのセルが顕微鏡ステージにロードされたときにチルト軸に対して垂直になり、データの品質が低下する可能性があります。
パターンなしのグリッドでは、セルはグリッド バーに優先的に付着し、TEM ではイメージ化できません。パターン化されたグリッド上でも、細胞は、パターン化されたカーボンフォイルとグリッドバーの両方のグリッド四角形の角に部分的に配置されることがしばしば観察されます。最近、マイクロパターン化は、意図的にグリッドbar18の上にセルの一部を配置するために使用された。これは、箔に細胞全体を周囲に置くことを重要ではない実験のために考慮することができる。これは、1 つのグリッド四角形よりも大きくなる可能性のある細胞 (1 次ニューロンが複数日にわたって成長するなど) で特に重要です。
パターンのデザインに使用できるツールは多数あります。ここで、パターンは、パターンを任意の角度に回転させ、このマイクロパターン化システムによって単一の投影でパターン化できる最大領域内に収まるように、任意の次元で800ピクセル未満に制限された。これにより、顕微鏡上のグリッドの向きに関係なく、グリッドに合ったパターンを回転させることができます。ここでは、グリッドを6つのパターン化領域に分割した。主に、グリッドの異なる領域間でフォーカス調整が可能です。特にゴールドグリッドは非常に可鍛性であり、ガラスの上に完全に平らに横たわっていない可能性があります。クリーンで洗練されたパターニング結果には、適切な焦点が不可欠です。セグメント化されたパターンを使用すると、パターン化プロセス中にグリッドがわずかにずれる場合にパターン位置を微調整するだけで済みますが、通常、PDMS ステンシルで PLPP ゲルを使用する場合は問題ではありません。最後に、グリッドの中央 4 つのグリッドの正方形はパターン化されていないままでした。これは、ユーザーが明確にグリッドの中心を識別することができ、これは相関イメージング実験に非常に有用であるサポートしています。
このマイクロパターニングシステムのパターニングソフトウェアであるLeonardoは、ステッチングや、このプロトコルの範囲を超えたPDFとしてパターンをインポートする機能など、より高度な機能を備えています。このソフトウェアには、TEM グリッドで使用できる微細構造検出と自動パターン位置決めも含まれています。この機能は、グリッドが非常に平坦で、異なる領域間でフォーカスを調整することなくパターン化できる場合に最も便利です。
ECMタンパク質の選択は、細胞接着および拡張に大きな影響を与える可能性があります。いくつかの細胞は、特定の基質38上で成長すると生理学的変化を起こすと知られている。複数のECMタンパク質および濃度は、文献で報告された以前の研究に基づいて、任意の新しい細胞タイプについて試験された。ラミニン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、コラーゲンは培養細胞に広く使用されており、他のデータが利用できない場合は出発点として使用することができます。しかし、一般的に使用されるECMタンパク質が細胞に適切な付着特性を与えることができない場合は、他のECMタンパク質も考慮する必要があります。これは、原発 性ショウジョウバエ ニューロンに特に当てはまり、植物のレクチンコンカナバリンAの高濃度が適切な細胞接着に必要であった。細胞接着とECMとの成長の両立性は、TEMグリッドに移行する前にガラス皿やスライドにパターニングすることによってテストすることができます。この事前審査アプローチは、多数の組み合わせを調べる必要がある場合、時間と費用対効果が高くなります。蛍光結合ECMタンパク質の含有は、パターニングの成功と品質を評価する上で重要です。
細胞播種は、マイクロパターニングの有無にかかわらず、全細胞cryo-ETにとって最も重要なステップの1つである6,16,39です。一次ショウジョウバエまたは他のニューロンは、壊れやすい、懸濁液中不安定であり、かつ量が制限される可能性がある場合、単一の播種アプローチは、監視される順次細胞の播種よりも好ましい。ショウジョウバエニューロンのプロトコルに記載されているように、最適化された細胞密度での単一のシードステップは、ほとんどの細胞タイプで実行可能な選択肢です。しかし、細胞を低い初期濃度で基質に播種し、ここで説明する他の文献18に記載されているように、監視された方法で細胞を追加することも可能である。このシーケンシャルシード処理により、一貫性のある結果が得られる場合があります。標準的な細胞培養と同様に、細胞の生存率を維持し、単離中の細胞凝集を最小限に抑えるために常に注意する必要があります。
マイクロパターニングから始めるとき、最終的な結果に有害ないくつかの潜在的な落とし穴があります。慎重なグリッド処理および滅菌技術、PLPPゲルの均一な分布、パターニング中の適切な用量と焦点、および播種前の細胞生存率の維持は、成功のための最も重要な考慮事項の一つです。いくつかの潜在的な問題の一覧と解決策を表 1 にまとめました。
マイクロパターン化されたグリッドを使用すると、セルをグリッド全体で一貫したセル密度を確立し、傾斜系列コレクションに適した領域に関心のある領域を配置するのに役立ちます16,18。細胞の配置と位置決めは、cryo-CLEM実験における相関性の受託マーカーとして使用することができ、脆弱なファインダーグリッドおよび蛍光受託者マーカーの必要性を減らします。しかし、このような受託者マーカーは、サブマイクロメータ精度相関29,40に対して依然として有用であり得る。さらに、単離された細胞の均等な分布は、ラメラを切断できる細胞の数を最大化する集光イオンビームミリング(cryo-FIB)実験にも非常に有益です16。
cryo-EM ワークフローにマイクロパターン化を追加すると、データスループットが測定可能に改善され、新しい実験が可能になる可能性があります。この技術がさらに採用され、開発されるにつれて、ECM勾配、複数のECM堆積物、および微細構造アセンブリを含むマイクロパターニングのより高度なアプリケーションは、完全な細胞コンテキストで生物学的標的およびプロセスを研究するcryo-ETの能力をさらに拡大する。

クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の開発、拡大、汎用性により、研究者は高分子(〜1nm)から高(〜2 Å)分解能に近いネイティブ状態の広範な生物学的サンプルを調べました。単粒子クライオEMと電子回折技術は、溶液中または結晶状態の精製された高分子にそれぞれ1,2を適用するのが最善です。一方、クライオ電子断層撮影(cryo-ET)は、細菌、多形性ウイルス、真核細胞などの大きな異種性の物体の近く天然の構造および超構造研究に独特に適しています3。cryo-ETでは、顕微鏡ステージ上でサンプルを物理的に傾け、サンプルを異なる角度で一連の画像を取得することで、3次元(3D)情報が得られます。これらの画像、またはチルトシリーズは、多くの場合、1〜3度の増分で+60/-60度の範囲をカバーしています。その後、チルトシリーズを計算的に3Dボリューム(トモグラム4とも呼ばれる)に再構築することができます。
すべてのクライオEM技術は、サンプルが非結晶性の氷の薄い層に埋め込まれる必要があります。最も一般的に使用される凍結固定技術の1つは、サンプルがEMグリッドに適用され、吸引され、液体エタンまたは液体エタンとプロパンの混合物に急速に突っ込むプランジ凍結である。この技術は、培養したヒト細胞を含む<100nmから~10μmの厚さのサンプルのガラス化に十分であり、例えばHeLa cells5,6のような培養ヒト細胞を含む。厚さ200μmまでの小オルガノイドや組織生検などの厚いサンプルは、高圧凍結によってガラス化することができます7。しかし、より厚い試料の電子散乱が増加したため、クライオETのサンプルおよび氷の厚さは、300kV透過電子顕微鏡において〜0.5〜1μmに制限されています。したがって、多くの真核細胞の全細胞クライオETは、凍結切片8や集光イオンビームミリング9,10,11などの追加のサンプル調製ステップが使用されない限り、細胞周辺または細胞の拡張に限定される。
多くの全細胞クライオETイメージング実験の制限は、データ収集スループット12である。1つのTEMグリッドの正方形から何千もの単粒子を画像化することが多い単粒子クライオEMとは異なり、細胞は大きく広がり、細胞が薄い層の氷の中に保存されるように十分な低密度で成長しなければならない。多くの場合、関心領域は、セルの特定の特徴またはサブエリアに限定されます。スループットをさらに制限することは、TEM グリッド バーの上または近くなど、TEM イメージングに適さない領域でセルが成長する傾向にあります。TEM グリッド上の細胞培養に関連する予測できない要因により、データ取得のサンプルのアクセシビリティとスループットを向上させるためには、技術開発が必要です。
接着性細胞外マトリックス(ECM)タンパク質による基質顕微鏡は、ガラスおよび他の組織培養基質などの硬質、耐久性、光学的に透明な表面上の細胞の成長を指示する生細胞光顕微鏡法のための確立された技術です13,14。マイクロパターン化は、ソフトまたは 3 次元(3D)サーフェスでも実行されています。このような技術は、細胞の正確な位置を可能にしただけではありません。また、パターン化された神経細胞回路15などの多細胞ネットワークの構築もサポートしています。マイクロパターニングをcryo-ETに持ち込むことは、スループットを向上させるだけでなく、複雑で動的な細胞マイクロ環境を探索するための新しい研究を開くことができます。
最近、複数のアプローチを通じて、TEMグリッド上でマイクロパターン化技術を使用するグループがいくつかある16,17。ここでは、TEMグリッド用のマスクレスフォトパターニング技術の使用について、高解像度で非接触パターンを特徴とするAlvéole PRIMOマイクロパターニングシステムを用いて説明します。このマイクロパターニングシステムでは、反ファリング層が基板の上部に塗布され、続いて光触媒の適用とUVレーザーを用いたユーザ定義パターンにおける防汚層のアブレーションが行われます。次いで、ECMタンパク質を適切な細胞培養のためのパターンに添加することができる。この方法は、網膜色素上皮-1(RPE1)、マディン・ダービー・イヌ腎臓II(MDCKII)、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)、および内皮細胞株16,17,18のクライオ-ET研究のためにいくつかのグループで使用されてきた。このマイクロパターニングシステムは、液体またはゲル光触媒試薬と同様に、複数の反ファリング層の基質と互換性があります。さまざまなECMタンパク質を細胞株の特異性に合わせて選択し、適合させることができ、ユーザに汎用性を与える。
マイクロパターン化は、実験室19内の多数のプロジェクトにうまく適用されている。ここでは、培養HeLa細胞、呼吸間胞ウイルス(RSV)感染したBEAS-2B細胞、および原発性幼虫 ショウジョウバエメラノガスター ニューロン20を研究するための特異的な適応を含むマイクロパターン化プロトコルが提示される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

