Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Vi tackar Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang och Mrs. Josephine W. Mitchell vid institutionen för biokemi, University of Wisconsin, Madison för att generöst dela elav-Gal4, UAS-CD8::GFP flugstam (Bloomington stock center, #5146). Vi vill också tacka Dr. Aurélien Duboin, Laurent Siquier och Marie-Charlotte Manus från Alvéole och Serge Kaddoura från Nanoscale Labs för deras generösa stöd under detta projekt. Detta arbete stöddes delvis av University of Wisconsin, Madison, Institutionen för biokemi vid University of Wisconsin, Madison och folkhälsobidrag R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 och U24 GM139168 till E.R.W. och R01 AI150475 till P.W.S. En del av denna forskning stöddes av NIH-anslag U24 GM129547 och utfördes vid PNCC vid OHSU och nås via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsrad av Office of Biological and Environmental Research. Vi är också tacksamma för användningen av faciliteter och instrumentering vid Cryo-EM Research Center vid institutionen för biokemi vid University of Wisconsin, Madison.

<ol>
	<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM:+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity.">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+electron+crystallography+of+2D+crystals+to+MicroED+of+3D+crystals.">From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals.</a> Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-the+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>B&#228;uerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+native+Drosophila+tissues+vitrified+by+plunge+freezing.">Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing.</a> bioRxiv. , 437159 (2021).</li><li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells.">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).</li><li>Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+Electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).</li><li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> Elife. 8, 45919 (2019).</li><li>Wu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+neuronal+networks.">Micropatterning neuronal networks.</a> Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+micropatterning+technology+for+whole+cell+cryogenic+electron+microscopy+studies.">Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+micropatterning+for+cryo-electron+tomography+studies+of+cell-cell+contacts.">Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts.</a> bioRxiv. , 272237 (2021).</li><li>Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+cryo-electron+tomography+of+cultured+and+primary+eukaryotic+cells+on+micropatterned+TEM+grids.">Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids.</a> bioRxiv. , 447251 (2021).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons.">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+assembly+of+respiratory+syncytial+virus+revealed+by+cryo-electron+tomography.">The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography.</a> Viruses. 10 (8), (2018).</li><li>Stobart, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+RSV+vaccine+with+engineered+thermostability+is+immunogenic+in+cotton+rats+despite+high+attenuation.">A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation.</a> Nature Communications. 7, 13916 (2016).</li><li>Hotard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stabilized+respiratory+syncytial+virus+reverse+genetics+system+amenable+to+recombination-mediated+mutagenesis.">A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis.</a> Virology. 434 (1), 129-136 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+virus+assembly+and+organization+by+the+measles+virus+matrix+protein.">Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein.</a> Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).</li><li>Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+situ+neuronal+model+for+cryo-ET.">A new in situ neuronal model for cryo-ET.</a> Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition.">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+method+for+cryo-electron+tomography:+Characterizing+stage+behavior+during+FISE+acquisition.">Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).</li><li>Anderson, D. E., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+micropatterning:+methods,+effects,+and+applications.">Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications.</a> Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+components+for+cell+culture.">Use of extracellular matrix components for cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).</li><li>Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy.">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).</li><li>Schellenberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+correlative+fluorescence+and+electron+cryo+microscopy+using+two+independent+alignment+markers.">High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers.</a> Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Moderna, avancerade elektronmikroskop och programvarupaket stöder nu strömlinjeformad automatiserad kryo-EM och kryo-ET datainsamling där hundratals till tusentals positioner kan riktas och avbildas inom några dagar32,33,34,35. En viktig begränsande faktor för helcelliga kryo-ET-arbetsflöden har varit att få tillräckligt många insamlingsbara mål per rutnät. Nyligen har ett antal grupper utvecklat protokoll för mikropappersnät för cryo-EM, med en fördel som förbättrad datainsamlingseffektivitet16,17,18. Här presenteras ett protokoll för att använda ett kommersiellt tillgängligt mikropapperssystem till mikromönster TEM-rutnät för cryo-ET-studier av primära Drosophila-nervceller och odlade mänskliga cellinjer (oinfekterade eller RSV-infekterade). Detta mikropapperssystem är mångsidigt och många steg kan optimeras och skräddarsys för att passa specifika experimentella mål. En användare med TEM- och fluorescensmikroskopi erfarenhet kan snabbt bli skicklig på nätberedning och mikropatterning. Med noggrann praxis bör goda resultat uppnås efter några iterationer. Nedan diskuteras några av de tillgängliga alternativen, användaröverväganden, potentiella fördelar och framtida tillämpningar av mikropatterning för cryo-EM.
