Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

우리는 박사 질 Wildonger, 박사 시희 Z. 양, 그리고 유세핀 W. 미첼 박사생화학의 학과, 위스콘신 대학, 매디슨은 아낌없이 elav-Gal4, UAS-CD8::GFP 플라이 스트레인 (블루밍턴 주식 센터, #5146)을 공유해 주셔서 감사합니다. 또한 오렐리엔 두보인 박사, 로랑 시퀴어 박사, 알베올의 마리 샬럿 마누스 박사, 나노스케일 연구소의 세르주 카두라 씨에게 이 프로젝트를 통해 후한 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 위스콘신 대학에 의해 부분적으로 지원되었다, 매디슨, 위스콘신 대학의 생화학학과, 매디슨, 공중 보건 서비스 보조금 R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1, U24 GM139168 E.R.W. 및 R01 AI150475 이 연구의 일부는 NIH 보조금 U24 GM129547에 의해 지원되고 OHSU에서 PNCC에서 수행하고 EMSL (grid.436923.9), 생물 및 환경 연구 사무실후원 과학 사용자 시설의 DOE 사무실을 통해 액세스. 우리는 또한 위스콘신 대학, 매디슨의 생화학학과의 Cryo-EM 연구 센터에서 시설과 계측의 사용에 감사드립니다.

