Name: micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Wisconsin Üniversitesi, Madison Biyokimya Bölümü'nden Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang ve Bayan Josephine W. Mitchell'a elav-Gal4, UAS-CD8::GFP sinek türünü cömertçe paylaştıkları için teşekkür ederiz (Bloomington stok merkezi, #5146). Ayrıca Alvéole'den Dr. Aurélien Duboin, Bay Laurent Siquier ve Bayan Marie-Charlotte Manus'a ve Nanoscale Labs'den Bay Serge Kaddoura'ya bu projedeki cömert destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Wisconsin Üniversitesi tarafından desteklendi. Madison, Wisconsin Üniversitesi Biyokimya Bölümü, Madison ve halk sağlığı servisi R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 ve U24 GM139168'i E.R.W. ve R01 AI150475'i NIH'den P.W.S.'ye verir. Bu araştırmanın bir kısmı NIH hibe U24 GM129547 tarafından desteklendi ve OHSU'daki PNCC'de gerçekleştirildi ve Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi tarafından desteklenen bir DOE Bilim Kullanıcı Tesisi Ofisi olan EMSL (grid.436923.9) aracılığıyla erişildi. Ayrıca Madison Wisconsin Üniversitesi Biyokimya Bölümü'ndeki Cryo-EM Araştırma Merkezi'ndeki tesislerin ve enstrümantasyonun kullanımı için minnettarız.

<ol>
	<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM:+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity.">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+electron+crystallography+of+2D+crystals+to+MicroED+of+3D+crystals.">From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals.</a> Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-the+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>B&#228;uerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+native+Drosophila+tissues+vitrified+by+plunge+freezing.">Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing.</a> bioRxiv. , 437159 (2021).</li><li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells.">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).</li><li>Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+Electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).</li><li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> Elife. 8, 45919 (2019).</li><li>Wu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+neuronal+networks.">Micropatterning neuronal networks.</a> Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+micropatterning+technology+for+whole+cell+cryogenic+electron+microscopy+studies.">Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).</li><li>Engel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+micropatterning+for+cryo-electron+tomography+studies+of+cell-cell+contacts.">Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts.</a> bioRxiv. , 272237 (2021).</li><li>Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+cryo-electron+tomography+of+cultured+and+primary+eukaryotic+cells+on+micropatterned+TEM+grids.">Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids.</a> bioRxiv. , 447251 (2021).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons.">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+assembly+of+respiratory+syncytial+virus+revealed+by+cryo-electron+tomography.">The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography.</a> Viruses. 10 (8), (2018).</li><li>Stobart, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+RSV+vaccine+with+engineered+thermostability+is+immunogenic+in+cotton+rats+despite+high+attenuation.">A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation.</a> Nature Communications. 7, 13916 (2016).</li><li>Hotard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stabilized+respiratory+syncytial+virus+reverse+genetics+system+amenable+to+recombination-mediated+mutagenesis.">A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis.</a> Virology. 434 (1), 129-136 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).</li><li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+virus+assembly+and+organization+by+the+measles+virus+matrix+protein.">Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein.</a> Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).</li><li>Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+situ+neuronal+model+for+cryo-ET.">A new in situ neuronal model for cryo-ET.</a> Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition.">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+method+for+cryo-electron+tomography:+Characterizing+stage+behavior+during+FISE+acquisition.">Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).</li><li>Anderson, D. E., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+micropatterning:+methods,+effects,+and+applications.">Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications.</a> Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+components+for+cell+culture.">Use of extracellular matrix components for cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).</li><li>Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy.">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).</li><li>Schellenberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+correlative+fluorescence+and+electron+cryo+microscopy+using+two+independent+alignment+markers.">High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers.</a> Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Modern, gelişmiş elektron mikroskopları ve yazılım paketleri artık yüzlerce ila binlerce pozisyonun birkaç gün içinde hedeflenebildiği ve görüntülenebildiği kolaylaştırılmış otomatik kriyo-EM ve kriyo-ET veri toplamayı destekliyor32,33,34,35. Tüm hücreli kriyo-ET iş akışları için önemli bir sınırlayıcı faktör, ızgara başına yeterli sayıda toplanabilir hedef elde etmektir. Son zamanlarda, bir dizi grup kriyo-EM için mikropatterning ızgaraları için protokoller geliştirdi ve bir avantajı gelişmiş veri toplama verimliliği16,17,18 oldu. Burada, birincil Drosophila nöronlarının ve kültürlü insan hücre hatlarının (enfekte olmayan veya RSV enfekte) kriyo-ET çalışmaları için TEM ızgaralarını mikropattern etmek için piyasada bulunan bir mikropatterning sistemi kullanmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu mikropatterning sistemi çok yönlüdür ve birçok adım belirli deneysel hedeflere uyacak şekilde optimize edilebilir ve uyarlanabilir. TEM ve floresan mikroskopi deneyimine sahip bir kullanıcı, şebeke hazırlama ve mikropatterning konusunda hızla yetenekli hale gelebilir. Dikkatli bir uygulama ile, birkaç yinelemeden sonra iyi sonuçlar elde edilmelidir. Aşağıda, mevcut seçeneklerden bazıları, kullanıcı konuları, potansiyel faydalar ve kriyo-EM için mikropatterning'in gelecekteki uygulamaları tartışılmıştır.