En av de viktiga övervägandena för hela cell cryo-ET är EM-rutnätsval. EM-galler består av två delar: en maskram (eller strukturellt stöd) och folien (eller filmen), som är den kontinuerliga eller håliga filmytan på vilken cellerna kommer att växa. Kopparnätnät används ofta för kryo-EM av proteiner och isolerade komplex. De är dock olämpliga för helcells cryo-ET på grund av kopparns cytotoxicitet. Istället används ett guldnät ofta för cellulär tomografi. Andra alternativ inkluderar nickel eller titan, vilket kan ge fördelar jämfört med guld som ökad styvhet16. EM-nät finns med olika nätdimensioner för att stödja en rad olika applikationer. Större maskstorlekar ger mer utrymme för celler att växa mellan gallerstänger och fler områden som är mottagliga för insamling av tiltserier, men på bekostnad av ökad övergripande provskörhet. Den vanligaste folien är perforerat eller håligt amorft kol, såsom Quantifoils eller C-platta galler. Biologiska mål kan avbildas antingen genom hålen i kolet eller genom det elektrontranslucenta kolet. Galler som R 2/1 eller R 2/2, där hålen är 2 μm breda och som är åtskilda 1 respektive 2 μm, ger ett stort antal hål och därmed ett stort antal potentiella områden för datainsamling. Vissa celler kan dock växa och expandera bättre på mer enhetliga ytor som R 1.2/20-nät eller kontinuerligt kol. För nedströms provbearbetning genom fräsning av fokuserad jonstråle (cryo-FIB) avlägsnas folien genom fräsning, vilket minskar oron för den underliggande filmens fortsatta förekomst. Precis som med nätet finns även folier från andra material, där mönseringsprotokollet som presenteras här är lika lämpligt för SiO2-galler . Vanliga rutnät inkluderar guld Quantifoil, kontinuerligt kol eller SiO2 film 200-mesh rutnät (~ 90 μm avstånd mellan galler barer) för helcell cryo-ET.
Det finns ett antal överväganden när du utformar ett mönster. En majoritet av dessa beslut styrs av experimentets celltyp och syfte. En bra utgångspunkt är att välja ett mönster som approximerar cellernas form och dimensioner i kulturen. Många studier har visat betydande effekter av mönsterform på celltillväxt och cytoskeletal arrangemang13,36,37. Särskild försiktighet bör iakttas under mönsterdesignen om detta kan ändra målet av intresse. Flera mönster för varje celltyp testades för att avgöra vilka mönster främjas cellulär vidhäftning och tillväxt. Flexibiliteten i mikropapperssystemet gör det möjligt att testa flera mönster i ett enda rutnät och ändra mönster för olika rutnät inom ett enda experiment. Större mönster (~ 50-90 μm), såsom de som används här, ökar sannolikheten för att flera celler håller sig till en enda region i mönstret och tillåter celler att expandera och förlänga efter vidhäftning. Mer begränsade mönster (20-30 μm) kan vara lämpliga i experiment där cellisolering är mer kritisk än cellexpansion, t.ex. för experiment med kryo-FIB(focused-jon beam milling). För tomografitillämpningar kan man behöva överväga lutningsaxelns inverkan. Om ett mönster är placerat så att alla celler växer parallellt med varandra i en enda riktning, är det möjligt att alla celler kommer att vara vinkelräta mot lutningsaxeln när de laddas på mikroskopstadiet, vilket resulterar i en lägre datakvalitet.
På icke-upprutade rutnät håller cellerna ofta företrädesvis vid rutnätsstaplarna, där de inte kan avbildas av TEM. Även på mönstrade galler observeras celler ofta placeras i hörnen av rutnätsrutor delvis på både den mönstrade kolfolien och gallerstången. Nyligen användes micropatterning för att avsiktligt placera en del av cellen över rutnätsfältet18. Detta kan övervägas för experiment där det inte är viktigt att ha hela cellens periferi på folien. Detta kan vara särskilt viktigt för celler som kan växa större än en enda rutnät kvadrat, såsom primära nervceller växer under flera dagar.