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현대식 고급 전자 현미경 및 소프트웨어 패키지는 이제 수백~수천 개의 위치를 표적으로 하고 이미지화할 수 있는 간소화된 자동 냉동 저온-EM 및 cryo-ET 데이터 수집을 지원합니다32,33,34,35. 전셀 cryo-ET 워크플로우에 대한 한 가지 중요한 제한 요소는 그리드당 수집 가능한 대상을 충분히 확보하는 것입니다. 최근에는 저온-EM용 마이크로패터닝 그리드용 프로토콜을 개발했으며, 데이터 수집 효율이 향상되어 데이터 수집 효율이 향상되었습니다16,17,18. 여기서 프로토콜은 1차 드로소필라 뉴런및 배양된 인간 세포주(감염되지 않은 또는 RSV-감염)의 저온-ET 연구를 위해 마이크로패턴 TEM 그리드에 상용 마이크로패턴 시스템을 사용하기 위한 것이다. 이 마이크로패턴 시스템은 다재다능하며, 특정 실험 목표에 맞게 최적화하고 조정할 수 있는 다양한 단계를 제공합니다. TEM 및 형광 현미경 검사를 가진 사용자는 그리드 준비 및 마이크로 패터닝에 신속하게 숙련 될 수 있습니다. 주의 깊은 연습을 통해 몇 번의 반복 후에 좋은 결과를 달성할 수 있어야 합니다. 아래에서 사용 가능한 옵션, 사용자 고려 사항, 잠재적 이점 및 cryo-EM용 마이크로패터닝의 향후 응용 프로그램에 대해 설명합니다.
전체 셀 저온-ET의 중요한 고려 사항 중 하나는 EM 그리드 선택입니다. EM 그리드는 메시 프레임(또는 구조지지대)과 호일(또는 필름)의 두 부분으로 구성되며, 이는 세포가 성장할 연속 또는 구멍이 뚫리는 필름 표면이다. 구리 메쉬 그리드는 일반적으로 단백질과 고립 된 복합체의 저온-EM에 사용됩니다. 그러나, 그들은 구리의 세포 독성으로 인해 전세포 극저온-ET에 적합하지 않습니다. 대신, 금 메쉬는 일반적으로 세포 단층 촬영에 사용됩니다. 다른 옵션으로는 니켈 또는 티타늄이 포함되며, 이는 강성 증가와 같은 금에 대한 이점을 제공할 수 있습니다16. EM 그리드는 다양한 응용 프로그램을 지원하기 위해 서로 다른 메시 치수로 사용할 수 있습니다. 메시 크기가 클수록 전체 표본 취약성이 증가하는 비용이 들지만 그리드 바와 틸트 시리즈 수집을 위해 사용할 수 있는 영역 사이에 셀이 더 많이 성장할 수 있는 공간을 제공합니다. 가장 일반적으로 사용되는 호일은 천공 또는 구멍이 없는 무정형 탄소(예: 퀀티포일 또는 C-플랫 그리드)입니다. 생물학적 표적은 탄소의 구멍을 통해 또는 전자 반투명 탄소를 통해 서 이미지될 수 있다. 구멍이 각각 1과 2 μm 간격이 있는 2 μm 너비인 R 2/1 또는 R 2/2와 같은 그리드는 많은 수의 구멍을 제공하므로 데이터 수집을 위한 많은 수의 잠재적 영역을 제공합니다. 그러나 일부 세포는 R 1.2/20 그리드 또는 연속 탄소와 같은 더 균일한 표면에서 더 잘 성장하고 확장될 수 있습니다. 집중 이온 빔 밀링(cryo-FIB)에 의한 다운스트림 샘플 처리의 경우, 호일은 밀링을 통해 제거되어 기본 필름의 지속적인 존재에 대한 우려를 줄입니다. 메쉬와 마찬가지로 다른 재료의 호일도 사용할 수 있으며, 여기에 제공되는 패터닝 프로토콜은 SiO2 그리드에 동등하게 적합합니다. 일반적으로 사용되는 그리드에는 전신 냉동고-ET용 골드 콴티포일, 연속 탄소 또는 SiO2 필름 200 메쉬 그리드(그리드 바 간~90μm 간격)가 포함됩니다.