全細胞クライオ電子断層撮影(cryo-ET)は、細胞内に存在する高分子のナノメートルレベルの分解能構造を生成するために使用され、ほぼネイティブの凍結水和状態で保存される強力な技術です。しかし、細胞を生理学的状態に保ちながら断層撮影に適した方法でTEMグリッド上に細胞を培養および/または付着させることに関連する課題があります。ここでは、TEMグリッド上で真核細胞増殖を指示し、促進するためのマイクロパターニングの使用に関する詳細なステップバイステップのプロトコルが提示されています。マイクロパターニング中、細胞増殖は、TEMグリッドの箔上の指定されたパターンおよび位置内に細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を堆積させることによって指示され、他の領域は反汚れ層でコーティングされたままである。表面コーティングとパターン設計の選択の柔軟性は、マイクロパターニングが幅広い種類の細胞に広く適用可能です。マイクロパターニングは、個々の細胞内の構造の研究だけでなく、宿主と病原体の相互作用や分化された多細胞群などのより複雑な実験システムの研究に役立ちます。また、コマンス光と電子顕微鏡(cryo-CLEM)や集光イオンビームミリング(cryo-FIB)など、多くの下流全細胞クライオETワークフローにマイクロパターニングが組み込まれています。

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Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

このプロトコルの目的は、細胞接着と成長を、クライオ電子顕微鏡用のグリッドの標的領域に向け出す方法です。これは、細胞播種前のパターン化領域に細胞外マトリックスタンパク質を堆積させた後、ユーザー指定のパターンで脱退された反ファリング層を適用することによって達成される。