Tüm hücre kriyo-ET için önemli hususlardan biri EM ızgara seçimidir. EM ızgaraları iki bölümden oluşur: bir örgü çerçeve (veya yapısal destek) ve hücrelerin büyüyeceği sürekli veya delikli film yüzeyi olan folyo (veya film). Bakır örgü ızgaraları genellikle proteinlerin ve izole komplekslerin kriyo-EM'si için kullanılır. Bununla birlikte, bakırın sitotoksisitesi nedeniyle tüm hücreli kriyo-ET için uygun değildirler. Bunun yerine, hücresel tomografi için genellikle altın bir ağ kullanılır. Diğer seçenekler arasında nikel veya titanyum bulunur, bu da artan sertlik gibi altına göre fayda sağlayabilir16. EM ızgaraları, çeşitli uygulamaları desteklemek için farklı ağ boyutlarıyla mevcuttur. Daha büyük ağ boyutları, hücrelerin ızgara çubukları ve eğim serisi toplanmasına uygun daha fazla alan arasında büyümesi için daha fazla alan sağlar, ancak genel numune kırılganlığının artması pahasına. En sık kullanılan folyo, Quantifoils veya C-flat ızgaralar gibi delikli veya delikli amorf karbondur. Biyolojik hedefler karbondaki deliklerden veya elektron yarı saydam karbondan görüntülenebilir. Deliklerin sırasıyla 1 ve 2 μm aralıklı 2 μm genişliğinde olduğu R 2/1 veya R 2/2 gibi ızgaralar, çok sayıda delik ve dolayısıyla veri toplama için çok sayıda potansiyel alan sağlar. Bununla birlikte, bazı hücreler R 1.2/20 ızgaraları veya sürekli karbon gibi daha düzgün yüzeylerde daha iyi büyüyebilir ve genişleyebilir. Odaklanmış iyon ışın frezeleme (kriyo-FIB) ile aşağı akış numune işleme için folyo frezeleme yoluyla çıkarılır ve alttaki filmin sürekli varlığına ilişkin endişeleri azaltır. Örgüde olduğu gibi, burada sunulan desenleme protokolü SiO2 ızgaraları için eşit derecede uygun olan diğer malzemelerden folyolar da mevcuttur. Yaygın olarak kullanılan ızgaralar arasında altın Quantifoil, sürekli karbon veya sio2 filmi 200 ağ ızgaraları (ızgara çubukları arasında ~90 μm aralık) bulunur.
Bir desen tasarlarken dikkat edilmesi gereken birkaç husus vardır. Bu kararların çoğu, deneyin hücre türüne ve amacına göre yönlendirilir. İyi bir başlangıç noktası, kültürdeki hücrelerin şeklini ve boyutlarını yaklaşık olarak gösteren bir desen seçmektir. Birçok çalışma, desen şeklinin hücre büyümesi ve sitoskeletal düzenleme üzerinde önemli etkileri olduğunu göstermiştir13,36,37. Bu ilgi hedefini değiştirebilecekse, desen tasarımı sırasında özel dikkat gösterilmelidir. Hangi desenlerin hücresel yapıştırma ve büyümeyi teşvik ettiğini belirlemek için her hücre tipi için çeşitli desenler test edilmiştir. Mikropatterning sisteminin esnekliği, tek bir ızgarada birden fazla desenin testine ve tek bir deneyde farklı ızgaralar için kalıpların değiştirilmesine izin sağlar. Burada kullanılanlar gibi daha büyük desenler (~50-90 μm), birden fazla hücrenin desenin tek bir bölgesine yapışma olasılığını arttırır ve hücrelerin yapışma sonrasında genişlemesine ve genişlemesine izin verir. Hücre yalıtımı, odaklanmış iyon ışın frezeleme (kriyo-FIB) deneyleri gibi hücre genişlemesinden daha kritik olduğu deneylerde daha kısıtlı desenler (20-30 μm) uygun olabilir. Tomografi uygulamaları için eğim ekseninin etkisini göz önünde bulundurmanız gerekebilir. Bir desen, tüm hücrelerin birbirine paralel olarak tek bir yönde büyüyecek şekilde konumlandırılırsa, mikroskop aşamasına yüklendiğinde tüm hücrelerin eğim eksenine dik olması mümkündür, bu da daha düşük bir veri kalitesine neden olur.