패턴을 디자인할 때 고려해야 할 사항이 여러 가지가 있습니다. 이러한 결정의 대부분은 실험의 세포 유형 및 목적에 의해 인도된다. 좋은 출발점은 배양에서 세포의 모양과 치수를 근사화하는 패턴을 선택하는 것입니다. 많은 연구는 세포 성장과 사이토셀레탈 배열에 패턴 모양의 중요 한 효과 입증 13,36,37. 이 관심의 대상을 변경할 수 있다면 패턴 디자인 중에 특별한주의를 기울여야합니다. 각 세포 유형에 대한 여러 패턴은 세포 접착 및 성장을 촉진하는 패턴을 결정하기 위해 테스트되었습니다. 마이크로패턴 시스템의 유연성은 단일 그리드에서 여러 패턴을 테스트하고 단일 실험 내에서 서로 다른 그리드에 대한 패턴을 변경할 수 있습니다. 여기에 사용되는 패턴과 같은 더 큰 패턴 (~50-90 μm)은 여러 세포가 패턴의 단일 영역에 부착할 가능성을 높이고 세포가 접착 후 확장 및 확장 할 수 있게합니다. 더 제한된 패턴(20-30 μm)은 집중이온 빔 밀링(cryo-FIB) 실험과 같이 세포 분리가 세포 팽창보다 더 중요한 실험에 적합할 수 있다. 단층 촬영 응용 프로그램의 경우 기울기 축의 영향을 고려해야 할 수 있습니다. 패턴이 배치되어 모든 세포가 한 방향으로 서로 평행하게 자라도록 하는 경우, 모든 세포가 현미경 단계에 로드될 때 틸트축에 수직으로 되어 데이터의 품질이 낮아질 수 있다.
패턴이 없는 그리드에서 셀은 종종 TEM에 의해 이미지를 식별할 수 없는 그리드 막대를 우선적으로 부착합니다. 패턴 그리드에서도 세포는 패턴이 있는 탄소 호일과 그리드 바 모두에 부분적으로 그리드 사각형의 모서리에 위치하는 것으로 관찰됩니다. 최근에는 마이크로패터닝이 그리드 bar18 위에 셀의 일부를 의도적으로 배치하는 데 사용되었습니다. 이것은 호일에 전체 세포 주변을 갖는 것이 중요하지 않은 실험에 대해 고려될 수 있습니다. 이것은 다일 동안 증가하는 1 차적인 뉴런과 같은 단 하나 그리드 광장 보다는 더 큰 성장할 수 있는 세포에 특히 중요할 수 있습니다.
패턴을 디자인하는 데 사용할 수 있는 많은 도구가 있습니다. 여기서, 패턴은 임의의 차원에서 800픽셀 미만으로 제한되어 패턴을 임의의 각도로 회전할 수 있고 이 마이크로패터닝 시스템에 의해 단일 프로젝션으로 패턴화할 수 있는 최대 영역 내에 여전히 맞출 수 있었다. 이를 통해 사용자는 현미경의 그리드 방향에 관계없이 그리드와 함께 패턴을 올바르게 지향할 수 있습니다. 여기서 그리드는 6개의 패터닝 영역으로 나뉘었다. 주로 그리드의 다른 영역 간에 포커스 조정이 가능합니다. 특히 금 격자는 매우 가단적이며 유리에 완전히 평평하게 놓이지 않을 수 있습니다. 깨끗하고 세련된 패터닝 결과에 적합한 초점이 필수적입니다. 분할된 패턴을 사용함으로써 패턴 처리 과정에서 그리드가 약간 이동하는 경우 패턴 위치에 대한 사소한 조정만 이루어져야 하지만 일반적으로 PDMS 스텐실을 사용하여 PLPP 젤을 사용할 때는 문제가 되지 않습니다. 마지막으로 그리드의 중앙 4개 그리드 사각형은 패턴이 없는 상태로 유지되었습니다. 이는 사용자가 그리드의 중심을 명확하게 식별할 수 있도록 지원하며, 이는 상관 관계 이미징 실험에 매우 유용합니다.
이 마이크로 패턴 화 시스템의 패터닝 소프트웨어인 Leonardo는 스티치및 이 프로토콜의 범위를 벗어난 PDF로 패턴을 가져올 수 있는 기능과 같은 고급 기능을 갖추고 있습니다. 이 소프트웨어에는 TEM 그리드에서 사용할 수 있는 미세 구조 감지 및 자동화된 패턴 위치 지정도 포함되어 있습니다. 이 기능은 그리드가 매우 평평하고 서로 다른 영역 간의 초점을 조정할 필요 없이 패턴을 조정할 수 있을 때 가장 유용합니다.