Det finns många verktyg som kan användas för att utforma ett mönster. Här var mönstret begränsat till mindre än 800 pixlar i en dimension så att mönstret kan roteras till vilken vinkel som helst och fortfarande passa inom det maximala området som kan mönstras i en enda projektion av detta mikropatterningssystem. Detta gör det möjligt för användaren att rotera mönstret för att vara korrekt orienterad med rutnätet oavsett orienteringen av rutnätet på mikroskopet. Här delades rutnätet in i sex mönstrar. I första hand möjliggör detta fokusjustering mellan olika regioner i rutnätet. Särskilt guldgaller är mycket formbara och får inte lägga sig helt platt på glaset. Rätt fokus är viktigt för rena, raffinerade mönstrar. Genom att använda segmenterade mönster behöver endast mindre justeringar av mönsterpositionen göras om rutnätet skiftar något under mönstningsprocessen, även om detta vanligtvis inte är ett problem när du använder PLPP-gelén med PDMS-stencilerna. Slutligen förblev de centrala fyra rutnätsrutorna i rutnätet oförändrade. Detta stöder en användare som tydligt kan identifiera mitten av rutnätet, vilket är mycket användbart för korrelativa avbildningsexperiment.
Mönskningsprogramvaran för detta mikropapperssystem, Leonardo, har också mer avancerade funktioner som sömnad och möjligheten att importera mönster som PDF-filer, som ligger utanför detta protokoll. Denna programvara innehåller också mikrostrukturdetektering och automatiserad mönsterpositionering som kan användas på TEM-nät. Den här funktionen är mest användbar när rutnätet är mycket platt och kan mönstras utan att behöva justera fokus mellan olika områden.
Val av ett ECM-protein kan ha en betydande inverkan på cell vidhäftning och expansion. Vissa celler är kända för att genomgå fysiologiska förändringar när de odlas på specifika substrat38. Flera ECM-proteiner och koncentrationer testades för någon ny celltyp baserat på tidigare arbete som rapporterats i litteraturen. Laminin, fibrinogen, fibronectin och kollagen används ofta för odlade celler och kan användas som utgångspunkt om andra data inte är tillgängliga. Andra ECM-proteiner måste dock också övervägas om de vanliga ECM-proteinerna inte ger cellerna korrekta vidhäftande egenskaper. Detta var särskilt sant för primära Drosophila nervceller, som en hög koncentration av växten lectin concanavalin A var nödvändigt för korrekt cellulära adherence. Kompatibiliteten hos cellulär vidhäftning och tillväxt med ECM kan testas genom mönstra på glasfat eller diabilder innan de övergår till TEM-galler. Denna förundersökningsmetod är tids- och kostnadseffektiv om ett stort antal kombinationer behöver undersökas. Införandet av ett fluorescerande konjugerat ECM-protein är värdefullt för att bedöma framgången och kvaliteten på mönstrar.
Cellsådd är ett av de viktigaste stegen för hela cell cryo-ET, antingen med eller utan mikropapper6,16,39. För primära Drosophila eller andra nervceller, som är bräckliga, instabila i suspension och kan begränsas i kvantitet, föredras enstaka såddmetoder framför övervakad, sekventiell cellsådd. Ett enda såddsteg vid en optimerad celldensitet, som beskrivs i protokollet för Drosophila-nervceller, är ett genomförbart alternativ för de flesta celltyper. Det är dock också möjligt att så celler på substratet vid en lägre initial koncentration och lägga till fler celler på ett övervakat sätt som beskrivs här och i annan litteratur18. Denna sekventiella sådd kan ge mer konsekventa resultat i vissa fall. I likhet med standardcellskultur bör man alltid vara noga med att upprätthålla cellens livskraft och minimera cellklumpning under isolering.
När du först börjar med mikropapperning finns det några potentiella fallgropar som är skadliga för slutresultatet. Noggrann näthantering och steril teknik, en enhetlig fördelning av PLPP-gelen, korrekt dos och fokus under mönstraring och underhåll av cellens livskraft före sådd är bland de viktigaste övervägandena för framgång. En förteckning över några av de potentiella problemen och lösningarna sammanställdes i tabell 1.