Bölünmemiş ızgaralarda, hücreler genellikle TERCIHEN TEM tarafından görüntülenemeyecekleri ızgara çubuklarına yapışırlar. Desenli ızgaralarda bile, hücrelerin genellikle ızgara karelerinin köşelerine kısmen hem desenli karbon folyo hem de ızgara çubuğuna yerlendiği gözlenir. Son zamanlarda, hücrenin bir kısmını kasıtlı olarak ızgara çubuğu üzerinde konumlandırmak için mikropatterning kullanıldı18. Bu, tüm hücre çevresinin folyo üzerinde olmasının kritik olmadığı deneyler için düşünülebilir. Bu, özellikle birden fazla gün içinde büyüyen birincil nöronlar gibi tek bir ızgara karesinden daha büyük büyüyebilen hücreler için önemli olabilir.
Bir desen tasarlamak için kullanılabilecek birçok araç vardır. Burada, desen herhangi bir boyutta 800 pikselden daha az bir pikselle sınırlıydı, böylece desen herhangi bir açıya döndürülebilir ve yine de bu mikropatterning sistemi tarafından tek bir projeksiyonda desenlenebilen maksimum alana sığabilir. Bu, kullanıcının mikroskop üzerindeki ızgaranın yönüne bakılmaksızın deseni kılavuzla düzgün bir şekilde yönlendirilecek şekilde döndürmesini sağlar. Burada ızgara altı desen alanına ayrılmıştır. Öncelikle, bu, ızgaranın farklı bölgeleri arasında odak ayarlamasına izin verir. Özellikle altın ızgaraları çok dövülebilir ve camın üzerine tamamen düz uzanmayabilir. Temiz, rafine desenleme sonuçları için uygun odaklama gereklidir. Parçalı desenler kullanılarak, ızgara desenleme işlemi sırasında hafifçe kayarsa, desen konumunda yalnızca küçük ayarlamalar yapılması gerekir, ancak PLPP jelini PDMS kalıplarıyla kullanırken bu genellikle bir sorun değildir. Son olarak, ızgaranın merkezi dört ızgara karesi kayıtsız kaldı. Bu, bir kullanıcının korelatif görüntüleme deneyleri için çok yararlı olan ızgaranın merkezini net bir şekilde tanımlayabilmesini destekler.
Bu mikropatterning sistemi için desenleme yazılımı Leonardo, aynı zamanda dikiş ve bu protokolün kapsamı dışında olan PDF olarak desenleri içe aktarma yeteneği gibi daha gelişmiş özelliklere sahiptir. Bu yazılım ayrıca TEM ızgaralarında kullanılabilecek mikroyapı algılama ve otomatik desen konumlandırma içerir. Bu özellik en çok ızgara çok düz olduğunda kullanışlıdır ve farklı alanlar arasında odağı ayarlamaya gerek kalmadan desenlenebilir.
Bir ECM proteininin seçimi hücre yapıştırma ve genişleme üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bazı hücrelerin belirli substratlarda yetiştirildiğinde fizyolojik değişikliklere uğradığı bilinmektedir38. Literatürde bildirilen önceki çalışmalara dayanarak herhangi bir yeni hücre tipi için birden fazla ECM proteini ve konsantrasyonu test edildi. Laminin, fibrinojen, fibronektin ve kollajen kültürlü hücreler için yaygın olarak kullanılır ve diğer veriler mevcut değilse başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan ECM proteinleri hücreler için uygun yapışma özelliklerini sağlayamazsa, diğer ECM proteinleri de göz önünde bulundurulmalıdır. Bu özellikle primer Drosophila nöronları için geçerliydi, çünkü uygun hücresel yapışma için A bitki lektin konanavalininin yüksek konsantrasyonu gerekliydi. Hücresel yapışıklık ve büyümenin ECM ile uyumluluğu, TEM ızgaralarına geçmeden önce cam tabaklarda veya kaydıraklarda desenlenerek test edilebilir. Bu ön eleme yaklaşımı, çok sayıda kombinasyonun incelenmesi gerekiyorsa zaman ve uygun maliyetlidir. Floresan konjuge ecm proteininin dahil edilmesi, desenlemenin başarısını ve kalitesini değerlendirmek için değerlidir.
