Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Vi takker Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang og Mrs. Josephine W. Mitchell i Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison for sjenerøst å dele elav-Gal4, UAS-CD8::GFP flystamme (Bloomington stock center, #5146). Vi vil også takke Dr. Aurélien Duboin, Mr. Laurent Siquier og Ms. Marie-Charlotte Manus fra Alvéole og Mr. Serge Kaddoura fra Nanoscale Labs for deres generøse støtte under dette prosjektet. Dette arbeidet ble delvis støttet av University of Wisconsin, Madison, Institutt for biokjemi ved University of Wisconsin, Madison og folkehelsetjenesten gir R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 og U24 GM139168 til E.R.W. og R01 AI150475 til P.W.S. fra NIH. En del av denne forskningen ble støttet av NIH grant U24 GM129547 og utført ved PNCC ved OHSU og åpnet gjennom EMSL (grid.436923.9), et DOE Office of Science User Facility sponset av Office of Biological and Environmental Research. Vi er også takknemlige for bruken av fasiliteter og instrumentering ved Cryo-EM Research Center ved Institutt for biokjemi ved University of Wisconsin, Madison.

<ol>
	<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM:+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity.">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+electron+crystallography+of+2D+crystals+to+MicroED+of+3D+crystals.">From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals.</a> Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-the+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>B&#228;uerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+native+Drosophila+tissues+vitrified+by+plunge+freezing.">Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing.</a> bioRxiv. , 437159 (2021).</li><li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells.">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).</li><li>Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+Electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).</li><li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> Elife. 8, 45919 (2019).</li><li>Wu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+neuronal+networks.">Micropatterning neuronal networks.</a> Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+micropatterning+technology+for+whole+cell+cryogenic+electron+microscopy+studies.">Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+micropatterning+for+cryo-electron+tomography+studies+of+cell-cell+contacts.">Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts.</a> bioRxiv. , 272237 (2021).</li><li>Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+cryo-electron+tomography+of+cultured+and+primary+eukaryotic+cells+on+micropatterned+TEM+grids.">Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids.</a> bioRxiv. , 447251 (2021).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons.">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+assembly+of+respiratory+syncytial+virus+revealed+by+cryo-electron+tomography.">The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography.</a> Viruses. 10 (8), (2018).</li><li>Stobart, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+RSV+vaccine+with+engineered+thermostability+is+immunogenic+in+cotton+rats+despite+high+attenuation.">A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation.</a> Nature Communications. 7, 13916 (2016).</li><li>Hotard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stabilized+respiratory+syncytial+virus+reverse+genetics+system+amenable+to+recombination-mediated+mutagenesis.">A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis.</a> Virology. 434 (1), 129-136 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+virus+assembly+and+organization+by+the+measles+virus+matrix+protein.">Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein.</a> Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).</li><li>Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+situ+neuronal+model+for+cryo-ET.">A new in situ neuronal model for cryo-ET.</a> Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition.">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+method+for+cryo-electron+tomography:+Characterizing+stage+behavior+during+FISE+acquisition.">Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).</li><li>Anderson, D. E., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+micropatterning:+methods,+effects,+and+applications.">Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications.</a> Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+components+for+cell+culture.">Use of extracellular matrix components for cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).</li><li>Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy.">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).</li><li>Schellenberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+correlative+fluorescence+and+electron+cryo+microscopy+using+two+independent+alignment+markers.">High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers.</a> Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Moderne, avanserte elektronmikroskoper og programvarepakker støtter nå strømlinjeformet automatisert kryo-EM- og cryo-ET-datainnsamling der hundrevis til tusenvis av stillinger kan målrettes og avbildes i løpet av få dager32,33,34,35. En betydelig begrensende faktor for kryo-ET-arbeidsflyter i hele cellen har vært å oppnå tilstrekkelig antall mål som kan samles inn per rutenett. Nylig har en rekke grupper utviklet protokoller for mikropatterning av rutenett for kryo-EM, med en fordel å forbedre datainnsamlingseffektiviteten16,17,18. Her presenteres en protokoll for bruk av et kommersielt tilgjengelig mikropatteringssystem til mikropattern TEM-rutenett for kryo-ET-studier av primære Drosophila-nevroner og kultiverte menneskelige cellelinjer (uinfisert eller RSV-infisert). Dette mikropatterningssystemet er allsidig, og mange trinn kan optimaliseres og skreddersys for å passe til spesifikke eksperimentelle mål. En bruker med TEM- og fluorescensmikroskopierfaring kan raskt bli dyktig i nettforberedelse og mikropattering. Med forsiktig praksis bør gode resultater oppnås etter noen gjentakelser. Nedenfor diskuteres noen av alternativene som er tilgjengelige, brukerhensyn, potensielle fordeler og fremtidige anvendelser av mikropattering for cryo-EM.