全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

当社の研究チームは、クライオ電子顕微鏡とクライオ電子断層撮影の技術とプロトコルを開発しています。我々は、細胞増殖と位置決めをクライオ-ET実験に向けて、TEMグリッドをマイクロパターニングするためのプロトコルを開発した。全細胞クライオ電子断層撮影は、天然の凍結水和状態で保存された細胞内の高分子複合体のナノメートルレベルの分解能構造を作り出すために使用される。マイクロパターニングは、全細胞クライオET、クライオ相関光電子顕微鏡、およびクライオに焦点を当てたイオンビームミリング実験のスループットを向上させることができます。EMグリッド上の細胞の数と分布は、全細胞クライオ-ET研究にとって極めて重要です。このプロトコルは、マイクロパターニングを通じてEMグリッド上の細胞増殖を指示するための迅速で、再現性があり、広く適応可能な方法を提供します。研究者は、ピペット、ピンセット、基本的な細胞培養技術、および蛍光および透過電子顕微鏡を使用して快適であるべきです。初めてパターニングするときは、よく知られた細胞タイプとECMの組み合わせを使用し、カバーリップやMatTek料理でそれらをテストします。このプロトコル開発に携わる研究チームのメンバーは、以下の例を参照してください。ブライアン・シバート、ジョセフ・キム氏、ジェ・ヤン博士まず、グリッドをグリッド準備ホルダーに転送し、グリッドのカーボンサイドをグロー放電します。次に、カーボン側のグリッドを、グリッド間の少なくとも1センチメートルの分離を持つきれいなガラススライドまたはカバースリップまで転送します。ピペット10マイクロリットルの0.05ポリL-リジンを各グリッドに加え、湿度の高いチャンバー内で30分以上インキュベートします。インキュベーション後、各グリッドをpH 8.5で0.1モルHEPESの15マイクロリットルで3回洗浄します。各洗浄でグリッドを30秒間インキュベートし、グリッドを乾燥させることなくピペットでグリッドから液体のほとんどを取り除きます。最終洗浄後、各グリッドを15マイクロリットルの0.1モルHEPESに残します。次に、PEG-SVA溶液を調製し、すぐに10マイクロリットルのPEG-SVA溶液でグリッド上のHEPES溶液を交換し、その後、少なくとも1時間、湿度の高いチャンバー内のグリッドをインキュベートします。インキュベーション後、各グリッドを15マイクロリットルの無菌水で3回洗浄し、各洗浄でグリッドを30秒間インキュベートします。最後の洗浄後、各グリッドを15マイクロリットルの水に残します。新しいきれいなカバースリップの中央に1マイクロリットルの水滴を置き、15マイクロリットルの水滴から炭素側を上にして新しいカバースリップのドロップにグリッドを慎重に移します。次に、グリッドの中央を維持し、グリッドのカーボン箔とのステンシル接触を最小限に抑えるグリッド上にPDMSステンシルに慎重に配置します。その後、PLPPゲルの1マイクロリットルをグリッドに加え、ピペットをそっと混ぜます。グリッド付きのカバースリップを暗い場所に移動して乾燥させます。ゲルは15〜30分で乾燥します。マイクロパターン化の場合は、マイクロスコープからライブブライトフィールドビューでソフトウェアを開きます。初回実行用の新しいテンプレートを設計するには、[ROI を追加]を選択し、3,000 マイクロメートル円を選択します。画面上のブライトフィールド画像をガイドとしてグリッド上に円ROIを配置し、ロックを押してROIを固定します。ROI を所定の位置にロックしたら、[パターンを追加]を選択して、適切なパターンを選択します。レプリケーション オプションを使用して、初期パターンのコピーを生成して、8 つ 1 つ 1 つのグリッド四角形リージョンを作成します。必要に応じて間隔と角度を調整して、パターンをグリッドの正方形に揃えます。グリッドの一角にパターンを配置します。次に、パターンを複製し、必要に応じて各領域に対して顕微鏡ステージを移動するグリッドの四隅のそれぞれにコピーを配置する。レプリケーション オプションを使用して、8 % 8 グリッド四角形の領域を、中心の両側に配置する 2 % 8 のグリッド正方形リージョンに変更します。中央の 4 つのグリッドの正方形をパターン化したままにします。各パターンについて、必要に応じて総投与量を調整します。1平方ミリメートルあたり30ミリジュールは良い出発点です。[エキスパート オプション] で、パターンの角度、位置、間隔、および比率を反復して調整し、パターンの配置をグリッドの正方形に調整します。