Hücre tohumlama, mikropatterning olsun veya olmasın tüm hücre kriyo-ET için en önemli adımlardan biridir6,16,39. Kırılgan, süspansiyonda kararsız ve miktarı sınırlı olabilen primer Drosophila veya diğer nöronlar için, izlenen, sıralı hücre tohumlama yerine tek tohumlama yaklaşımları tercih edilir. Drosophila nöronları için protokolde açıklandığı gibi, optimize edilmiş bir hücre yoğunluğunda tek bir tohumlama adımı, çoğu hücre tipi için uygun bir seçenektir. Bununla birlikte, hücreleri daha düşük bir başlangıç konsantrasyonunda alt tabakaya tohumlamak ve burada ve diğer literatürde açıklandığı gibi izlenen bir şekilde daha fazla hücre eklemek de mümkündür18. Bu sıralı tohumlama, bazı durumlarda daha tutarlı sonuçlar sağlayabilir. Standart hücre kültürüne benzer şekilde, izolasyon sırasında hücre canlılığını korumaya ve hücre topaklanmasını en aza indirmeye her zaman özen verilmelidir.
Mikropatterning ile ilk başladığımızda, nihai sonuca zararlı olan birkaç potansiyel tuzak vardır. Dikkatli ızgara kullanımı ve steril teknik, PLPP jelinin düzgün dağılımı, desenleme sırasında uygun doz ve odaklama ve tohumlamadan önce hücre canlılığının korunması başarı için en önemli hususlar arasındadır. Olası sorunların ve çözümlerin bir listesi Tablo 1'de toplanmıştır.
Mikropatterned ızgaralar, hücrelerin ızgara boyunca tutarlı bir hücre yoğunluğu oluşturmasına ve eğim serisi toplama için uygun alanlarda ilgi alanlarını konumlandırmasına yardımcı olmak için kullanılabilir16,18. Hücrelerin yerleştirilmesi ve konumlandırılması, kriyo-CLEM deneylerinde korelasyon için fidüsiyal belirteçler olarak kullanılabilir ve kırılgan bulucu ızgaralara ve floresan fidüsiyal belirteçlere olan ihtiyacı azaltır. Bununla birlikte, bu tür fidüsiyal belirteçlerin mikrometre altı doğruluk korelasyonu için hala yararlı olabileceği belirtilmelidir29,40. Ayrıca, izole edilmiş hücrelerin eşit bir dağılımı, lamellerin kesilebileceği hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için odaklanmış iyon ışın frezeleme (kriyo-FIB) deneyleri için de son derece faydalıdır16.
Cryo-EM iş akışlarına mikropatterning eklenmesi, veri veriminde ölçülebilir iyileştirmelere neden olacak ve potansiyel olarak yeni denemelere olanak sağlayacaktır. Teknik daha da benimsendikçe ve geliştirildikçe, ECM gradyanları, çoklu ECM çökeltileri ve mikroyapı montajı dahil olmak üzere daha gelişmiş mikropatterning uygulamaları, kriyo-ET'nin biyolojik hedefleri ve süreçleri tam hücresel bağlamda inceleme yeteneklerini daha da genişletecektir.

Kriyo-elektron mikroskopisinin (kriyo-EM) geliştirilmesi, genişlemesi ve çok yönlülüğü ile araştırmacılar, makromoleküler (~1 nm) ila yüksek (~2 Å) çözünürlüğe kadar neredeyse yerli bir durumda çok çeşitli biyolojik örnekleri incelediler. Tek parçacıklı kriyo-EM ve elektron kırınım teknikleri en iyi çözeltideki veya kristal durumdaki saflaştırılmış makromoleküllere uygulanır, sırasıyla1,2. Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), bakteriler, pleomorfik virüsler ve ökaryotik hücreler gibi büyük, heterolog nesnelerin neredeyse yerli yapısal ve ultrayapısal çalışmaları için benzersizdir3. Cryo-ET'de, numunenin mikroskop aşamasında fiziksel olarak eğilmesi ve farklı açılarda numune üzerinden bir dizi görüntü elde ederek üç boyutlu (3D) bilgiler elde edilir. Bu görüntüler veya eğim serileri genellikle bir ila üç derecelik artışlarla +60/-60 derecelik bir aralığı kapsar. Eğim serisi daha sonra hesaplamalı olarak tomogram4 olarak da bilinen bir 3D birime yeniden yapılandırılabilir.
Tüm kriyo-EM teknikleri, numunenin ince bir amorf, kristal olmayan, vitreus buz tabakasına gömülmesini gerektirir. En sık kullanılan kriyo fiksasyon tekniklerinden biri, numunenin EM ızgarasına uygulandığı, şiştiği ve sıvı etan veya sıvı etan ve propan karışımına hızla daldırıldığı dalma dondurmadır. Bu teknik, HeLa hücreleri5,6 gibi kültürlü insan hücreleri de dahil olmak üzere kalınlıkta 100 nm ila ~10 μm < örneklerin vitrifikasyonu için yeterlidir. Kalınlığı 200 μm'ye kadar olan mini organoidler veya doku biyopsileri gibi daha kalın örnekler, yüksek basınçlı dondurma ile vitrifiye edilebilir7. Bununla birlikte, daha kalın numunelerin artan elektron saçılımı nedeniyle, kriyo-ET için numune ve buz kalınlığı 300 kV iletim elektron mikroskoplarında ~ 0.5 - 1 μm ile sınırlıdır. Bu nedenle, kriyo-kesit8 veya odaklanmış iyon ışın frezeleme9,10,11 gibi ek numune hazırlama adımları kullanılmadığı sürece, birçok ökaryotik hücrenin tüm hücre kriyo-ET'si hücre çevresi veya hücrelerin uzantıları ile sınırlıdır.