En av de viktige hensynene for hele celle cryo-ET er EM rutenettvalg. EM-gitter består av to deler: en maskeramme (eller strukturell støtte) og folien (eller filmen), som er den kontinuerlige eller hullete filmoverflaten som cellene vil vokse på. Kobbernettgitter brukes ofte til kryo-EM av proteiner og isolerte komplekser. Imidlertid er de uegnet for hele celle cryo-ET på grunn av cytotoksisiteten til kobber. I stedet brukes et gullnett ofte til cellulær tomografi. Andre alternativer inkluderer nikkel eller titan, som kan gi fordeler over gull som økt stivhet16. EM-rutenett er tilgjengelige med forskjellige maskedimensjoner for å støtte en rekke applikasjoner. Større maskestørrelser gir mer plass til celler å vokse mellom rutenett og flere områder som er egnet for vippeseriesamling, men på bekostning av økt generell prøveskjørhet. Den mest brukte folien er perforert eller hullete amorf karbon, for eksempel Quantifoils eller C-flate gitter. Biologiske mål kan avbildes enten gjennom hullene i karbonet eller gjennom det elektron-gjennomskinnelige karbonet. Gitter som R 2/1 eller R 2/2, der hullene er 2 μm brede som er henholdsvis 1 og 2 μm fra hverandre, gir et stort antall hull og dermed et stort antall potensielle områder for datainnsamling. Noen celler kan imidlertid vokse og ekspandere bedre på mer ensartede overflater som R 1.2/20 rutenett eller kontinuerlig karbon. For nedstrøms prøvebehandling ved fokusert ionstrålefresing (cryo-FIB) fjernes folien gjennom fresing, noe som reduserer bekymringene over den underliggende filmens fortsatte tilstedeværelse. Som med masken er folier fra andre materialer også tilgjengelige, med mønsterprotokollen presentert her som like egnet for SiO2-rutenett . Vanlige rutenett inkluderer gull Quantifoil, kontinuerlig karbon, eller SiO2 film 200-mesh rutenett (~ 90 μm avstand mellom rutenettstenger) for hele celle cryo-ET.
Det er en rekke hensyn å ta når du utformer et mønster. Et flertall av disse beslutningene styres av celletypen og formålet med eksperimentet. Et godt utgangspunkt er å velge et mønster som tilnærmer seg formen og dimensjonene til cellene i kulturen. Mange studier har vist signifikante effekter av mønsterform på cellevekst og cytoskeletal arrangement13,36,37. Spesiell forsiktighet bør tas under mønsterdesign hvis dette kan endre målet for interesse. Flere mønstre for hver celletype ble testet for å bestemme hvilke mønstre som fremmet cellulær vedheft og vekst. Fleksibiliteten til mikropatterningssystemet tillater testing av flere mønstre på et enkelt rutenett og endrede mønstre for forskjellige rutenett i et enkelt eksperiment. Større mønstre (~50-90 μm), for eksempel de som brukes her, øker sannsynligheten for at flere celler holder seg til ett enkelt område av mønsteret og lar cellene utvide seg og strekke seg etter vedheft. Mer begrensede mønstre (20-30 μm) kan være hensiktsmessige i eksperimenter der celleisolasjon er mer kritisk enn celleutvidelse, for eksempel for eksperimenter med stråle fresing (cryo-FIB). For tomografiapplikasjoner kan det hende man må vurdere virkningen av vippeaksen. Hvis et mønster er plassert slik at alle celler vokser parallelt med hverandre i en enkelt retning, er det mulig at alle cellene vil være vinkelrett på vippeaksen når de lastes inn i mikroskopstadiet, noe som resulterer i en lavere kvalitet på data.