ECM 단백질의 선택은 세포 접착 및 확장에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 일부 세포는 특정 기판에 성장 할 때 생리적 변화를 겪는 것으로 알려져있습니다38. 다중 ECM 단백질과 농도는 문헌에 보고된 사전 작업을 기반으로 모든 새로운 세포 유형에 대해 테스트되었다. 라미닌, 피브리노겐, 섬유넥틴 및 콜라겐은 배양 된 세포에 널리 사용되며 다른 데이터를 사용할 수없는 경우 출발점으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 다른 ECM 단백질은 또한 일반적으로 사용되는 ECM 단백질이 세포에 대한 적절한 준수 특성을 부여하지 못하는 경우에 고려되어야 합니다. 이것은 1 차적인 Drosophila 뉴런을 위해 특히 사실이었습니다, 식물 렉틴 concanavalin A의 고농도는 적당한 세포 준수를 위해 필요했기 때문에. ECM과의 세포 접착 및 성장의 호환성은 TEM 그리드로 전환하기 전에 유리 접시 또는 슬라이드의 패턴화로 테스트할 수 있습니다. 이 사전 선별 접근 방식은 많은 수의 조합을 검사해야 하는 경우 시간과 비용 효율적입니다. 형광으로 공주된 ECM 단백질의 포함은 패터닝의 성공과 품질을 평가하는 데 유용합니다.
세포 시싱은 마이크로패싱6,16,39의 유무에 관계없이 전체 세포 저온-ET를 위한 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 1 차 적인 Drosophila 또는 그밖 뉴런을 위해, 연약하고, 현탁액에 있는 불안정하고, 양에서 제한될 수 있고, 단 하나 종자 접근은 감시되고, 순차적인 세포 파종이상 선호됩니다. Drosophila 뉴런에 대한 프로토콜에 설명된 바와 같이 최적화된 세포 밀도에서 단일 파종 단계는 대부분의 세포 유형에 대한 실행 가능한 옵션입니다. 그러나, 또한 낮은 초기 농도에서 기판에 세포를 종자하고 여기에 다른 문헌18에 설명된 바와 같이 모니터링된 방식으로 더 많은 세포를 추가할 수 있다. 이 순차적 시드는 경우에 따라 보다 일관된 결과를 제공할 수 있습니다. 표준 세포 배양과 마찬가지로 세포 생존가능성을 유지하고 격리 시 세포 응집력을 최소화하기 위해 항상 주의를 기울여야 합니다.
마이크로패터닝으로 처음 시작할 때 최종 결과에 해로운 몇 가지 잠재적 인 함정이 있습니다. 신중한 그리드 처리 및 멸균 기술, PLPP 젤의 균일한 분포, 패터닝 중 적절한 용량 및 초점, 시드 전에 세포 생존가능성의 유지가 성공을 위한 가장 중요한 고려 사항 중 하나입니다. 일부 잠재적 인 문제 및 해결 방법 목록이 표 1에 모였다.
마이크로패턴 그리드는 세포를 위치시켜 그리드 전반에 걸쳐 일관된 셀 밀도를 설정하고 틸트 시리즈 컬렉션16,18에 적합한 영역에 관심 영역을 배치하는 데 사용할 수 있습니다. 세포의 배치 및 위치는 극저온-CLEM 실험에서 상관 관계를 위한 신탁 마커로 사용될 수 있으며, 깨지기 쉬운 파인더 그리드 및 형광 선량마커의 필요성을 감소시킵니다. 그러나, 그러한 서두체 마커는 여전히 서브 마이크로미터 정확도 상관관계에 유용할 수 있다는 점에 유의해야 한다29,40. 더욱이, 격리된 세포의 균등한 분포는 또한 라멜라절단할 수 있는 세포의 수를 최대화하기 위하여 집중이온 빔 밀링(cryo-FIB) 실험에 매우 유익하다16.
저온-EM 워크플로우에 마이크로패턴이 추가되면 데이터 처리량이 측정 가능한 개선이 가능하고 잠재적으로 새로운 실험을 가능하게 할 수 있습니다. 기술이 더욱 채택되고 개발됨에 따라 ECM 그라데이션, 다중 ECM 기탁 및 미세 구조 어셈블리를 포함한 마이크로패턴의 고급 응용 분야는 극저온-ET의 기능을 더욱 확장하여 전체 세포 맥락에서 생물학적 표적과 공정을 연구할 것입니다.