Mikromönster kan användas för att positionera celler för att upprätta en konsekvent celltäthet över rutnätet och för att placera områden av intresse i områden som är lämpliga för insamling av tiltserier16,18. Placering och placering av celler kan användas som fiducial markörer för korrelation i cryo-CLEM experiment, vilket minskar behovet av bräckliga finder-grids och fluorescerande fiducial markörer. Det bör dock noteras att sådana fiducial markörer fortfarande kan vara användbara för korrelationen med submikrometernoggrannhet29,40. Dessutom är en jämn fördelning av isolerade celler också mycket fördelaktig för experiment-jonstrålefräsning (cryo-FIB) experiment för att maximera antalet celler från vilka lameller kan skäras16.
Tillägget av mikropapper till kryo-EM-arbetsflöden kommer att resultera i mätbara förbättringar av datagenomströmningen och potentiellt möjliggöra nya experiment. När tekniken antas och utvecklas ytterligare kommer mer avancerade tillämpningar av mikropapper, inklusive ECM-gradienter, flera ECM-deponering och mikrostrukturmontering, att ytterligare utöka kryo-ET: s kapacitet att studera biologiska mål och processer i fullständigt cellulärt sammanhang.

Med utvecklingen, expansionen och mångsidigheten hos kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) har forskare undersökt ett brett spektrum av biologiska prover i ett nästan inhemskt tillstånd från makromolekylär (~ 1 nm) till hög (~ 2 Å) upplösning. Cryo-EM- och elektrondiffraktionstekniker med en partikel tillämpas bäst på renade makromolekyler i lösning eller kristallint tillstånd, respektive1,2. Medan kryoelektrontomografi (cryo-ET) är unikt lämpad för nästan inhemska strukturella och strukturella studier av stora, heterologa föremål som bakterier, pleomorfa virus och eukaryota celler3. I kryo-ET erhålls tredimensionell (3D) information genom att fysiskt luta provet på mikroskopstadiet och förvärva en serie bilder genom provet i olika vinklar. Dessa bilder, eller tilt-serien, täcker ofta ett intervall på +60/-60 grader i steg om en till tre grader. Tilt-serien kan sedan omvandlas beräkningsmässigt till en 3D-volym, även känd som ett tomogram4.
Alla kryo-EM-tekniker kräver att provet är inbäddat i ett tunt lager av amorf, icke-kristallin, glasaktig is. En av de vanligaste kryofixeringsteknikerna är dykfrysning, där provet appliceras på EM-nätet, blottas och snabbt kastas in i flytande etan eller en blandning av flytande etan och propan. Denna teknik är tillräcklig för vitrifikation av prover från <100 nm till ~ 10 μm i tjocklek, inklusive odlade mänskliga celler, såsom HeLa-celler5,6. Tjockare prover, såsom miniorganoider eller vävnadsbiopsier, upp till 200 μm i tjocklek, kan vitrifieras genom högtrycksfrysning7. Men på grund av ökad elektronspridning av tjockare prover är prov- och istjockleken för cryo-ET begränsad till ~ 0,5 - 1 μm i 300 kV transmissionselektronmikroskop. Därför är helcells cryo-ET av många eukaryota celler begränsad till cellens periferi eller förlängningar av celler om inte ytterligare provberedningssteg används, såsom kryosektion8 eller fokuserad jonstråle fräsning9,10,11.
En begränsning av många helcells cryo-ET-avbildnings experiment är datainsamling genom flöde12. Till skillnad från enpartikel cryo-EM, där tusentals isolerade partiklar ofta kan avbildas från en enda TEM-rutnät kvadrat, celler är stora, utspridda och måste odlas med tillräckligt låg densitet för att cellerna ska kunna bevaras i ett tunt lager av glasaktig is. Ofta är den intressanta regionen begränsad till en viss funktion eller underområde i cellen. Ytterligare begränsande dataflöde är cellernas benägenhet att växa på områden som inte är mottagliga för TEM-avbildning, till exempel på eller nära TEM-rutnätsstaplar. På grund av oförutsägbara faktorer i samband med cellkultur på TEM-nät behövs teknisk utveckling för att förbättra urvalets tillgänglighet och genomströmning för datainsamling.