På uberørte rutenett holder celler seg ofte fortrinnsvis til rutenettlinjene, der de ikke kan avbildes av TEM. Selv på mønstrede rutenett observeres celler ofte å være plassert i hjørnene av rutenett firkanter delvis på både mønstret karbonfolie og rutenettstang. Nylig ble mikropatterning brukt til å bevisst plassere en del av cellen over rutenettet bar18. Dette kan vurderes for eksperimenter der det ikke er kritisk å ha hele celleperiphery på folien. Dette kan være spesielt viktig for celler som kan bli større enn en enkelt rutenetts firkant, for eksempel primære nevroner som vokser over flere dager.
Det er mange verktøy som kan brukes til å designe et mønster. Her var mønsteret begrenset til mindre enn 800 piksler i en hvilken som helst dimensjon, slik at mønsteret kan roteres til en hvilken som helst vinkel og fortsatt passe innenfor det maksimale området som kan mønstres i en enkelt projeksjon av dette mikropatterningssystemet. Dette gjør at brukeren kan rotere mønsteret slik at det er riktig orientert med rutenettet uavhengig av retningen på rutenettet på mikroskopet. Her ble rutenettet delt inn i seks mønsterområder. Dette gjør det først og fremst mulig å justere fokus mellom ulike områder i rutenettet. Spesielt gullgitter er veldig formbare og kan ikke legge seg helt flatt på glasset. Riktig fokus er avgjørende for rene, raffinerte mønsterresultater. Ved å bruke segmenterte mønstre må det bare foretas mindre justeringer i mønsterposisjonen hvis rutenettet skifter litt under mønsterprosessen, selv om dette vanligvis ikke er et problem når du bruker PLPP-gelen med PDMS-sjablongene. Til slutt forble de sentrale fire rutenettplassene i rutenettet uberørt. Dette støtter en bruker som tydelig kan identifisere midten av rutenettet, noe som er veldig nyttig for korrelative bildebehandlingsforsøk.
Mønsterprogramvaren for dette mikropatterningssystemet, Leonardo, har også mer avanserte funksjoner som søm og muligheten til å importere mønstre som PDF-filer, som er utenfor omfanget av denne protokollen. Denne programvaren inkluderer også mikrostrukturdeteksjon og automatisert mønsterposisjonering som kan brukes på TEM-rutenett. Denne funksjonen er mest nyttig når rutenettet er veldig flatt og kan mønstres uten å måtte justere fokus mellom forskjellige områder.
Valg av et ECM-protein kan ha en betydelig innvirkning på celleadhesjon og ekspansjon. Noen celler er kjent for å gjennomgå fysiologiske endringer når de vokser på spesifikke substrater38. Flere ECM-proteiner og konsentrasjoner ble testet for alle nye celletyper basert på tidligere arbeid rapportert i litteraturen. Laminin, fibrinogen, fibronectin og kollagen er mye brukt til dyrkede celler og kan brukes som utgangspunkt hvis andre data ikke er tilgjengelige. Imidlertid må andre ECM-proteiner også vurderes hvis de ofte brukte ECM-proteinene ikke gir riktige tilslutningsegenskaper for cellene. Dette gjaldt spesielt for primære Drosophila-nevroner , da en høy konsentrasjon av plantens lectin concanavalin A var nødvendig for riktig cellulær overholdelse. Kompatibiliteten til cellulær vedheft og vekst med ECM kan testes ved å mønstre på glassretter eller lysbilder før overgangen til TEM-rutenett. Denne pre-screening tilnærmingen er tid og kostnadseffektiv hvis et stort antall kombinasjoner må undersøkes. Inkluderingen av et fluorescerende konjugert ECM-protein er verdifullt for å vurdere suksess og kvalitet på mønster.