Birçok tüm hücreli kriyo-ET görüntüleme deneyinin bir sınırlaması veri toplama aktarım hızıdır12. Binlerce izole parçacığın genellikle tek bir TEM ızgara karesinden görüntülenebildiği tek parçacıklı kriyo-EM'nin aksine, hücreler büyüktür, yayılmıştır ve hücrelerin ince bir vitreus buz tabakasında korunmasına izin vermek için yeterince düşük yoğunlukta yetiştirilmelidir. Genellikle ilgi alanı hücrenin belirli bir özelliği veya alt alanı ile sınırlıdır. Verimi daha da sınırlayan, hücrelerin TEM ızgara çubukları üzerinde veya yakınında olduğu gibi TEM görüntülemeye uygun olmayan alanlarda büyüme eğilimidir. TEM şebekelerindeki hücre kültürüyle ilişkili öngörülemeyen faktörler nedeniyle, veri toplama için örnek erişilebilirliği ve veri verimini iyileştirmek için teknolojik gelişmelere ihtiyaç vardır.
Yapışan ekstra hücresel matris (ECM) proteinleri ile substrat mikropatterning, cam ve diğer doku kültürü substratları gibi sert, dayanıklı ve optik olarak şeffaf yüzeylerde hücrelerin büyümesini yönlendirmek için canlı hücreli ışık mikroskopisi için iyi kurulmuş bir tekniktir13,14. Mikropatterning yumuşak ve/veya üç boyutlu (3D) yüzeylerde de gerçekleştirilmiştir. Bu tür teknikler sadece hücrelerin hassas bir şekilde konumlandırılmasına izin vermedi; ayrıca desenli sinir hücresi devreleri15 gibi çok hücreli ağların oluşturulmasını da desteklemişlerdir. Mikropatterning'i kriyo-ET'ye getirmek sadece verimi artırmakla kalmayacak, aynı zamanda karmaşık ve dinamik hücresel mikroçevranlıkları keşfetmek için yeni çalışmalar da açabilir.
Son zamanlarda, çeşitli gruplar birden fazla yaklaşımla TEM şebekelerinde mikropatterning tekniklerini kullanmaya başladı16,17. Burada, TEM ızgaraları için maskesiz bir fotopatterning tekniğinin kullanımı, yüksek çözünürlüklü ve temassız desenleme özelliğine sahip Alvéole PRIMO mikropatterning sistemi kullanılarak açıklanmaktadır. Bu mikropatterning sistemi ile, alt tabakanın üstüne bir kirlenme önleyici tabaka uygulanır, ardından bir fotokatalistin uygulanması ve UV lazer ile kullanıcı tanımlı desenlerde kirlenme önleyici tabakanın ablasyonu. ECM proteinleri daha sonra uygun hücre kültürü için desenlere eklenebilir. Bu yöntem retina pigment epitel-1 (RPE1), Madin-Darby köpek böbrek-II (MDCKII), insan foreskin fibroblast (HFF) ve endotel hücre hatları kriyo-ET çalışmaları için çeşitli gruplar tarafından kullanılmıştır16,17,18. Bu mikropatterning sistemi, birden fazla kirlenme önleyici tabaka substratın yanı sıra bir sıvı veya jel fotokatalist reaktif ile uyumludur. Çeşitli ECM proteinleri hücre hattının özgüllüğünden seçilebilir ve uyarlanabilir ve kullanıcı için çok yönlülük sağlar.