顕微鏡ステージを動かして、ブライトフィールドディスプレイのグリッド領域を変更します。テンプレートとパターンを配置したら、ソフトウェアのアクションパネルで、いずれかの領域を除くすべての領域のチェックを外します。顕微鏡ステージを使用して、その領域に移動し、炭素箔に焦点を当てます。アクションパネルの眼球アイコンをクリックして、パターンオーバーレイの表示をオフに切り替えます。グリッドにフォーカスが合った後、ブライトフィールドシャッターを閉じ、ソフトウェアの右下隅にある再生アイコンを押して、ライブで監視できるパターニングプロセスを開始します。すべての領域がパターン化されるまで、この手順を繰り返します。最後に、グリッドを使用してカバースリップを取り外し、すぐに10マイクロリットルの無菌PBSをグリッドに追加します。10分後、ピンセットでステンシルを取り出し、15マイクロリットルのPBSでグリッドを3回洗い、各グリッドをPBSの暗い場所に残します。各グリッドに対して15マイクロリットルの細胞外マトリックスを用意し、各グリッドのPBSを細胞外マトリックスの15マイクロリットルに置き換え、少なくとも1時間は湿度の高いチャンバーでグリッドをインキュベートします。インキュベーション後、前に示したように、各グリッドを15マイクロリットルの無菌PBSで5回洗浄します。最後の洗浄後、各グリッドをPBSに残します。蛍光顕微鏡を用いて、細胞外マトリックス中の蛍光素を検出して、パターン化を確認し、炭素箔がそのまま残っていることを確認します。マイクロパターン化および未パターンのTEMグリッドに播種されたHeLa細胞は、カルセインAMおよびエチジウムホモジマー-1ベースの細胞生存アッセイを使用した蛍光染色によって見える。混合コラーゲンとフィブリノーゲン細胞外マトリックスを使用して、HeLa細胞はグリッド全体のパターンに容易に付着する。パターンに沿って拡大した細胞の全体的な形態は、パターン化されていないグリッド上で増殖した細胞の形態に似ています。播種後18時間でRSV感染BEAS-2B細胞のブライトフィールド画像は、パターンの中央領域に沿って細胞の接着および成長を示す。感染細胞の大部分は、勾配パターンの高密度中央領域に沿って配置されます。RSV変異体は、微量パターン化された格子上で増殖した感染したBEAS-2B細胞の周辺の近くに位置する。多くのRSV構造タンパク質は、ヌクレオキャプシドおよびウイルス融合タンパク質を含むトモグラム内で同定される。微小パターン化されたグリッドでは、汎神経細胞GFP発現を有するショウジョウバエニューロンは、蛍光標識とその位置がマイクロパターン内にあるため、光顕微鏡検査によって容易に追跡することができる。パターン化されていないグリッド上のニューロンは、光顕微鏡によるGFPシグナリングを介して追跡することもできます。しかし、細胞の破片や媒体からの汚染のために、それらをクライオ電子顕微鏡で見つけることは困難になります。ニューロン細胞体と拡張神経突起の寸法により、高倍率の細胞のより薄い領域に沿ってクライオ電子断層撮影傾斜系列が収集されます。ニューロン細胞膜、ミトコンドリア、微小管、アクチンフィラメント、小胞構造、リボソームなどの高分子は、3Dトモグラムを介して高倍率の画像モンタージュおよびスライスでよく解決されます。同様の細胞下の特徴は、パターン化されていないニューロンの3D断食から観察される。グリッドにステンシルを適用し、PLPP ゲルに追加することは、パターニング結果に影響を与える可能性がある最も機密性の高い手順であり、注意して行う必要があります。Cryo-CLEMは、細胞内の対象をクライオ-ETデータ収集のためにローカライズするために使用できます。Cryo-FIB-SEMは、データ収集のために厚すぎる領域のセルを薄くするために使用することができます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

時間分解型クライオ電子顕微鏡のための高速グリッド調製

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのDNA修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

クライオ電子顕微鏡による微小管-タンパク質複合体の研究のための哺乳類細胞からの修飾微小管抽出

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

哺乳類細胞の in situ クライオトモグラフィーのためのサンプル調製

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...