Substratmikrutnätning med vidhäftande excellulära matrisproteiner (ECM) är en väletablerad teknik för levande cellljusmikroskopi för att styra tillväxten av celler på styva, hållbara och optiskt transparenta ytor som glas och andra vävnadsodlingssubstrat13,14. Micropatterning har också utförts på mjuka och/eller tredimensionella (3D) ytor. Sådana tekniker har inte bara gjort det möjligt att exakt placera celler. De har också stött skapandet av multicellulära nätverk, såsom mönstrade neurala cellkretsar15. Att föra mikropapper till cryo-ET kommer inte bara att öka genomströmningen, men det kan också öppna upp nya studier för att utforska komplexa och dynamiska cellulära mikromiljö.
Nyligen har flera grupper börjat använda mikropapperstekniker på TEM-rutnät genom flera tillvägagångssätt16,17. Här beskrivs användningen av en masklös fotopappersteknik för TEM-galler med hjälp av Alvéole PRIMO mikropapperssystem, som har högupplöst och kontaktlös mönstra. Med detta mikropapperssystem appliceras ett antifoulingskikt på toppen av substratet, följt av applicering av en fotokatalys och ablation av anti-fouling-skiktet i användardefinierade mönster med en UV-laser. ECM-proteiner kan sedan tillsättas till mönstren för lämplig cellkultur. Denna metod har använts av flera grupper för cryo-ET studier av retinal pigment epitelial-1 (RPE1), Madin-Darby hund njure-II (MDCKII), humant förhud fibroblast (HFF) och endotel cellinjer16,17,18. Detta mikropapperssystem är kompatibelt med flera antifoulingskiktssubstrat samt antingen en flytande eller gel photocatalyst reagens. En mängd olika ECM-proteiner kan väljas från och anpassas för cellinjens specificitet, vilket ger mångsidighet för användaren.
Micropatterning har framgångsrikt tillämpats på ett antal projekt inom laboratoriet19. Här presenteras ett mikropatterning protokoll, inklusive specifika anpassningar för att studera odlade HeLa celler, respiratory syncytial virus (RSV)-infekterade BEAS-2B celler och primära larval Drosophila melanogaster nervceller20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

Helcellig kryoelektrontomografi (cryo-ET) är en kraftfull teknik som används för att producera nanometernivåupplösningsstrukturer av makromolekyler som finns i cellulära sammanhang och bevaras i ett nästan inbyggt frusethydratiserat tillstånd. Det finns dock utmaningar förknippade med odling och/eller vidhäftning av celler på TEM-rutnät på ett sätt som är lämpligt för tomografi samtidigt som cellerna behålls i deras fysiologiska tillstånd. Här presenteras ett detaljerat steg-för-steg-protokoll om användningen av mikropapper för att styra och främja eukaryota celltillväxt på TEM-nät. Under mikropapper riktas celltillväxten genom att deponera excellulära matrisproteiner (ECM) inom angivna mönster och positioner på folien i TEM-rutnätet medan de andra områdena förblir belagda med ett antifoulingskikt. Flexibilitet i valet av ytbeläggning och mönsterdesign gör mikropapper i stort sett tillämpligt för ett brett spektrum av celltyper. Mikropapper är användbart för studier av strukturer inom enskilda celler samt mer komplexa experimentella system som värdpatogeninteraktioner eller differentierade multicellulära samhällen. Mikropapper kan också integreras i många nedströms helcells cryo-ET-arbetsflöden, inklusive korrelativt ljus och elektronmikroskopi (cryo-CLEM) och fräsning av fokuserad jonstråle (cryo-FIB).

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Målet med detta protokoll är att rikta cell vidhäftning och tillväxt till riktade områden av rutnät för kryoelektronmikroskopi. Detta uppnås genom att applicera ett antifoulingskikt som ableras i användarspecificerade mönster följt av deponering av extracellulära matrisproteiner i de mönstrade områdena före cellsådd.