Mikropatterning laboratuvar içerisinde bir dizi projeye başarıyla uygulanmıştır19. Burada, kültürlü HeLa hücrelerini, solunum sinsitial virüsünü (RSV) enfekte BEAS-2B hücrelerini ve birincil larva Drosophila melanogaster nöronlarını incelemek için spesifik adaptasyonlar dahil olmak üzere bir mikropatterning protokolü sunulmaktadır20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% (w/v) Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters PVDF membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x60-1 Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/15 Tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>0203-5/15-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, bovine</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>C11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher (Decon Labs)</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>F35200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid prep holder</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher (SKC, Inc.)</td>
			<td>22600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC172572500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher (Sigma Aldrich)</td>
			<td>NC0520015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC212595000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica-DMi8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Can be customized with camera, stage, and objective attachments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Fisher (Supply Solutions)</td>
			<td>50-100-3280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>ThermoFisher (Invitrogen)</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td>00-24-599-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher (ACROS Organics)</td>
			<td>AC207802500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher (Alfa Aesar)</td>
			<td>AAA1603736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stencils</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PDMS_STENCILS_EM</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PEG-SVA-1GR</td>
			<td>mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Fisher (Research Products International Corp)</td>
			<td>50-213-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips</td>
			<td>Fisher (Millipore Sigma)</td>
			<td>M1095350001</td>
			<td>pH probe can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>nanoscaleLABS</td>
			<td>PLPP-GEL-300UL</td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td></td>
			<td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA )</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-36460</td>
			<td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids</td>
			<td>EMS (Quantifoil)</td>
			<td>Q2100AR1</td>
			<td>2 &#181;m holes spaced 1 &#181;m apart, other dimensions are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher (Lonza)</td>
			<td>BW12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2-mK+</td>
			<td>see entry for pSynkRSV-19F</td>
			<td>-</td>
			<td>Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Media</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td>
			<td></td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tweezers</td>
			<td>EMS (Dumont)</td>
			<td>72812-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher (Fisher BioReagents)</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>4097-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8032-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios electron microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>300kV, with direct electron detector camera and energy filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver/Rotator</td>
			<td>Fisher (Thermo Scientific)</td>
			<td>11676341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5146</td>
			<td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropatterning transmission electron microscopy grids to direct cell positioning within whole-cell cryo-electron tomography workflows

Tüm hücreli kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücresel bağlamda bulunan makromoleküllerin nanometre düzeyinde çözünürlük yapılarını üretmek için kullanılan ve neredeyse yerli donmuş-hidratlı bir durumda korunan güçlü bir teknolojidir. Bununla birlikte, hücreleri fizyolojik durumlarında tutarken tomografiye uygun bir şekilde TEM ızgaralarına hücrelerin kültleme ve/veya yapışması ile ilgili zorluklar vardır. Burada, TEM şebekelerinde ökaryotik hücre büyümesini yönlendirmek ve teşvik etmek için mikropatterning kullanımı hakkında ayrıntılı bir adım adım protokol sunulmaktadır. Mikropatterning sırasında hücre büyümesi, ekstra hücresel matris (ECM) proteinlerinin TEM ızgarasının folyo üzerinde belirtilen desen ve konumlar içinde birikmesiyle yönlendirilirken, diğer alanlar kirlenme önleyici bir tabaka ile kaplanmıştır. Yüzey kaplaması ve desen tasarımı seçimlerindeki esneklik, mikropatterning'i çok çeşitli hücre tipleri için geniş ölçüde uygulanabilir hale getirir. Mikropatterning, bireysel hücrelerdeki yapıların yanı sıra konak-patojen etkileşimleri veya farklılaştırılmış çok hücreli topluluklar gibi daha karmaşık deneysel sistemlerin çalışmaları için yararlıdır. Mikropatterning ayrıca korelatif ışık ve elektron mikroskopisi (kriyo-CLEM) ve odaklanmış iyon ışın frezeleme (kriyo-FIB) dahil olmak üzere birçok aşağı akış tüm hücreli kriyo-ET iş akışına entegre edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows at JoVE.com

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Bu protokolün amacı, hücre yapıştırma ve büyümesini kriyo-elektron mikroskopisi için hedeflenen ızgara alanlarına yönlendirmektir. Bu, kullanıcı tarafından belirtilen desenlerde ablated bir anti-kirlenme tabakasının uygulanması ve ardından hücre tohumlamadan önce desenli alanlarda hücre dışı matris proteinlerinin birikmesi ile elde edilir.

