Name: evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00
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Le laboratoire Karner est soutenu par des subventions R01 du National Institute of Health (AR076325 et AR071967) à C.M.K.

Toutes les procédures de souris décrites ici ont été approuvées par les comités d’études animales du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas. Le protocole de radioprotection a été approuvé par le Comité consultatif de radioprotection du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas.
1. Absorption d’acides aminés dans les cellules (Protocole I)
<ol><li>Plaque 5 x 104 cellules ST2 dans chaque puits d’un...

<ol>
	<li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+&#945;-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors.">Inhibition of &#945;-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes &amp; Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li><li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Krebs+to+clinic:+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy.">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li><li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts.">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species.">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li><li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation.">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia.">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).</li><li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells.">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li><li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney.">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li><li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells.">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li><li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression.">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li><li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor.">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457 (2016).</li><li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis.">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li><li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation.">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+sensor+Eif2ak4/GCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice.">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li><li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts.">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li><li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae.">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li><li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins.">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li><li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism.">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li><li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone:+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone.">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li><li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells.">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li><li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transporters+revisited:+New+views+in+health+and+disease.">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li></ol>

Le protocole décrit ici fournit une approche rapide et sensible pour évaluer l’absorption des acides aminés en réponse à diverses permutations expérimentales in vitro ou ex vivo. Par rapport aux kits disponibles dans le commerce (par exemple, les kits de détermination de la glutamine et du glutamate), cette méthode est beaucoup plus sensible, plus rapide et moins exigeante en main-d’œuvre16,17,25. ...

Les acides aminés sont des composés organiques qui contiennent un groupe fonctionnel amino (-NH2) et carboxyle (-COOH) avec une chaîne latérale variable spécifique à chaque acide aminé. En général, les acides aminés sont bien connus comme le constituant de base des protéines. Plus récemment, de nouvelles utilisations et fonctions des acides aminés ont été élucidées. Par exemple, les acides aminés individuels peuvent être métabolisés pour générer des métabolites intermédiaires qui contribuent à la bioénergétique, fonctionnent comme cofacteurs enzymatiques, régulent les espèces réactives de l’oxygène ou sont utilisés pour synthétiser d’autres acides aminés 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De nombreuses études démontrent que le métabolisme des acides aminés est essentiel pour la pluripotence, la prolifération et la différenciation cellulaires dans divers contextes 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Les ostéoblastes sont des cellules sécrétoires qui produisent et sécrètent la matrice osseuse extracellulaire riche en collagène de type 1. Pour maintenir des taux élevés de synthèse des protéines pendant la formation osseuse, les ostéoblastes exigent un apport constant en acides aminés. Pour répondre à cette demande, les ostéoblastes doivent acquérir activement des acides aminés. Conformément à cela, des études récentes révèlent l’importance de l’absorption et du métabolisme des acides aminés dans l’activité des ostéoblastes et la formation osseuse 15,16,17,18,19,20.
Les ostéoblastes acquièrent des acides aminés cellulaires à partir de trois sources principales: le milieu extracellulaire, la dégradation des protéines intracellulaires et la biosynthèse de novo des acides aminés. Ce protocole se concentrera sur l’évaluation de l’absorption des acides aminés à partir de l’environnement extracellulaire. Les méthodes les plus courantes pour mesurer l’absorption des acides aminés reposent sur des acides aminés radiomarqués (p. ex., 3H ou 14C) ou des isotopes lourds marqués (p. ex. 13C). Les dosages d’isotopomères lourds peuvent analyser l’absorption et le métabolisme des acides aminés de manière plus approfondie et plus sûre, mais ils prennent plus de temps et prennent plusieurs jours à compléter car il faut une journée pour préparer et dérivatiser les échantillons et plusieurs jours pour analyser sur le spectromètre de masse en fonction du nombre d’échantillons21,22. En comparaison, les tests d’absorption des acides aminés radiomarqués ne sont pas informatifs sur le métabolisme en aval, mais sont peu coûteux et relativement rapides, pouvant être achevés dans les 2-3 heures suivant le début de l’expérience23,24. Ici, nous décrivons un protocole de base facilement modifiable conçu pour évaluer l’absorption d’acides aminés radiomarqués dans des cellules primaires en culture ou des lignées cellulaires in vitro ou des arbres osseux individuels ex vivo. L’application de ces deux protocoles peut être étendue à d’autres acides aminés radiomarqués et à d’autres types de cellules et de tissus associés aux os.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1123001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>choline chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forceps, scissors, scapels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET551250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z190535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium chloride solution, 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM&#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 15mL</td>
			<td>Biotix</td>
			<td>89511-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonic&#38;Materials</td>
			<td>VCX130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>648311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold (Scintillation solution)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(Methylamino)isobutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2383</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts

Le développement osseux et l’homéostasie dépendent de la différenciation et de l’activité des ostéoblastes formant des os. La différenciation des ostéoblastes est caractérisée séquentiellement par une prolifération suivie d’une synthèse protéique et, finalement, d’une sécrétion de matrice osseuse. La prolifération et la synthèse des protéines nécessitent un apport constant en acides aminés. Malgré cela, on sait très peu de choses sur la consommation d’acides aminés dans les ostéoblastes. Nous décrivons ici un protocole très sensible conçu pour mesurer la consommation d’acides aminés à l’aide d’acides aminés radiomarqués. Cette méthode est optimisée pour quantifier les changements dans l’absorption des acides aminés qui sont associés à la prolifération ou à la différenciation des ostéoblastes, aux traitements médicamenteux ou aux facteurs de croissance, ou à diverses manipulations génétiques. Il est important de noter que cette méthode peut être utilisée de manière interchangeable pour quantifier la consommation d’acides aminés dans des lignées cellulaires cultivées ou des cellules primaires in vitro ou dans des puits osseux isolés ex vivo. Enfin, notre méthode peut être facilement adaptée pour mesurer le transport de l’un des acides aminés ainsi que du glucose et d’autres nutriments radiomarqués.

Le transport des acides aminés est régulé par de nombreux transporteurs d’acides aminés liés à la membrane qui ont été classés en systèmes de transport distincts en fonction de nombreuses caractéristiques, notamment la spécificité du substrat, la cinétique, ainsi que la dépendance aux ions et au pH25. Par exemple, l’absorption de glutamine peut être médiée par les systèmes de transport dépendants de Na+ A, ASC, γ+L et N ou le système L indépendant de Na+<...

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Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts (Video) | JoVE

Ce protocole présente un test d’absorption d’acides aminés radiomarqués, utile pour évaluer la consommation d’acides aminés dans les cellules primaires ou dans les os isolés.

Évaluation de la consommation d’acides aminés dans les cellules osseuses en culture et les arbres osseux isolés

