Name: evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts at JoVE.com

Karner-laboratoriet er støttet af National Institute of Health R01-tilskud (AR076325 og AR071967) til C.M.K.

Alle museprocedurer, der er beskrevet heri, blev godkendt af dyreforsøgsudvalgene ved University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas. Strålingsprotokollen blev godkendt af Radiation Safety Advisory Committee ved University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas.
1. Optagelse af aminosyrer i celler (protokol I)
<ol><li>Plade 5 x 104 ST2-celler i hver brønd i en 12-brønds vævskulturplade. Pladeceller i α-MEM indeholdende 10% FBS, 100 U/ml peni...

<ol>
	<li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+&#945;-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors.">Inhibition of &#945;-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes &amp; Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li><li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Krebs+to+clinic:+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy.">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li><li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts.">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species.">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li><li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation.">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia.">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).</li><li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells.">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li><li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney.">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li><li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells.">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li><li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression.">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li><li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor.">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457 (2016).</li><li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis.">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li><li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation.">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+sensor+Eif2ak4/GCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice.">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li><li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts.">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li><li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae.">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li><li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins.">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li><li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism.">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li><li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone:+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone.">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li><li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells.">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li><li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transporters+revisited:+New+views+in+health+and+disease.">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet heri, giver en hurtig og følsom tilgang til evaluering af aminosyreoptagelse som reaktion på forskellige eksperimentelle permutationer enten in vitro eller ex vivo. Sammenlignet med kommercielt tilgængelige sæt (f.eks. Glutamin og Glutamat Determination Kit), er denne metode meget mere følsom, hurtigere og mindre arbejdskrævende16,17,25. I vores protokol evaluerer vi optagel...

Aminosyrer er organiske forbindelser, der indeholder en amino (-NH2) og carboxyl (-COOH) funktionelle grupper med en variabel sidekæde, der er specifik for hver aminosyre. Generelt er aminosyrer velkendte som den grundlæggende bestanddel af protein. For nylig er nye anvendelser og funktioner af aminosyrer blevet belyst. For eksempel kan individuelle aminosyrer metaboliseres for at generere mellemliggende metabolitter, der bidrager til bioenergetik, fungerer som enzymatiske cofaktorer, regulerer reaktive iltarter eller bruges til at syntetisere andre aminosyrer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Mange undersøgelser viser, at aminosyremetabolisme er kritisk for cellepluripotens, proliferation og differentiering i forskellige sammenhænge 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblaster er sekretoriske celler, der producerer og udskiller kollagen type 1 rig ekstracellulær knoglematrix. For at opretholde høje proteinsyntesehastigheder under knogledannelse kræver osteoblaster en konstant forsyning af aminosyrer. For at imødekomme denne efterspørgsel skal osteoblaster aktivt erhverve aminosyrer. I overensstemmelse hermed afslører nylige undersøgelser betydningen af aminosyreoptagelse og metabolisme i osteoblastaktivitet og knogledannelse 15,16,17,18,19,20.
Osteoblaster erhverver cellulære aminosyrer fra tre hovedkilder: ekstracellulært miljø, intracellulær proteinnedbrydning og de novo aminosyrebiosyntese. Denne protokol vil fokusere på evaluering af aminosyreoptagelse fra ekstracellulært miljø. De mest almindelige metoder til måling af aminosyreoptagelse er afhængige af enten radioaktivt mærkede (f.eks. 3H eller 14C) eller tunge isotopmærkede (f.eks. 13C) aminosyrer. Tunge isotopomeranalyser kan analysere aminosyreoptagelse og metabolisme mere grundigt og sikkert, men er mere tidskrævende at tage flere dage at gennemføre, da det tager en dag at forberede og aflede prøver og flere dage at analysere på massespektrometeret afhængigt af antallet af prøver21,22. Til sammenligning er radioaktivt mærkede aminosyreoptagelsesanalyser ikke informative om downstream-metabolisme, men er billige og relativt hurtige og kan afsluttes inden for 2-3 timer fra eksperimentets start23,24. Her beskriver vi en let modificerbar basisprotokol designet til at evaluere radioaktivt mærket aminosyreoptagelse i dyrkede primære celler eller cellelinjer in vitro eller individuelle knogleaksler ex vivo. Anvendelsen af disse to protokoller kan udvides til andre radioaktivt mærkede aminosyrer og andre knogleassocierede celletyper og væv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1123001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>choline chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forceps, scissors, scapels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET551250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z190535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium chloride solution, 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM&#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 15mL</td>
			<td>Biotix</td>
			<td>89511-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonic&#38;Materials</td>
			<td>VCX130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>648311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold (Scintillation solution)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(Methylamino)isobutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2383</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts

Knogleudvikling og homeostase er afhængig af differentieringen og aktiviteten af knogledannende osteoblaster. Osteoblastdifferentiering er sekventielt karakteriseret ved proliferation efterfulgt af proteinsyntese og i sidste ende knoglematrixsekretion. Proliferation og proteinsyntese kræver en konstant tilførsel af aminosyrer. På trods af dette er der meget lidt kendt om aminosyreforbrug i osteoblaster. Her beskriver vi en meget følsom protokol, der er designet til at måle aminosyreforbrug ved hjælp af radioaktivt mærkede aminosyrer. Denne metode er optimeret til at kvantificere ændringer i aminosyreoptagelse, der er forbundet med osteoblastproliferation eller differentiering, lægemiddel- eller vækstfaktorbehandlinger eller forskellige genetiske manipulationer. Det er vigtigt, at denne metode kan bruges i flæng til at kvantificere aminosyreforbruget i dyrkede cellelinjer eller primære celler in vitro eller i isolerede knogleaksler ex vivo. Endelig kan vores metode let tilpasses til at måle transporten af nogen af aminosyrerne samt glukose og andre radioaktivt mærkede næringsstoffer.

Aminosyretransport reguleres af mange membranbundne aminosyretransportører, der er blevet kategoriseret i forskellige transportsystemer baseret på adskillige egenskaber, herunder substratspecificitet, kinetik samt ion- og pH-afhængighed25. For eksempel kan glutaminoptagelse formidles af de Na +-afhængige transportsystemer A, ASC, γ+L og N eller det Na+-uafhængige system L. De Na+-afhængige systemer udmærker sig ved evnen til at erstatte Na+ (System N) med L...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts at JoVE.com

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

Denne protokol præsenterer et radioaktivt mærket aminosyreoptagelsesassay, som er nyttigt til evaluering af aminosyreforbrug enten i primære celler eller i isolerede knogler.