Cellesåing er et av de viktigste trinnene for hele celle cryo-ET, enten med eller uten mikropatterning6,16,39. For primære Drosophila eller andre nevroner, som er skjøre, ustabile i suspensjon, og kan være begrenset i mengde, foretrekkes enkeltsåingsmetoder fremfor overvåket, sekvensiell cellesåing. Et enkelt såingstrinn med en optimalisert celletetthet, som beskrevet i protokollen for Drosophila-nevroner, er et levedyktig alternativ for de fleste celletyper. Det er imidlertid også mulig å frø celler på substratet ved en lavere innledende konsentrasjon og legge til flere celler på en overvåket måte som beskrevet her og i annen litteratur18. Denne sekvensielle såingen kan gi mer konsistente resultater i noen tilfeller. I likhet med standard cellekultur, bør det alltid tas hensyn til å opprettholde celle levedyktighet og minimere cellekumping under isolasjon.
Når du først starter med mikropatterning, er det noen få potensielle fallgruver som er skadelige for sluttresultatet. Forsiktig netthåndtering og steril teknikk, en jevn fordeling av PLPP gel, riktig dose og fokus under mønster, og vedlikehold av celle levedyktighet før såing er blant de viktigste hensynene for suksess. En liste over noen av de potensielle problemene samt løsningene ble satt sammen i tabell 1.
Mikropatterned rutenett kan brukes til å posisjonere celler for å etablere en konsekvent celletetthet over rutenettet og for å plassere områder av interesse i områder som passer for tilt-serie samling16,18. Plassering og posisjonering av celler kan brukes som fiducial markører for korrelasjon i kryo-CLEM-eksperimenter, noe som reduserer behovet for skjøre søkergitter og fluorescerende fiducial markører. Det skal imidlertid bemerkes at slike fiducial markører fortsatt kan være nyttige for submikrometernøyaktighetskorrelasjon29,40. Videre er en jevn fordeling av isolerte celler også svært gunstig for fokusert ionstråle fresing (cryo-FIB) eksperimenter for å maksimere antall celler hvor lamell kan kuttes16.
Tillegg av mikropatterning til cryo-EM-arbeidsflyter vil resultere i målbare forbedringer i datagjennomstrømning og potensielt muliggjøre nye eksperimenter. Etter hvert som teknikken blir videre tatt i bruk og utviklet, vil mer avanserte anvendelser av mikropatterning inkludert ECM-gradienter, flere ECM-avsetninger og mikrostrukturmontering ytterligere utvide egenskapene til kryo-ET for å studere biologiske mål og prosesser i full cellulær kontekst.

Med utvikling, ekspansjon og allsidighet av kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har forskere undersøkt et bredt spekter av biologiske prøver i en nesten innfødt tilstand fra makromolekylær (~ 1 nm) til høy (~ 2 Å) oppløsning. Enpartikkel kryo-EM og elektron diffraksjonsteknikker brukes best på rensede makromolekyler i henholdsvis løsning eller i krystallinsk tilstand. Mens kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er unikt egnet for nesten innfødte strukturelle og ultrastrukturelle studier av store, heterofile gjenstander som bakterier, pleomorfiske virus og eukaryote celler3. I cryo-ET innhentes tredimensjonal (3D) informasjon ved å fysisk vippe prøven på mikroskopstadiet og skaffe seg en serie bilder gjennom prøven i forskjellige vinkler. Disse bildene, eller vippeseriene, dekker ofte et område på +60/-60 grader i trinn på én til tre grader. Tilt-serien kan deretter rekonstrueres til et 3D-volum, også kjent som et tomogram4.