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Vårt forskargrupp utvecklar teknik och protokoll för kryoelektronmikroskopi och kryoelektrontomografi. Vi har utvecklat protokoll för mikropapper TEM-nät för att styra celltillväxt och positionering för cryo-ET-experiment. Helcells kryoelektrontomografi används för att producera nanometernivåupplösningsstrukturer av makromolekylära komplex i celler bevarade i ett inbyggt fruset hydratiserat tillstånd.Micropatterning kan öka genomströmningen av helcells cryo-ET, cryo-correlative ljus elektronmikroskopi och cryo-fokuserad jonstråle fräsning experiment. Antalet och fördelningen av celler på EM-rutnät är avgörande för helcells cryo-ET-studier. Detta protokoll ger en snabb, reproducerbar och i stort sett anpassningsbar metod för att styra celltillväxt på EM-rutnät genom mikropatterning.Prövaren bör vara bekväm med pipetter, pincett, grundläggande cellkulturtekniker och fluorescens- och transmissionselektronmikroskop. Vid mönstra för första gången, använd en välkänd celltyp och ECM-kombination och testa dem på täckslips eller MatTek-rätter. Forskargruppsmedlemmar som är involverade i denna protokollutveckling är:Dr.Brian Sibert, Mr Joseph Kim och Dr.Jae Yang. Till att börja med överför du gallren till en nätförberedande hållare och glöd ur gallrets kolsida uppåt. Överför sedan gallren med kolsidan upp till en ren glasrutschbana eller täckslip med minst en centimeters separation mellan gallren.Pipettera 10 mikroliter med 0,05 poly-L-lysin på varje galler och inkubera gallret i en fuktig kammare i minst 30 minuter. Efter inkubation, tvätta varje galler tre gånger med 15 mikroliter på 0,1 molar HEPES vid pH 8,5. Inkubera gallret i varje tvätt i 30 sekunder och ta sedan bort det mesta av vätskan från gallret med en pipett utan att låta gallret torka.Efter den slutliga tvätten, lämna varje galler i 15 mikroliter av 0,1 molar HEPES. Förbered sedan PEG-SVA-lösningen och byt omedelbart ut HEPES-lösningen på gallret med 10 mikroliter peg-SVA-lösningen och inkubera sedan gallret i en fuktig kammare i minst en timme. Efter inkubation, tvätta varje galler tre gånger med 15 mikroliter sterilt vatten och inkubera gallret i varje tvätt i 30 sekunder.Efter den slutliga tvätten, lämna varje galler i 15 mikroliter vatten. Placera en en mikroliter droppe vatten på mitten av ett nytt rent täckslip och överför sedan försiktigt gallret från 15 mikrolitervattendroppe till droppen på det nya täckslipet med kolsidan uppåt. Placera sedan försiktigt vid PDMS-stencilen över gallret och hålla gallret centrerat och minimera stencilkontakten med kolfolien i gallret.Tillsätt sedan en mikroliter PLPP-gel på gallret och pipetten försiktigt för att blanda. Flytta täcket med gallret till en mörk plats för att torka. Gelén torkar om 15 till 30 minuter.För mikropatterning öppnar du programvaran med en levande Brightfield-vy från mikroskopet. Om du vill utforma en ny mall för en första körning väljer du Lägg till ROI och väljer en cirkel på 3 000 mikrometer. Placera cirkeln ROI över rutnätet med Brightfield-bilden på skärmen som en guide och tryck sedan på Lås för att säkra AVKASTNINGEN.När du har låst ROI på plats väljer du Lägg till mönster och väljer lämpligt mönster. Med hjälp av replikeringsalternativen genererar du kopior av det ursprungliga mönstret för att skapa en kvadratisk region med åtta gånger åtta rutnät. Justera avståndet och vinkeln efter behov för att justera mönstren med rutnätsrutorna.Placera mönstret i ett hörn av rutnätet. Duplicera sedan mönstret och placera en kopia i vart och ett av de fyra hörnen av rutnätet som flyttar mikroskopstadiet efter behov för varje region. Använd replikeringsalternativen för att ändra en kvadratisk region med åtta gånger åtta rutnät till en kvadratisk region med två gånger åtta rutnät som ska placeras på båda sidor av mitten.Lämna mitten fyra rutnätsrutor oavskapade. För varje mönster, justera den totala dosen om det behövs. 