저온 전자 현미경 검사법(cryo-EM)의 개발, 확장 및 다기능성으로 연구자들은 거시분자(~1nm)에서 고(~2Å) 해상도에 가까운 네이티브 상태의 광범위한 생물학적 샘플을 조사했습니다. 단일 입자 저온-EM 및 전자 회절 기술은 용액 또는 결정 상태에서 각각 1,2에서 정제 된 거대 분자에 가장 잘 적용됩니다. 냉동 전자 단층 촬영 (극저온-ET)은 박테리아, 흉피 바이러스 및 진핵 세포와 같은 대형 이종 물체의 거의 네이티브 구조 및 초구조 적 연구에 독특하게 적합합니다3. 저온-ET에서, 3차원(3D) 정보는 현미경 단계에서 샘플을 물리적으로 기울이고 샘플시리즈를 상이한 각도로 수집하여 얻어진다. 이러한 이미지 또는 틸트 계열은 종종 1~3도 단위로 +60/-60도의 범위를 다룹니다. 그런 다음 틸트 계열은 토모그램4라고도 하는 3D 볼륨으로 계산하여 재구성할 수 있습니다.
모든 저저온-EM 기술은 비정질, 비결정, 유리체 얼음의 얇은 층에 샘플을 포함시켜야 합니다. 가장 일반적으로 사용되는 극저온 고정 기술 중 하나는 샘플이 EM 그리드에 적용되고, 블로드되고, 액체 에탄 또는 액체 에탄과 프로판의 혼합물로 빠르게 급락하는 급락 동결입니다. 이 기술은 HeLa 세포5,6와 같은 배양 인간 세포를 포함하여 두께가 <100 nm에서 ~10 μm까지의 시료의 진동에 충분하다. 두께가 최대 200 μm인 미니 오가노이드 또는 조직 생검과 같은 두꺼운 샘플은 고압 동결에 의해 진동될 수 있다7. 그러나, 두꺼운 시료의 전자 산란 증가로 인해, 극저온-ET에 대한 샘플 및 얼음 두께는 300kV 전송 전자 현미경에서 ~0.5-1 μm로 제한됩니다. 따라서, 많은 진핵세포의 전세포 극저온-ET는 극저온-절개8 또는 집중이온 빔 밀링9,10,11과 같은 추가 시료 준비 단계가 사용되지 않는 한 세포 주변 또는 세포의 확장에 한정된다.
많은 전세포 저온-ET 이미징 실험의 한계는 데이터 수집 처리량12입니다. 수천 개의 격리된 입자가 단일 TEM 그리드 정사각형에서 종종 이미지화될 수 있는 단일 입자 저온-EM과 달리 세포는 크고 확산되며, 세포가 얇은 유리체 층에서 보존될 수 있도록 충분히 낮은 밀도로 재배되어야 합니다. 종종 관심 영역은 셀의 특정 피쳐 또는 하위 영역으로 제한됩니다. 추가 처리량을 제한하는 것은 TEM 그리드 바 의 온 또는 그 근처에서와 같은 TEM 이미징에 대해 불가능한 영역에서 성장하는 세포의 성향입니다. TEM 그리드의 세포 배양과 관련된 예측할 수 없는 요인으로 인해 데이터 수집을 위한 샘플 접근성 및 처리량을 개선하기 위해 기술 개발이 필요합니다.
부착 된 세포 매트릭스 (ECM) 단백질을 사용한 기판 미세 패턴은 유리 및 기타 조직 배양 기판과 같은 경직되고 내구성이 뛰어나며 광학적으로 투명한 표면에서 세포의 성장을 지시하기 위한 살아있는 세포 광 현미경 검사법을 위한 잘 확립된 기술입니다13,14. 마이크로패터닝은 또한 연약및/또는 3차원(3D) 표면에서 수행되었습니다. 이러한 기술은 세포의 정확한 위치 지정을 허용했을 뿐만 아니라; 그들은 또한 패턴 신경 세포 회로15와 같은 다세포 네트워크의 생성을 지원했습니다. 저온 ET에 마이크로패턴을 도입하면 처리량이 증가할 뿐만 아니라 복잡하고 역동적인 세포 마이크로환경을 탐색하기 위한 새로운 연구도 열 수 있습니다.
최근에는 여러 접근 방식을 통해 TEM 그리드에서 마이크로패터닝 기술을 사용하기 시작한 여러 그룹이 16,17입니다. 여기서, TEM 그리드용 마스크리스 포토패팅 기법을 사용하는 것은 고해상도 및 비접촉식 패터닝을 특징으로 하는 Alvéole PRIMO 마이크로패터닝 시스템을 사용하여 설명된다. 이 마이크로패턴 시스템을 사용하면 기판 상단에 안티 폴링 층이 적용되고, 이어서 자외선 레이저를 사용하는 사용자 정의 패턴에서 광촉매 및 안티 폴링 레이어의 절제를 적용한다. ECM 단백질은 적절한 세포 배양을 위한 패턴에 첨가될 수 있다. 이 방법은 망막 안료 상피-1 (RPE1), Madin-Darby 개 신장 II (MDCKII), 인간 포피 피부 섬유아세포 (HFF), 및 내피 세포 주 16,17,18의 저온 ET 연구를 위해 여러 그룹에 의해 사용되었습니다. 이 마이크로패턴 시스템은 다중 항오염층 기판뿐만 아니라 액체 또는 젤 광촉매 시약과 호환됩니다. 다양한 ECM 단백질을 선택 및 세포선의 특이성에 맞게 조정될 수 있으며, 사용자에게 다재다능함을 부여한다.
마이크로패터닝은 실험실내에서 다수의 프로젝트에 성공적으로 적용되었습니다19. 여기서, 마이크로패턴 프로토콜은 배양된 HeLa 세포를 연구하기 위한 특정 적응, 호흡 싱크성 바이러스(RSV)-감염된 BEAS-2B 세포, 및 1차 애벌레 드로소필라 멜라노가스터 뉴런20을 포함한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