Alle cryo-EM-teknikker krever at prøven bygges inn i et tynt lag med amorf, ikke-krystallinsk, glassaktig is. En av de mest brukte kryofikseringsteknikkene er dykkfrysing, hvor prøven påføres EM-rutenettet, blottet og raskt dyppet i flytende etan eller en blanding av flytende etan og propan. Denne teknikken er tilstrekkelig for vitrifisering av prøver fra <100 nm til ~ 10 μm i tykkelse, inkludert dyrkede menneskelige celler, for eksempel HeLa-celler5,6. Tykkere prøver, som miniorganoider eller vevsbiopsier, opptil 200 μm i tykkelse, kan vitrifiseres ved høytrykksfrysing7. På grunn av økt elektronspredning av tykkere prøver er imidlertid prøve- og istykkelsen for kryo-ET begrenset til ~ 0,5 - 1 μm i 300 kV overføringselektronmikroskop. Derfor er helcellet kryo-ET av mange eukaryote celler begrenset til celleperikodeien eller utvidelser av celler med mindre ytterligere prøveforberedelsestrinn brukes, for eksempel kryo-seksjonering8 eller fokusert-ion-stråle fresing9,10,11.
En begrensning av mange kryo-ET-bildeeksperimenter i hele celler er datainnsamlingsgjennomstrømming12. I motsetning til en-partikkel cryo-EM, hvor tusenvis av isolerte partikler ofte kan avbildes fra en enkelt TEM rutenett firkant, celler er store, spredt ut, og må dyrkes med lav nok tetthet til at cellene kan bevares i et tynt lag av glassaktig is. Interesseområdet er ofte begrenset til en bestemt funksjon eller et bestemt underområde i cellen. Ytterligere begrensende gjennomstrømning er cellenes tilbøyelighet til å vokse på områder som ikke er mottagelige for TEM-avbildning, for eksempel på eller i nærheten av TEM-rutenettstenger. På grunn av uforutsigbare faktorer knyttet til cellekultur på TEM-nett, er det nødvendig med teknologisk utvikling for å forbedre utvalgets tilgjengelighet og gjennomstrømning for datainnsamling.
Substratmikropattering med adherent ekstracellulære matriseproteiner (ECM) er en veletablert teknikk for levende cellelysmikroskopi for å lede veksten av celler på stive, holdbare og optisk gjennomsiktige overflater som glass og andre vevskultursubstrater13,14. Mikropattering er også utført på myke og/eller tredimensjonale (3D) overflater. Slike teknikker har ikke bare tillatt for presis plassering av celler; de har også støttet opprettelsen av multicellulære nettverk, for eksempel mønstrede nevrale cellekretser15. Å bringe mikropatterning til cryo-ET vil ikke bare øke gjennomstrømningen, men det kan også åpne opp nye studier for å utforske komplekse og dynamiske cellulære mikromiljø.
Nylig har flere grupper begynt å bruke mikropatterningsteknikker på TEM-rutenett gjennom flere tilnærminger16,17. Her beskrives bruken av en maskerløs fotopatteringsteknikk for TEM-rutenett ved hjelp av Alvéole PRIMO mikropatterningssystem, som har høy oppløsning og kontaktløs mønster. Med dette mikropatteringssystemet påføres et anti-fouling-lag på toppen av substratet, etterfulgt av påføring av en fotokaalyst og ablasjon av anti-fouling laget i brukerdefinerte mønstre med en UV-laser. ECM-proteiner kan deretter legges til mønstrene for riktig cellekultur. Denne metoden har blitt brukt av flere grupper for kryo-ET-studier av retinal pigment epitelial-1 (RPE1), Madin-Darby hunde nyre-II (MDCKII), human forhud fibroblast (HFF), og endotelcellelinjer16,17,18. Dette mikropatterningssystemet er kompatibelt med flere anti-fouling lag substrater samt enten en væske eller gel fotokatoklystrest reagens. En rekke ECM-proteiner kan velges fra og tilpasses spesifiktheten til cellelinjen, noe som gir allsidighet for brukeren.