30 millijoule per kvadratmillimeter är en bra utgångspunkt.Under Expertalternativ justerar du vinkeln, positionen, mellanrummet mellan och förhållandet mellan mönstret för att förfina mönstrets inriktning med rutnätsrutorna. Flytta mikroskopstadiet för att ändra rutnätsområdet i Brightfield-skärmen. När mallen och mönstren är placerade avmarkerar du alla regioner utom en av regionerna på programmets åtgärdspanel.Använd mikroskopstadiet för att navigera till den regionen och fokusera på kolfolien. Klicka på ögongloben i åtgärdspanelen för att växla bort mönsteröverläggsdisplayen. När rutnätet är i fokus stänger du Brightfield-slutaren och trycker på Play-ikonen längst ner till höger i programvaran för att påbörja mönstraringsprocessen, som kan övervakas live.Upprepa det här steget tills alla regioner är mönstrade. Ta slutligen bort täcket med gallret från mikroskopet och tillsätt omedelbart 10 mikroliter steril PBS på gallret. Efter 10 minuter, ta bort stencilen med pincett, tvätta sedan gallret tre gånger med 15 mikroliter PBS och lämna varje galler i PBS på en mörk plats.Förbered 15 mikroliter av den extracellulära matrisen för varje galler, byt sedan ut PBS från varje galler med 15 mikroliter av den extracellulära matrisen och inkubera gallret i en fuktig kammare i minst en timme. Efter inkubation, tvätta varje galler fem gånger med 15 mikroliter steril PBS som visats tidigare. Efter den slutliga tvätten lämnar du varje galler i PBS.Använd ett fluorescensmikroskop och detektera fluoroforen i den extracellulära matrisen för att bekräfta mönstrar och att kolfolien förblir intakt. HeLa-celler sådda på mikromönster och unpatterned TEM-galler är synliga genom fluorescerande färgning med hjälp av en calcein AM och ethidium homodimer-1 baserad cell livskraft analys. Med hjälp av en blandad kollagen- och fibrinogen extracellulär matris håller HeLa-celler lätt fast vid mönster över gallret.Den övergripande morfologin för celler som expanderade längs mönstret liknar den för celler som odlas på icke-sända rutnät. En Brightfield bild av RSV infekterade BEAS-2B celler 18 timmar post seedning visar cell vidhäftning och tillväxt längs den centrala regionen av mönstret. De flesta infekterade celler är placerade längs den centrala regionen högre densitet i gradientmönstret.RSV-varianterna ligger nära periferin av de infekterade BEAS-2B-cellerna som odlas på mikromönster. Många RSV strukturella proteiner identifieras inom tomogrammen, inklusive nukleokapslar och viral fusion protein. På mikromönster galler, Drosophila nervceller med pan-neuronal GFP uttryck kan lätt spåras av ljus mikroskopi på grund av fluorescerande märkning och deras plats är inom micropatterns.Nervceller på icke-sända rutnät kan också spåras genom GFP-signalering genom ljusmikroskopi. Det blir dock svårt att hitta dem i kryoelektronmikroskopi på grund av cellulärt skräp och förorening från media. På grund av dimensionerna av neuroncellkroppen och förlängda neuriter samlas kryoelektrontomografi tilt-serien längs tunnare regioner i cellerna med högre förstoring.Neuronal cellmembran, mitokondrier, mikrotubuler, aktinfilament, vesikulära strukturer och makromolekyler som ribosomer är väl lösta i högre förstoring bildmontage och skivor genom 3D-tomogrammet. Liknande subcellulära funktioner observeras från 3D tomogram av unpatterned nervceller. Att applicera stencilen på gallret och lägga till PLPP-gelen är det känsligaste steget som kan påverka mönstraringsresultaten och bör göras med försiktighet.Cryo-CLEM kan användas för att lokalisera mål av intresse inom celler för insamling av cryo-ET-data. Cryo-FIB-SEM kan användas för att tunna celler på områden som annars är för tjocka för datainsamling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snabb gallerförberedelse för tidsupp lös Cryo-Electron mikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Förberedelse och Kryo-FIB mikromachining av Saccharomyces cerevisiae för Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Beredning av nukleosomkärnpartiklar komplexerade med DNA-reparationsfaktorer för kryoelektronmikroskopi Strukturell bestämning

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extrahera modifierade mikrotubuli från däggdjursceller för att studera mikrotubuli-proteinkomplex med kryoelektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Tillämpning av monolagergrafen på kryoelektronmikroskopinät för högupplöst strukturbestämning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

Provberedning för in situ kryotomografi av däggdjursceller

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...