전세포 극저온 전자 단층 촬영(cryo-ET)은 세포 컨텍스트에 존재하고 거의 네이티브 냉동 수화 상태로 보존된 거대 분자의 나노미터 수준의 해상도 구조를 생성하는 데 사용되는 강력한 기술입니다. 그러나, 그들의 생리적인 상태에 있는 세포를 유지하면서 단층 촬영에 적합한 방식으로 TEM 격자에 세포를 배양 및/또는 준수와 관련되었던 도전이 있습니다. 여기서, TEM 그리드에서 진핵 세포 성장을 직접 및 촉진하기 위해 마이크로패터닝을 사용하는 방법에 대한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다. 마이크로패터닝 하는 동안, 세포 성장은 다른 지역이 안티 폴링 층으로 코팅된 채로 남아있는 동안 TEM 그리드의 호일에 지정된 패턴 및 위치 내에서 세포 매트릭스(ECM) 단백질을 증착하여 지시된다. 표면 코팅 및 패턴 설계의 선택의 유연성은 마이크로 패터닝을 광범위한 세포 유형에 광범위하게 적용할 수 있게 합니다. 마이크로패터닝은 개별 세포 내의 구조뿐만 아니라 숙주 병원체 상호 작용 또는 분화 된 다세포 커뮤니티와 같은 보다 복잡한 실험 시스템에 유용합니다. 마이크로패터닝은 또한 코르타상대광 및 전자 현미경검사법(cryo-CLEM) 및 집중이온 빔 밀링(cryo-FIB)을 포함한 많은 하류 전세포 냉동고-ET 워크플로우에 통합될 수 있다.