Mikropattering har blitt brukt på en rekke prosjekter innen laboratoriet19. Her presenteres en mikropatterningsprotokoll, inkludert spesifikke tilpasninger for å studere dyrkede HeLa-celler, respiratorisk synytialvirus (RSV)-infiserte BEAS-2B-celler og primære larval Drosophila melanogaster neurons20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

Helcellet kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er en kraftig teknologi som brukes til å produsere nanometernivåoppløsningsstrukturer av makromolekyler tilstede i cellulær kontekst og bevart i en nesten innfødt frossen-hydrert tilstand. Det er imidlertid utfordringer knyttet til å dyrke og/eller feste celler på TEM-rutenett på en måte som er egnet for tomografi, samtidig som cellene beholdes i sin fysiologiske tilstand. Her presenteres en detaljert trinnvis protokoll om bruk av mikropatterning for å lede og fremme eukaryotisk cellevekst på TEM-rutenett. Under mikropattering styres celleveksten ved å deponere ekstracellulære matriseproteiner (ECM) innenfor spesifiserte mønstre og posisjoner på folien til TEM-rutenettet, mens de andre områdene forblir belagt med et anti-begroingslag. Fleksibilitet i valg av overflatebelegg og mønsterdesign gjør mikropatterning bredt anvendelig for et bredt spekter av celletyper. Mikropatterning er nyttig for studier av strukturer i individuelle celler, samt mer komplekse eksperimentelle systemer som vertspatogeninteraksjoner eller differensierte multi-cellulære samfunn. Mikropattering kan også integreres i mange nedstrøms hele celle cryo-ET arbeidsflyter, inkludert korrelativt lys og elektronmikroskopi (cryo-CLEM) og fokusert ionstråle fresing (cryo-FIB).

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Målet med denne protokollen er å lede celleadhesjon og vekst til målrettede områder av rutenett for kryo-elektronmikroskopi. Dette oppnås ved å påføre et anti-fouling lag som er ablated i brukerspesifiserte mønstre etterfulgt av avsetning av ekstracellulære matriseproteiner i de mønstrede områdene før cellesåing.

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Vårt forskningsteam utvikler teknologier og protokoller for kryo-elektronmikroskopi og kryo-elektrontomografi. Vi har utviklet protokoller for mikropattering av TEM-nett for å lede cellevekst og posisjonering for cryo-ET-eksperimenter. Helcellet kryo-elektrontomografi brukes til å produsere nanometernivåoppløsningsstrukturer av makromolekylære komplekser i celler bevart i en innfødt frossen hydrert tilstand.Mikropattering kan øke gjennomstrømningen av helcellet kryo-ET, kryo-korrelativ lyselektronmikroskopi og kryofokuserte ionstrålefreseeksperimenter. Antall og fordeling av celler på EM-rutenett er avgjørende for hele celle cryo-ET-studier. Denne protokollen gir en rask, reproduserbar og bredt tilpasningsdyktig metode for å lede cellevekst på EM-rutenett gjennom mikropatterning.Undersøkeren skal være komfortabel med å bruke pipetter, pinsett, grunnleggende cellekulturteknikker og fluorescens og overføringselektronmikroskop. Når du mønstrer for første gang, bruk en kjent celletype og ECM-kombinasjon og test dem på coverlips eller MatTek-retter. Forskningsgruppemedlemmer som er involvert i denne protokollutviklingen er: Dr.Brian Sibert, Mr. Joseph Kim og Dr. Jae Yang. Til å begynne med, overfør gitteret til en nettforberedelsesholder og glød utslipp gitteret karbonsiden opp. Deretter overfører du gitteret med karbonsiden opp til en ren glasssklie eller dekslerlip med minst en centimeter separasjon