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

L’absorption et le métabolisme des acides aminés sont essentiels pour la spécification, la différenciation et la formation osseuse des ostéoblastes. Ce protocole fournit une méthode rapide et sensible pour évaluer l’absorption des acides aminés. Notre protocole utilise des acides aminés radiomarqués pour quantifier l’absorption des acides aminés.C’est une méthode bon marché, sensible et rapide qui peut être facilement modifiée pour différentes conditions. Ce protocole peut facilement être modifié pour évaluer l’absorption d’autres nutriments radiomarqués comme le glucose et les acides gras dans une variété de tissus ainsi que dans les cellules primaires ou transformées. Pour commencer, plaquer cinq fois 10 à la quatrième cellule ST2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 12 puits en milieu alpha MEM supplémentée en FBS, pénicilline et streptomycine.Plaquer des puits supplémentaires de cellules pour quantifier le nombre de cellules par condition pour les normalisations. Ensuite, incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours jusqu’à confluence. Après incubation, aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS à pH 7,4.Ensuite, aspirez le PBS avant de laver les cellules une fois avec un millilitre de HEPES ou KRH de Krebs-Ringer. Incuber des cellules avec 0,5 millilitre de KRH fraîchement préparé contenant quatre microcuries par millilitre de milieu de travail de glutamine tritiée L34 pendant cinq minutes. Après l’incubation, recueillir le milieu radioactif pour le distribuer dans le conteneur à déchets liquides.Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Ensuite, ajoutez un millilitre de dodécylsulfate de sodium à 1% à chaque puits et triturez le mélange 10 fois pour lyser et homogénéiser les cellules. Ensuite, transférez les lysats cellulaires dans un tube de 1,5 millilitre et clarifiez le lysat en centrifugeant à une vitesse minimale de 10 000 G pendant 10 minutes.Transférer le surnageant dans un flacon à scintillation contenant huit millilitres de la solution de scintillation et lire l’activité radio et le nombre de comptes par minute à l’aide du compteur à scintillation. À partir des plaques non radioactives restantes des cellules, trypsiniser, remettre en suspension et compter les cellules pour estimer le nombre de cellules dans les cultures radioactives lysées. À l’aide d’un hémocytomètre, compter le nombre de cellules par puits non radioactif pour chaque condition expérimentale.Pour déterminer l’absorption d’acides aminés, rincer la moelle de l’os avant de peser la tige osseuse. Pour décellulariser l’os, faites bouillir un humérus dans du PBS à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Équilibrez l’humeri vivant et bouilli dans un millilitre de KRH pendant 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius.Ensuite, incuber séparément les os témoins expérimentaux et bouillis dans du KRH fraîchement préparé contenant quatre microcurries par millilitre d’arginine triciée L234 pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré le milieu radioactif, mettez fin à la réaction en lavant l’humérus trois fois avec un millilitre de KRH glacé. Transférez chaque os dans un tube de 1,5 millilitre avec 500 microlitres de tampon RIPA.Homogénéisez ensuite l’humérus et le tampon RIPA en hachant 100 fois avec des ciseaux, suivi d’une sonication à 35% d’amplitude et d’une impulsion seconde pendant 10 secondes. Clarifié le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 10 000 fois G à température ambiante. Après centrifugation, transférer 200 microlitres du surnageant dans des flacons à scintillation contenant huit millilitres de solution de scintillation.Lire l’activité radio à l’aide du compteur de scintillation. Les propriétés cinétiques de l’absorption in vitro de la glutamine tritiée par L34 et des cellules ST2 confluentes ont été évaluées en présence ou en l’absence d’acide méthylaminé isobutyrique sodique ou de lithium. L’élimination du sodium a entraîné une réduction de 90% de l’absorption de glutamine.La présence de lithium a augmenté l’absorption de glutamine de 2% par rapport à l’état sans sodium. Alors que l’acide méthylamino isobutyrique n’a pas affecté l’absorption de glutamine. Les contributions estimées en pourcentage des systèmes A, N, L ou ASC et gamma plus L ont indiqué que la majeure partie de l’absorption de glutamine est médiée par les systèmes ASC et gamma plus L.Le système N est responsable d’environ 2% de l’absorption de glutamine dépendante du sodium.Et le système A a montré 0% de contribution et d’adoption. L’absorption d’arginine tritiée X-VIVO L34 dans l’huméri néonatal bouilli et vivant a été analysée sur une période de deux heures. L’absorption d’arginine a augmenté linéairement tout au long de l’expérience et de l’humérium vivant.L’humérus bouilli n’a pas montré d’augmentation dynamique de l’absorption d’arginine dans l’expérience. L’analyse représentative montre l’absorption normalisée et corrigée de l’arginine. Il est important de faire bouillir l’os controlatéral comme témoin actif.Cette étape est essentielle car la matrice osseuse peut absorber des acides aminés radioactifs, ce qui entraîne des résultats inexacts. Le protocole nous a permis de confirmer la cinétique d’absorption des acides aminés à la fois in vitro et in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia (Video) | JoVE

Évaluation pré-clinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice (Video) | JoVE

Fémorale aspiration de moelle osseuse chez des souris en direct

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur (Video) | JoVE

In Vivo Évaluation du développement de cals de Fracture au cours de la guérison osseuse chez la souris en utilisant un dispositif d’ostéosynthèse IRM-compatible pour le fémur de souris

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection (Video) | JoVE

Traitement par vancomycine chargées de sulfate de Calcium et autogreffe osseuse dans un modèle de lapin amélioré d’Infection osseuse

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation (Video) | JoVE

Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat (Video) | JoVE

À l’aide d’un Arthrometer de genou pour évaluer les Contributions spécifiques des tissus à la Contracture de Flexion du genou chez le Rat

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain (Video) | JoVE

Analyse quantitative [18F]-Naf-PET-MRI pour l'évaluation du chiffre d'affaires dynamique d'os dans un patient présentant la douleur lombaire facetogenic

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model (Video) | JoVE

Analyse de cytométrie de flux des sous-ensembles de cellules immunitaires dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial dans un modèle d’arthrose

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...