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Araştırma ekibimiz kriyo-elektron mikroskopisi ve kriyo-elektron tomografisi için teknolojiler ve protokoller geliştirmektedir. Hücre büyümesini ve kriyo-ET deneyleri için konumlandırmayı yönlendirmek için TEM şebekelerinin mikropatterning için protokoller geliştirdik. Tüm hücreli kriyo-elektron tomografisi, yerel donmuş hidratlı durumda korunmuş hücreler içindeki makromoleküler komplekslerin nanometre düzeyinde çözünürlük yapıları üretmek için kullanılır.Mikropatterning, tüm hücreli kriyo-ET, kriyo korelatif ışık elektron mikroskopisi ve kriyo odaklı iyon ışın frezeleme deneylerinin verimini artırabilir. EM ızgaralarındaki hücrelerin sayısı ve dağılımı tüm hücreli kriyo-ET çalışmaları için çok önemlidir. Bu protokol, mikropatterning yoluyla EM ızgaralarında hücre büyümesini yönlendirmek için hızlı, tekrarlanabilir ve geniş ölçüde uyarlanabilir bir yöntem sağlar.Araştırmacı pipetler, cımbızlar, temel hücre kültürü teknikleri ve floresan ve iletim elektron mikroskoplarını kullanarak rahat olmalıdır. İlk kez desenlerken, iyi bilinen bir hücre tipi ve ECM kombinasyonu kullanın ve bunları kapak örtüleri veya MatTek yemeklerinde test edin. Bu protokol geliştirmesinde yer alan araştırma ekibi üyeleri şunlardır:Dr.Brian Sibert, Bay Joseph Kim ve Dr. Jae Yang. Başlamak için ızgaraları bir ızgara hazırlık tutucusuna aktarın ve izgaraları karbon tarafı yukarı doğru boşaltın. Daha sonra, karbon tarafı olan ızgaraları, ızgaralar arasında en az bir santimetrelik bir ayrımla temiz bir cam kaydırağa veya kapak ucuna aktarın.Pipet Her ızgaraya 0,05 poli-L-lizin 10 mikrolitre ve ızgaraları nemli bir odada en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her ızgarayı pH 8.5'te 0.1 molar HEPES'in 15 mikrolitresi ile üç kez yıkayın. Izgarayı her yıkamada 30 saniye boyunca kuluçkaya bırakın, ardından ızgaranın kurumasına izin vermeden sıvının çoğunu bir pipetle ızgaradan çıkarın.Son yıkamadan sonra, her ızgarayı 0,1 molar HEPES'in 15 mikrolitresinde bırakın. Daha sonra, PEG-SVA çözeltisini hazırlayın ve ızgaralardaki HEPES çözeltisini derhal PEG-SVA çözeltisinin 10 mikrolitresi ile değiştirin, ardından ızgaraları nemli bir odada en az bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her ızgarayı 15 mikrolitre steril su ile üç kez yıkayın ve ızgarayı her yıkamada 30 saniye boyunca inkübe edin.Son yıkamadan sonra, her ızgarayı 15 mikrolitre suda bırakın. Yeni bir temiz kapak kapağının ortasına bir mikroliter damla su yerleştirin, ardından ızgarayı 15 mikroliter su damlasından karbon tarafı yukarı olacak şekilde yeni kapaktaki düşüşe dikkatlice aktarın. Daha sonra, ızgarayı ortalanmış tutarak ve ızgaranın karbon folyosuyla kalıbın temasını en aza indirerek ızgaranın üzerindeki PDMS kalıbına dikkatlice yerleştirin.Daha sonra ızgaraya bir mikroliter PLPP jel ekleyin ve karıştırmak için yavaşça pipet ekleyin. Izgara ile kapak kapağını kurumak için karanlık bir konuma taşıyın. Jel 15 ila 30 dakika içinde kurur.Mikropatterning için, yazılımı mikroskoptan canlı brightfield görünümüyle açın. İlk çalıştırma için yeni bir şablon tasarlamak için Yatırım getirisi ekle'yi seçin ve 3.000 mikrometre daire seçin. Ekrandaki Brightfield görüntüsünü kılavuz olarak kullanarak daire yatırım getirisini ızgaranın üzerine getirin, ardından yatırım getirisini sabitlemek için Kilitle'ye basın.Yatırım getirisini yerinde kilitledikten sonra Desen Ekle'yi seçin ve uygun deseni seçin. Çoğaltma seçeneklerini kullanarak, sekize sekiz kılavuz kare bölgesi oluşturmak için başlangıç deseninin kopyalarını oluşturun. Desenleri ızgara kareleriyle hizalamak için aralığı ve açıyı gerektiği gibi ayarlayın.Deseni ızgaranın bir köşesine yerleştirin. Ardından, deseni çoğaltın ve mikroskop aşamasını her bölge için gerektiği gibi hareket ettirerek ızgaranın dört köşesinin her birine bir kopya yerleştirin. Sekize sekiz ızgara kare bölgesini, merkezin her iki tarafına yerleştirilecek ikiye sekiz kılavuz kare bölgesine değiştirmek için çoğaltma seçeneklerini kullanın.Orta dört ızgara karesini karşılıksız bırakın. Her desen için gerekirse toplam dozu ayarlayın. Milimetre kare başına 30 milijoule iyi bir başlangıç noktasıdır.Uzman Seçenekleri altında, desenin