mellom rutenettene.Pipette 10 mikroliter 0,05 poly-L-lysin på hvert rutenett og inkuberer gitteret i et fuktig kammer i minst 30 minutter. Etter inkubasjon, vask hvert rutenett tre ganger med 15 mikroliter 0,1 molar HEPES ved pH 8,5. Inkuber gitteret i hver vask i 30 sekunder, fjern deretter det meste av væsken fra rutenettet med en pipette uten å la gitteret tørke.Etter den endelige vasken, la hvert rutenett stå i 15 mikroliter med 0,1 molar HEPES. Deretter forbereder du PEG-SVA-løsningen og umiddelbart erstatter HEPES-løsningen på gitteret med 10 mikrolitere av PEG-SVA-løsningen, og inkuberer deretter gitteret i et fuktig kammer i minst en time. Etter inkubasjon, vask hvert rutenett tre ganger med 15 mikroliter sterilt vann, inkuber rutenettet i hver vask i 30 sekunder.Etter den endelige vasken, la hvert rutenett stå i 15 mikroliter vann. Plasser en mikroliterdråpe vann i midten av en ny ren dekslelip, og overfør deretter rutenettet forsiktig fra 15 mikroliter vanndråpen til dråpen på den nye dekslenlip med karbonsiden opp. Deretter plasserer du forsiktig på PDMS-sjablongen over rutenettet og holder rutenettet sentrert og minimerer sjablongkontakten med karbonfolien til rutenettet.Tilsett deretter en mikroliter PLPP gel på gitteret og pipetten forsiktig for å blande. Flytt dekslene med rutenettet til et mørkt sted for å tørke. Gelen tørker om 15 til 30 minutter.For mikropatterning, åpne programvaren med en live Brightfield-visning fra mikroskopet. Hvis du vil utforme en ny mal for en første kjøring, velger du Legg til avkastning og velger en sirkel på 3000 mikrometer. Plasser sirkel-AVKASTNINGEN over rutenettet ved hjelp av Brightfield-bildet på skjermen som en veiledning, og trykk deretter på Lås for å sikre avkastningen.Når du har låst avkastningen på plass, velger du Legg til mønster og velger riktig mønster. Bruk replikeringsalternativene til å generere kopier av det opprinnelige mønsteret for å opprette et kvadratområde på åtte x åtte rutenett. Juster avstanden og vinkelen etter behov for å justere mønstrene etter rutenettplassene.Plasser mønsteret i ett hjørne av rutenettet. Deretter dupliserer du mønsteret og plasserer en kopi i hvert av de fire hjørnene av rutenettet som flytter mikroskopstadiet etter behov for hver region. Bruk replikeringsalternativene til å endre et åtte ganger åtte rutenetts kvadratområde til et to ganger åtte rutenett firkantet område som skal plasseres på begge sider av midten.La de midterste fire rutenettsnærene være ikke oppdatert. For hvert mønster justerer du den totale dosen om nødvendig. 30 millijoule per kvadratmillimeter er et godt utgangspunkt.Under Ekspertalternativer gjentar du justeringen av vinkelen, plasseringen, avstanden mellom og forholdet mellom mønsteret for å finjustere justeringen av mønsteret med rutenettplassene. Flytt mikroskopstadiet for å endre rutenettområdet i Brightfield-visningen. Når malen og mønstrene er plassert, fjerner du merket for alle unntatt én av regionene i handlingspanelet til programvaren.Bruk mikroskopstadiet til å navigere til den regionen og fokusere på karbonfolie. Klikk på øyebollikonet i handlingspanelet for å slå av mønsteroverleggsvisningen. Når rutenettet er i fokus, lukker du Brightfield-lukkeren og trykker på Play-ikonet nederst til høyre i programvaren for å starte mønsterprosessen, som kan overvåkes live.Gjenta dette trinnet til alle områdene er mønstret. Til slutt fjerner du dekslene med rutenettet fra mikroskopet og tilsett umiddelbart 10 mikroliter steril PBS på