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Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

이 프로토콜의 목표는 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 그리드의 표적 영역에 세포 접착 및 성장을 지시하는 것입니다. 이는 세포 종자 전에 패턴화된 영역에서 세포외 매트릭스 단백질의 증착에 따라 사용자 지정 패턴에서 절제되는 항 파울링 층을 적용함으로써 달성된다.

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

우리의 연구 팀은 극저온 전자 현미경 검사법과 극저온 전자 단층 촬영을 위한 기술 및 프로토콜을 개발합니다. 우리는 극저온-ET 실험을 위한 세포 성장 및 포지셔닝을 지시하기 위해 TEM 그리드를 마이크로패터닝하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 전세포 극저온 전자 단층 촬영은 네이티브 냉동 수화 상태로 보존된 세포 내의 거대 분자 복합체의 나노미터 수준의 해상도 구조를 생성하는 데 사용됩니다.마이크로패턴화는 전세포 냉동고-ET, 저온-상반신 광 전자 현미경 검사법 및 저온 중심이온 빔 밀링 실험의 처리량을 증가시킬 수 있다. EM 그리드에 있는 세포의 수 그리고 분포는 전세포 cryo-ET 연구 결과에 중요합니다. 이 프로토콜은 마이크로패터닝을 통해 EM 그리드에서 세포 성장을 유도하는 신속하고 재현 가능한 광범위하게 적응가능한 방법을 제공합니다.조사관은 파이펫, 핀셋, 기본 세포 배양 기술, 형광 및 전송 전자 현미경을 사용하여 편안해야합니다. 처음으로 패킹시, 잘 알려진 세포 유형과 ECM 조합을 사용하여 커버립 이나 MatTek 접시에 그들을 테스트. 이 프로토콜 개발에 관여하는 연구 팀 구성원은 다음과 같습니다.브라이언 시버트, 조셉 김, 양 박사. 먼저 그리드 를 그리드 준비 홀더로 옮기고 광채를 배출하여 그리드 탄소 측을 위로 위로 전달합니다. 다음으로, 탄소 면으로 그리드를 깨끗한 유리 슬라이드 또는 커버슬립까지 전송하여 그리드 간에 적어도 1센티미터 분리합니다.파이펫 10 마이크로리터 0.05 폴리-L-리신을 각 그리드에 올리고 적어도 30분 동안 습한 챔버에서 그리드를 배양한다. 인큐베이션 후 pH 8.5에서 0.1 개의 어금니 HEPES의 15 마이크로 리터로 각 그리드를 세 번 세척하십시오. 각 세척에서 그리드를 30초 동안 배양한 다음 그리드를 건조시키지 않고 파이펫으로 대부분의 액체를 그리드에서 제거합니다.마지막 세척 후 각 그리드를 0.1 개의 어금니 HEPES의 15 마이크로 리터에 둡니다. 다음으로 PEG-SVA 솔루션을 준비하고 그리드의 HEPES 솔루션을 PEG-SVA 용액의 10 마이크로리터로 즉시 교체한 다음 습한 챔버에서 그리드를 1시간 이상 배양합니다. 인큐베이션 후, 각 그리드를 멸균수 15마이크로리터로 세 번 세척하여 각 세척시 그리드를 30초 동안 배양합니다.마지막 세척 후, 물 15 마이크로 리터에 각 그리드를 둡니다. 새로운 클린 커버슬립의 중앙에 마이크로리터 한 방울의 물을 한 방울 만드신 다음, 15마이크로리터 물 방울에서 탄소 면을 위로 한 새로운 커버슬립의 드롭으로 조심스럽게 그리드를 옮기습니다. 다음으로, 그리드를 중심으로 유지하고 그리드의 탄소 호일과 스텐실 접촉을 최소화하는 그리드 위에 PDMS 스텐실에 신중하게 배치합니다.그런 다음 PLPP 젤 1마이크로리터를 그리드에 넣고 파이펫을 부드럽게 섞습니다. 그리드가 있는 커버슬립을 어두운 위치로 이동하여 건조시다. 젤은 15-30 분 안에 건조합니다.마이크로 패터닝을 위해 현미경에서 라이브 브라이트 필드 보기로 소프트웨어를 엽니 다. 초기 실행에 대한 새 템플릿을 디자인하려면 ROI 추가를 선택하고 3, 000 마이크로미터 원을 선택합니다. 화면의 브라이트필드 이미지를 사용하여 그리드 위에 원 ROI를 배치한 다음 잠금을 눌러 ROI를 고정합니다.ROI를 제자리에 고정한 후 패턴 추가를 선택하고 적절한 패턴을 선택합니다. 복제 옵션을 사용하여 초기 패턴의 복사본을 생성하여 8개당 8개의 그리드 정사각형 영역을 만듭니다. 패턴을 그리드 사각형과 정렬하려면 필요에 따라 간격과 각도를 조정합니다.패턴을 그리드의 한 구석에 배치합니다. 다음으로, 패턴을 복제하고 각 영역에 필요한 현미경 단계를 이동하는 그리드의 네 모서리 각각에 사본을 배치합니다. 복제 옵션을 사용하여 8/8 그리드 사각형 영역을 중앙 양쪽에 배치할 8개 그리드 사각형 영역을 2~8개의 그리드 사각형 영역으로 수정합니다.중앙 4개의 그리드 사각형을 패턴이 없는 상태로 둡니다. 각 패턴에 대해 필요한 경우 총 용량을 조정합니다. 평방 밀리미터당 30 밀리줄은 좋은 출발점입니다.전문가 옵션에서 패턴의 각도, 위치, 공간 및 비율을 조정하여 패턴의 정렬을 그리드 사각형과 조정합니다. 현미경 스테이지를 이동하여 브라이트필드 디스플레이의 그리드 영역을 변경합니다. 