Evaluering af aminosyreforbrug i dyrkede knogleceller og isolerede knogleaksler

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

Aminosyreoptagelse og metabolisme er afgørende for osteoblastspecifikation, differentiering og knogledannelse. Denne protokol giver en hurtig og følsom metode til at evaluere aminosyreoptagelsen. Vores protokol bruger radioaktivt mærkede aminosyrer til at kvantificere aminosyreoptagelsen.Det er en billig, følsom og hurtig metode, som let kan ændres til forskellige forhold. Denne protokol kan let ændres for at evaluere optagelsen af andre radioaktivt mærkede næringsstoffer som glukose og fedtsyrer i en række væv samt primære eller transformerende celler. For at begynde aminosyreoptagelsesanalysepladen fem gange 10 til den fjerde ST2-celler i hver brønd i en 12 brøndvævskulturplade i alfa MEM-medium suppleret med FBS, penicillin og streptomycin.Plade ekstra brønde af celler for at kvantificere cellenummeret pr. betingelse for normaliseringerne. Inkuber derefter celler i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i to til tre dage, indtil de er sammenflydende. Efter inkubation opsuges mediet og vaskes cellerne to gange med en milliliter PBS ved pH 7,4.Derefter opsuges PBS, før cellerne vaskes en gang med en milliliter Krebs-Ringer's HEPES eller KRH. Inkubere celler med 0,5 ml frisklavet KRH indeholdende fire mikrocuries pr. milliliter L34 tritieret glutaminarbejdsmedie i fem minutter. Efter inkubation skal du samle det radioaktive medium for at dispensere i beholderen til flydende affald.Vask derefter cellerne tre gange med iskold KRH for at afslutte reaktionen. Derefter tilsættes en milliliter 1% natriumdodecylsulfat til hver brønd og triturerer blandingen 10 gange for at lyse og homogenisere cellerne. Overfør derefter cellelysaterne til et 1,5 ml rør og klargør lysatet ved centrifugering med en minimumshastighed på 10.000 G i 10 minutter.Overfør supernatanten til et hætteglas med scintillation, der indeholder otte milliliter af scintillationsopløsningen, og læs radioaktivitet og tællinger pr. minut ved hjælp af scintillationstælleren. Fra de resterende ikke-radioaktive plader af celler trypsiniserer, resusinerer og tæller cellerne for at estimere antallet af celler i de lyserede radioaktive kulturer. Ved hjælp af et hæmacytometer tælles antallet af celler pr. ikke-radioaktiv brønd for hver eksperimentel tilstand.For at bestemme aminosyreoptagelsen skal du skylle marven ud af knoglen, inden knogleskaftet vejes. For at decellularisere knoglen koges en humerus i PBS ved 100 grader Celsius i 10 minutter. Ligevægt både levende og kogt humeri i en milliliter KRH i 30 minutter i cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius.Derefter inkuberes de eksperimentelle og kogte kontrolknogler separat i frisklavet KRH indeholdende fire mikrokarryer pr. milliliter L234 tricieret arginin i op til 90 minutter ved 37 grader Celsius. Efter fjernelse af det radioaktive medium afsluttes reaktionen ved at vaske humerus tre gange med en milliliter iskold KRH. Overfør hver knogle til et 1,5 milliliter rør med 500 mikroliter RIPA Buffer.Homogeniser derefter humerus og RIPA Buffer ved at hugge 100 gange med saks, efterfulgt af sonikering ved 35% amplitude og et sekund puls i 10 sekunder. Klargjort lysatet ved centrifugering i 10 minutter ved 10.000 gange G ved stuetemperatur. Efter centrifugering overføres 200 mikroliter af supernatanten til scintillationshætteglas indeholdende otte milliliter af scintillationsopløsningen.Læs radioaktivitet ved hjælp af scintillationstælleren. Kinetiske egenskaber af in vitro L34 tritieret glutaminoptagelse og sammenflydende ST2-celler blev evalueret i nærvær eller fravær af natriummethylaminosmørsyre eller lithium. Fjernelsen af natrium førte til en reduktion på 90% i glutaminoptagelsen.Tilstedeværelsen af lithium øgede glutaminoptagelsen med 2% sammenlignet med den natriumfrie tilstand. Mens methylaminoisosmørsyre ikke påvirkede glutaminoptagelsen. De procentvise bidrag fra system A, N, L eller ASC og gamma plus L viste, at de fleste glutaminoptagelser medieres af systemerne ASC, og gamma plus L.System N er ansvarlig for ca. 2 % natriumafhængig glutaminoptagelse.Og system A viste 0% bidrag og optagelse. X-VIVO L34 tritiated arginin optagelse i kogt og levende neonatal humeri blev analyseret over et tidsforløb på to timer. Argininoptagelsen steg lineært gennem hele eksperimentet og levende humeri.Den kogte humeri udviste ikke en dynamisk stigning i argininoptagelsen i eksperimentet. Den repræsentative analyse viser den normaliserede og korrigerede argininoptagelse. Det er vigtigt at koge den kontralaterale knogle som en aktiv kontrol.Dette trin er vigtigt, da knoglematrixen kan absorbere radioaktive aminosyrer, hvilket resulterer i unøjagtige resultater. Protokollen har gjort det muligt for os at bekræfte aminosyreoptagelseskinetik både in vitro og in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Longitudinal Evaluering af Mouse Hind Limb knogletab Efter Rygmarvsskader med Roman, In vivo, Metodologi

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Models of Bone Metastasis

Modeller af knoglemetastaser

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Præklinisk evaluering af tyrosinkinasehæmmere for Behandling af akut leukæmi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Femoral knoglemarv Aspiration i levende mus

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In vivo-billeddannelse og sporing af technetium-99m-mærkede Bone Marrow mesenchymale stamceller i Equine tendinopati

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

Behandling med Vancomycin indlæst calciumsulfat og autogen knogle i en forbedret kanin Model af knoglen infektion

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Database-styrede flowcytometri for evaluering af knoglemarven myeloide celle modning

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat

Ved hjælp af en knæ Arthrometer at vurdere væv-specifikke bidrag til knæ fleksion kontraktur i rotter

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Kvantitativ [18F]-NAF-Pet-MRI-analyse til vurdering af dynamisk knogleomsætning hos en patient med Facetogen lændesmerter

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...