rutenettet. Etter 10 minutter, fjern sjablongen med pinsett, vask deretter rutenettet tre ganger med 15 mikroliter PBS og la hvert rutenett stå i PBS på et mørkt sted.Forbered 15 mikroliter av den ekstracellulære matrisen for hvert rutenett, og erstatt deretter PBS fra hvert rutenett med 15 mikroliter av den ekstracellulære matrisen og inkuber rutenettet i et fuktig kammer i minst en time. Etter inkubasjon, vask hvert rutenett fem ganger med 15 mikroliter steril PBS som vist tidligere. Etter den endelige vasken, la hvert rutenett stå i PBS.Bruk et fluorescensmikroskop, oppdag fluoroforen i den ekstracellulære matrisen for å bekrefte mønster og at karbonfolie forblir intakt. HeLa celler frøet på mikropatterned og unpatterned TEM rutenett er synlige ved fluorescerende farging ved hjelp av en calcein AM og ethidium homodimer-1 basert celle levedyktighet analyse. Ved hjelp av en blandet kollagen og fibrinogen ekstracellulær matrise holder HeLa-cellene seg lett til mønstre over hele rutenettet.Den generelle morfologien til celler som utvidet seg langs mønsteret, ligner på celler som vokser på uberørte rutenett. Et Brightfield-bilde av RSV-infiserte BEAS-2B-celler 18 timer etter sådd viser celleadhesjon og vekst langs den sentrale delen av mønsteret. De fleste av de infiserte cellene er plassert langs det sentrale området med høyere tetthet i graderingsmønsteret.RSV-variantene ligger nær periferien av de infiserte BEAS-2B-cellene som vokser på mikropatterned rutenett. Mange RSV strukturelle proteiner er identifisert i tomogrammer, inkludert nukleocapsid og viral fusjon protein. På mikropatterned grids kan Drosophila-nevroner med pan-neuronal GFP-uttrykk enkelt spores ved lysmikroskopi på grunn av fluorescerende merking og deres plassering er innenfor mikropatternene.Nevroner på uberørte gitter kan også spores gjennom GFP-signalering ved lysmikroskopi. Imidlertid blir det vanskelig å finne dem i kryo-elektronmikroskopi på grunn av cellulær rusk og forurensning fra media. På grunn av dimensjonene til nevroncellekroppen og utvidede nevritter samles kryo-elektrontomografi tilt-serien langs tynnere områder av cellene med høyere forstørrelse.Nevroncellemembranen, mitokondrier, mikrotubuler, aktinfilamenter, vesikulære strukturer og makromolekyler som ribosomer er godt løst i høyere forstørrelsesbildemontasjer og skiver gjennom 3D-tomogrammet. Lignende subcellulære egenskaper observeres fra 3D-tomogrammer av uberørte nevroner. Å bruke sjablongen på rutenettet og legge til PLPP-gelen er det mest følsomme trinnet som kan påvirke mønsterresultatene og bør gjøres med forsiktighet.Cryo-CLEM kan brukes til å lokalisere mål av interesse i celler for cryo-ET datainnsamling. Cryo-FIB-SEM kan brukes til å tynne celler på områder som ellers er for tykke for datainnsamling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Rask nettforberedelse for tidsavklart kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Fremstilling av nukleosomkjernepartikler kompleksert med DNA-reparasjonsfaktorer for kryo-elektronmikroskopi strukturell bestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstrahering av modifiserte mikrotubuli fra pattedyrceller for å studere mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anvendelse av monolags grafen til kryo-elektronmikroskopigitter for høyoppløselig strukturbestemmelse

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

Prøvepreparering for in situ kryotomografi av pattedyrceller

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...