ızgara kareleriyle hizalamasını iyileştirmek için desenin açısını, konumunu, boşluğu ve oranını ayarlamayı yinele. Brightfield ekranındaki ızgara bölgesini değiştirmek için mikroskop aşamasını hareket ettinin. Şablon ve desenler konumlandıktan sonra, yazılımın eylem panelinde yer alan bölgelerden biri hariç tüm bölgelerin işaretini kaldırın.Mikroskop aşamasını kullanarak o bölgeye gidin ve karbon folyoya odaklanın. Desen yer paylaşımı görüntüsünü kapatmak için eylem panelinde göz küresi simgesine tıklayın. Izgara netleme işlemine başladıktan sonra Brightfield deklanşörünü kapatın ve yazılımın sağ alt köşesindeki Oynat simgesine basarak canlı olarak izlenebilen desenleme işlemine başlayın.Tüm bölgeler desenlenene kadar bu adımı yineleyin. Son olarak, ızgara ile kapak çizgisini mikroskoptan çıkarın ve hemen ızgaraya 10 mikrolitre steril PBS ekleyin. 10 dakika sonra, kalıbı cımbızla çıkarın, ardından ızgarayı 15 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve her ızgarayı PBS'de karanlık bir konumda bırakın.Her ızgara için hücre dışı matrisin 15 mikrolitresini hazırlayın, ardından her ızgaradan PBS'yi hücre dışı matrisin 15 mikrolitresi ile değiştirin ve ızgarayı nemli bir odada en az bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her ızgarayı daha önce gösterildiği gibi 15 mikrolitre steril PBS ile beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, her ızgarayı PBS'de bırakın.Floresan mikroskop kullanarak, desenlenmeyi ve karbon folyonun bozulmadan kaldığını doğrulamak için hücre dışı matristeki floroforu tespit edin. Mikropatterned ve unpatterned TEM ızgaraları üzerine tohumlanmış HeLa hücreleri, bir kalsein ve ethidium homodimer-1 bazlı hücre canlılığı tahlilleri kullanılarak floresan boyama ile görülebilir. Karışık bir kollajen ve fibrinojen hücre dışı matris kullanan HeLa hücreleri, ızgaradaki desenlere kolayca yapışır.Desen boyunca genişleyen hücrelerin genel morfolojisi, bölünmemiş ızgaralarda yetişen hücrelerinkine benzer. RSV enfekte BEAS-2B hücrelerinin Brightfield görüntüsü tohumlamadan 18 saat sonra, desenin merkezi bölgesi boyunca hücre yapışma ve büyümesini gösterir. Enfekte hücrelerin çoğu, gradyan deseninin daha yüksek yoğunluklu merkezi bölgesi boyunca konumlandırılmıştır.RSV varyantları, mikropatterned ızgaralarda yetişen enfekte BEAS-2B hücrelerinin çevresine yakın bir konumda bulunur. Tomogramlarda nükleapsid ve viral füzyon proteini de dahil olmak üzere birçok RSV yapısal proteini tanımlanmıştır. Mikropatterned ızgaralarda, pan-nöronal GFP ekspresyonlu Drosophila nöronları, floresan etiketleme ve mikropatternler içinde konumları nedeniyle ışık mikroskopisi ile kolayca takip edilebilir.Kırılmamış ızgaralardaki nöronlar, ışık mikroskopisi ile GFP sinyali ile de izlenebilir. Bununla birlikte, hücresel döküntüler ve medyadan kaynaklanan kirlenme nedeniyle kriyo-elektron mikroskopisinde yer almak zorlaşır. Nöron hücre gövdesinin boyutları ve genişletilmiş nötritler nedeniyle, kriyo-elektron tomografi eğim serisi, hücrelerin daha ince bölgeleri boyunca daha yüksek büyütme ile toplanır.Nöronal hücre zarı, mitokondri, mikrotübüller, aktüen filamentler, veziküler yapılar ve ribozomlar gibi makromoleküller, 3D tomogram boyunca daha yüksek büyütme görüntü montajlarında ve dilimlerinde iyi çözülür. Benzer hücre altı özellikler, 3D tomogramlardan, 3D tomogramlardan gözlenir. Kalıbın ızgaraya uygulanması ve PLPP jeline eklenmesi, desenleme sonuçlarını etkileyebilecek en hassas adımdır ve dikkatli yapılmalıdır.Cryo-CLEM, cryo-ET veri toplama için hücrelerdeki ilgi çekici hedefleri yerelleştirmek için kullanılabilir. Cryo-FIB-SEM, veri toplama için çok kalın alanlardaki hücreleri inceltmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Zaman Çözümlü Cryo-Elektron Mikroskopisi için Hızlı Şebeke Hazırlığı

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Kriyo-Elektron Mikroskobu ile Mikrotübül Protein Komplekslerini İncelemek için Memeli Hücrelerinden Modifiye Mikrotübüllerin Çıkarılması

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Yüksek Çözünürlüklü Yapı Belirleme için Tek Katmanlı Grafenin Kriyo-Elektron Mikroskobu Izgaralarına Uygulanması

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...