템플릿과 패턴이 배치되면 소프트웨어의 작업 패널의 영역 중 하나를 제외한 모든 영역을 선택 취소합니다.현미경 단계를 사용하여 해당 영역으로 이동하여 탄소 호일에 집중하십시오. 액션 패널의 안구 아이콘을 클릭하여 패턴 오버레이 디스플레이를 전환합니다. 그리드가 집중되면 브라이트필드 셔터를 닫고 소프트웨어 오른쪽 하단에 있는 Play 아이콘을 눌러 실시간으로 모니터링할 수 있는 패터닝 프로세스를 시작합니다.모든 영역이 패턴화될 때까지 이 단계를 반복합니다. 마지막으로, 현미경에서 그리드로 커버슬립을 제거하고 즉시 10 마이크로리터의 멸균 PBS를 그리드에 추가합니다. 10분 후 핀셋으로 스텐실을 제거한 다음, 15마이크로리터의 PBS로 그리드를 세 번 세척하고 각 그리드를 PBS에 어두운 위치에 둡니다.각 그리드에 대해 세포외 매트릭스의 15 마이크로리터를 준비한 다음 각 그리드에서 PBS를 세포외 매트릭스의 15 마이크로리터로 교체하고 습한 챔버에서 그리드를 적어도 한 시간 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 이전에 설명한 것처럼 멸균 PBS 의 15 마이크로리터로 각 그리드를 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, PBS에 각 그리드를 둡니다.형광 현미경을 사용하여, 패터닝을 확인하기 위해 세포 외 매트릭스의 형광을 감지하고 탄소 호일은 그대로 유지된다. 마이크로패턴 및 무패턴 TEM 그리드에 시드된 HeLa 세포는 칼세인 AM및 에티듐 호모머-1 기반 세포 생존가능성 분석기를 사용하여 형광 염색에 의해 볼 수 있다. 혼합 콜라겐과 피브리노겐 세포 외 매트릭스를 사용하여 HeLa 세포는 그리드 전체의 패턴을 쉽게 준수합니다.패턴을 따라 확장 된 세포의 전반적인 형태는 패턴되지 않은 그리드에서 자란 세포의 형태와 유사합니다. RSV 감염 BEAS-2B 세포의 브라이트 필드 이미지는 18 시간 포스트 시드 패턴의 중앙 영역을 따라 세포 접착 및 성장을 보여줍니다. 감염된 세포의 대부분은 그라데이션 패턴의 고밀도 중앙 영역을 따라 배치된다.RSV 변이체는 마이크로패턴 그리드에서 자란 감염된 BEAS-2B 세포의 주변에 가깝게 위치한다. 많은 RSV 구조 단백질은 뉴클레오캡시드 및 바이러스 융합 단백질을 포함하는 토모그램 내에서 확인된다. 마이크로패턴 그리드에서 범신경 GFP 발현을 사용하는 드로소필라 뉴런은 형광 라벨링과 마이크로패턴 내에 있는 위치로 인해 가벼운 현미경 검사법에 의해 쉽게 추적할 수 있습니다.패턴되지 않은 그리드의 뉴런은 또한 빛 현미경 검사법에 의한 GFP 신호를 통해 추적될 수 있습니다. 그러나, 극저온 전자 현미경 검사법에서 찾아내는 것은 세포 파편 및 매체에서 오염 때문에 어려워집니다. 뉴런 세포 체체및 확장된 중성염의 치수로 인해, 저온 전자 단층 촬영 기울기 계열은 더 높은 배율로 세포의 얇은 영역을 따라 수집됩니다.신경 세포 막, 미토콘드리아, 마이크로투룰, 액틴 필라멘트, 혈관 구조 및 리보솜과 같은 거대 분자는 3D 토모그램을 통해 더 높은 배율 이미지 몽타주와 슬라이스에서 잘 해결된다. 유사한 세포 외 특징은 패턴되지 않은 뉴런의 3D 토모그램에서 관찰됩니다. 그리드에 스텐실을 적용하고 PLPP 젤에 추가하는 것은 패터닝 결과에 영향을 미칠 수 있고 주의해서 수행해야 하는 가장 민감한 단계입니다.Cryo-CLEM은 cryo-ET 데이터 수집을 위해 셀 내에서 관심 있는 대상을 현지화하는 데 사용할 수 있습니다. Cryo-FIB-SEM은 데이터 수집을 위해 너무 두꺼운 영역에서 얇은 셀에 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

시간 해결 된 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 빠른 그리드 준비

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

연구

생화학

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

초저온 전자 현미경 구조 결정을 위한 DNA 복구 인자와 복합체화된 뉴클레오솜 코어 입자의 준비

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

초저온 전자 현미경으로 미세소관-단백질 복합체를 연구하기 위해 포유류 세포에서 변형된 미세소관 추출

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

고분해능 구조 측정을 위해 Monolayer Graphene을 Cryo-Electron Microscopy Grid에 적용

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

포유류 세포의 In Situ Cryotomography를 위한 시료 전처리

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...