Name: evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts at JoVE.com

Karner 연구소는 국립 보건원 R01 보조금 (AR076325 및 AR071967)의 지원을 받고 있습니다.

본원에 기재된 모든 마우스 절차는 달라스에 있는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터의 동물 연구 위원회에 의해 승인되었다. 방사선 프로토콜은 달라스에 있는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 의료 센터의 방사선 안전 자문 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 세포의 아미노산 흡수 (프로토콜 I)
<ol><li>5 x 104 ST2 세포를 12-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰?...

<ol>
	<li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+&#945;-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors.">Inhibition of &#945;-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes &amp; Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li><li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Krebs+to+clinic:+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy.">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li><li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts.">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species.">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li><li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation.">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia.">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).</li><li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells.">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li><li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney.">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li><li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells.">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li><li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression.">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li><li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor.">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457 (2016).</li><li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis.">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li><li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation.">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+sensor+Eif2ak4/GCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice.">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li><li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts.">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li><li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae.">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li><li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins.">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li><li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism.">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li><li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone:+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone.">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li><li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells.">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li><li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transporters+revisited:+New+views+in+health+and+disease.">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li></ol>

본원에 기재된 프로토콜은 시험관내 또는 생체외 중 다양한 실험 순열에 반응하여 아미노산 흡수를 평가하기 위한 빠르고 민감한 접근법을 제공한다. 시판되는 키트(예를 들어, 글루타민 및 글루타메이트 측정 키트)와 비교할 때, 이 방법은 훨씬 더 민감하고, 더 빠르며, 덜 노동 집약적이다16,17,25. 우리의 프로토?...

아미노산은 각 아미노산에 특이적인 가변 측쇄를 가진 아미노(-NH2) 및 카르복실(-COOH) 작용기를 포함하는 유기 화합물입니다. 일반적으로 아미노산은 단백질의 기본 구성 성분으로 잘 알려져 있습니다. 보다 최근에는 아미노산의 새로운 용도와 기능이 해명되었습니다. 예를 들어, 개별 아미노산은 생체 에너지학에 기여하거나, 효소 보조 인자로서 기능하거나, 활성 산소 종을 조절하거나, 다른 아미노산 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10을 합성하는 데 사용되는 중간 대사 산물을 생성하기 위해 대사 될 수 있습니다. . 많은 연구에서 아미노산 대사가 다양한 맥락에서 세포 다 능성, 증식 및 분화에 중요하다는 것을 보여줍니다 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
조골세포는 콜라겐 유형 1이 풍부한 세포외 뼈 기질을 생성하고 분비하는 분비 세포입니다. 뼈가 형성되는 동안 높은 단백질 합성 속도를 유지하기 위해 조골 세포는 아미노산의 지속적인 공급을 요구합니다. 이러한 요구를 충족시키기 위해 조골 세포는 적극적으로 아미노산을 획득해야합니다. 이와 일치하여 최근 연구는 조골 세포 활동 및 골 형성 15,16,17,18,19,20에서 아미노산 흡수 및 대사의 중요성을 보여줍니다.
조골 세포는 세 가지 주요 공급원으로부터 세포 아미노산을 얻습니다 : 세포 외 환경, 세포 내 단백질 분해 및 de novo 아미노산 생합성. 이 프로토콜은 세포 외 환경으로부터의 아미노산 흡수 평가에 초점을 맞출 것이다. 아미노산 흡수를 측정하는 가장 일반적인 방법은 방사성 표지 (예 : 3H또는 14C) 또는 중위 동위 원소 표지 (예 : 13C) 아미노산에 의존합니다. 중위원소 분석은 아미노산 흡수 및 대사를 보다 철저하고 안전하게 분석할 수 있지만 샘플을 준비하고 유도체화하는 데 하루가 걸리고 샘플 수에 따라 질량분석기에서 분석하는 데 며칠이 걸리기 때문에 완료하는 데 며칠이 걸리기 때문에 완료하는 데 더 많은 시간이 소요됩니다(21,22). 이에 비해 방사성 표지 된 아미노산 섭취 분석은 하류 대사에 대한 정보가 아니지만 저렴하고 비교적 빠르며 실험시작 23,24에서 2-3 시간 내에 완료 될 수 있습니다. 여기에서는 생체 외 배양 된 1 차 세포 또는 세포주 또는 개별 뼈 샤프트에서 방사성 표지 된 아미노산 흡수를 평가하도록 설계된 쉽게 수정할 수있는 기본 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 두 프로토콜의 적용은 다른 방사성 표지된 아미노산 및 다른 뼈 관련 세포 유형 및 조직으로 확장될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1123001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>choline chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forceps, scissors, scapels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET551250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z190535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium chloride solution, 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM&#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 15mL</td>
			<td>Biotix</td>
			<td>89511-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonic&#38;Materials</td>
			<td>VCX130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>648311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold (Scintillation solution)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(Methylamino)isobutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2383</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts

뼈 발달과 항상성은 골 형성 조골 세포의 분화와 활성에 달려 있습니다. 조골 세포 분화는 순차적으로 증식에 이어 단백질 합성과 궁극적으로 골 매트릭스 분비를 특징으로합니다. 증식과 단백질 합성에는 지속적인 아미노산 공급이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 조골 세포의 아미노산 소비에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 여기에서는 방사성 표지 된 아미노산을 사용하여 아미노산 소비를 측정하도록 설계된 매우 민감한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 조골 세포 증식 또는 분화, 약물 또는 성장 인자 치료 또는 다양한 유전자 조작과 관련된 아미노산 흡수의 변화를 정량화하는 데 최적화되어 있습니다. 중요하게도, 이 방법은 시험관 내 또는 생체 외 분리된 뼈 축에서 배양된 세포주 또는 일차 세포에서 아미노산 소비를 정량화하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 방법은 포도당 및 기타 방사성 표지 된 영양소뿐만 아니라 아미노산의 수송을 측정하기 위해 쉽게 적용 될 수 있습니다.

아미노산 수송은 기질 특이성, 동역학, 이온 및 pH 의존성을 포함하는 수많은 특성에 기초하여 별개의 수송 시스템으로 분류된 많은 막 결합 아미노산 수송체에 의해 조절된다25. 예를 들어, 글루타민 흡수는 Na + 의존성 수송 시스템 A, ASC, γ + L 및 N 또는 Na + 독립적 시스템 L에 의해 매개될 수 있습니다. Na+-의존성 시스템은 Li+를 Na+(시스템 N)로 대체...

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Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

이 프로토콜은 방사성 표지 된 아미노산 섭취 분석을 제시하며, 이는 일차 세포 또는 분리 된 뼈에서 아미노산 소비를 평가하는 데 유용합니다.

배양된 뼈 세포와 분리된 뼈축의 아미노산 소비 평가

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

아미노산 흡수와 대사는 조골 세포 사양, 분화 및 뼈 형성에 필수적입니다. 이 프로토콜은 아미노산 흡수를 평가하기 위한 신속하고 민감한 방법을 제공합니다. 우리의 프로토콜은 방사성 표지 된 아미노산을 사용하여 아미노산 섭취를 정량화합니다.다양한 조건에 맞게 쉽게 수정할 수 있는 저렴하고 민감하며 빠른 방법입니다. 이 프로토콜은 일차 또는 형질 전환 세포뿐만 아니라 다양한 조직에서 포도당 및 지방산과 같은 다른 방사성 표지 영양소의 흡수를 평가하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 5회 12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에서 ST2 세포를 10회 10회 FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 알파 MEM 배지에서 시작한다.정규화를 위한 조건당 세포 수를 정량화하기 위해 세포의 여분의 웰을 플레이트합니다. 다음으로, 합류할 때까지 섭씨 37도의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 5%이산화탄소와 함께 2-3일 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 배지를 흡인하고 세포를 pH 7.4에서 1 밀리리터의 PBS로 2 회 세척한다.그런 다음 1 밀리리터 Krebs-Ringer 's hepes 또는 KRH로 세포를 한 번 세척하기 전에 PBS를 흡인하십시오. L34 트리티에이티드 글루타민 작업 배지 밀리리터당 4개의 마이크로큐리를 함유한 신선하게 준비된 KRH 0.5밀리리터로 세포를 5분 동안 배양합니다. 배양 후 방사성 배지를 수집하여 액체 폐기물 용기에 분배합니다.그 후 세포를 얼음처럼 차가운 KRH로 3회 세척하여 반응을 종결시켰다. 다음으로, 각 웰에 1 % 나트륨 도데 실 설페이트 1 밀리리터를 첨가하고 혼합물을 10 회 분쇄하여 세포를 용해시키고 균질화한다. 그런 다음 세포 용해물을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 최소 10, 000 G의 속도로 10 분 동안 원심 분리하여 용해물을 정화합니다.상청액을 8 밀리리터의 섬광 용액이 들어있는 섬광 바이알로 옮기고 섬광 계수기를 사용하여 분당 전파 활동 및 카운트를 읽습니다. 세포의 나머지 비방사성 플레이트에서 세포를 트립신화, 재현탁 및 계수하여 용해된 방사성 배양물에서 세포 수를 추정합니다. 혈구계를 사용하여 각 실험 조건에 대해 비방사성 웰당 세포 수를 계산합니다.아미노산 섭취를 확인하려면 뼈 샤프트의 무게를 측정하기 전에 뼈에서 골수를 씻어냅니다. 뼈를 탈세포화하려면 PBS에서 상완골 하나를 섭씨 100도에서 10분 동안 끓입니다. 섭씨 37 도의 세포 배양 인큐베이터에서 30 분 동안 KRH 1 밀리리터의 살아있는 부식질과 삶은 상완골을 평형화시킵니다.다음으로, 실험 및 끓인 대조군 뼈를 밀리리터 L234 트리시에이티드 아르기닌 당 4개의 마이크로카레를 함유하는 새로 준비된 KRH에서 섭씨 37도에서 최대 90분 동안 별도로 배양한다. 방사성 매질을 제거한 후, 상완골을 얼음 차가운 KRH 1 밀리리터로 3회 세척하여 반응을 종결한다. 각 뼈를 1.5 마이크로 리터의 RIPA 버퍼가있는 500 밀리리터 튜브로 옮깁니다.그런 다음 가위로 100 번 절단하여 상완골과 RIPA 버퍼를 균질화 한 다음 35 % 진폭에서 초음파 처리하고 10 초 동안 1 초 펄스를 처리합니다. 용해물을 실온에서 10, 000번 G에서 10분간 원심분리하여 명확히 하였다. 원심분리 후, 200 마이크로리터의 상청액을 8 밀리리터의 섬광 용액을 함유하는 섬광 바이알에 옮긴다.섬광 카운터를 사용하여 라디오 활동을 읽습니다. 시험관내 L34 삼중화 글루타민 흡수 및 합류성 ST2 세포의 동역학적 특성은 나트륨 메틸아미노이소부티르산 또는 리튬의 존재 또는 부재하에서 평가하였다. 나트륨 제거로 글루타민 섭취가 90 % 감소했습니다.리튬의 존재는 나트륨이없는 상태에 비해 글루타민 흡수를 2 % 증가 시켰습니다. 반면 메틸 아미노 이소 부티르산은 글루타민 흡수에 영향을 미치지 않았습니다. 시스템 A, N, L 또는 ASC 및 감마 플러스 L의 추정 백분율 기여도는 대부분의 글루타민 흡수가 시스템 ASC에 의해 매개되고 감마와 L.시스템 N이 약 2 %의 나트륨 의존성 글루타민 섭취를 담당한다는 것을 나타냅니다.그리고 시스템 A는 0%의 기여도와 흡수를 보였습니다. X-VIVO L34 삼발화성 아르기닌 흡수를 삶은 신생아 상완골에서 2시간의 시간 과정에 걸쳐 분석하였다. 아르기닌 흡수는 실험 전반에 걸쳐 선형적으로 증가했으며 상완골이 살아 있습니다.끓인 상완골은 실험에서 아르기닌 흡수의 동적 증가를 나타내지 않았다. 대표적인 분석은 정규화되고 보정 된 아르기닌 흡수를 보여줍니다. 반대쪽 뼈를 능동적 인 대조군으로 끓이는 것이 중요합니다.이 단계는 뼈 매트릭스가 방사성 아미노산을 흡수하여 부정확한 결과를 초래할 수 있으므로 필수적입니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 아미노산 흡수 역학을 확인할 수있었습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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