Name: evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts at JoVE.com

Karner-laboratoriet støttes av National Institute of Health R01-tilskudd (AR076325 og AR071967) til CMK.

Alle museprosedyrer beskrevet her ble godkjent av dyreforsøkskomiteene ved University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas. Strålingsprotokollen ble godkjent av Radiation Safety Advisory Committee ved University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas.
1. Aminosyreopptak i celler (protokoll I)
<ol><li>Plate 5 x 104 ST2-celler i hver brønn i en 12-brønns vevskulturplate. Plateceller i α-MEM som inneholder 10 % FBS, 100 U/ml penicillin og 0,1 μg...

<ol>
	<li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+&#945;-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors.">Inhibition of &#945;-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes &amp; Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li><li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Krebs+to+clinic:+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy.">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li><li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts.">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species.">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li><li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation.">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia.">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).</li><li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells.">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li><li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney.">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li><li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells.">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li><li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression.">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li><li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor.">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457 (2016).</li><li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis.">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li><li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation.">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+sensor+Eif2ak4/GCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice.">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li><li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts.">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li><li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae.">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li><li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins.">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li><li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism.">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li><li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone:+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone.">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li><li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells.">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li><li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transporters+revisited:+New+views+in+health+and+disease.">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li></ol>

Protokollen beskrevet her gir en rask og sensitiv tilnærming til å evaluere aminosyreopptak som respons på ulike eksperimentelle permutasjoner enten in vitro eller ex vivo. Sammenlignet med kommersielt tilgjengelige sett (f.eks. Glutamin og glutamatbestemmelsessett), er denne metoden mye mer følsom, raskere og mindre arbeidsintensiv16,17,25. I vår protokoll evaluerer vi opptak i Krebs Ringers HEPES-buffer....

Aminosyrer er organiske forbindelser som inneholder en amino (-NH2) og karboksyl (-COOH) funksjonelle grupper med en variabel sidekjede som er spesifikk for hver aminosyre. Generelt er aminosyrer kjent som den grunnleggende bestanddelen av protein. Mer nylig har nye bruksområder og funksjoner av aminosyrer blitt belyst. For eksempel kan individuelle aminosyrer metaboliseres for å generere mellomliggende metabolitter som bidrar til bioenergetikk, fungerer som enzymatiske kofaktorer, regulerer reaktive oksygenarter eller brukes til å syntetisere andre aminosyrer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Mange studier viser at aminosyremetabolisme er kritisk for cellepluripotens, proliferasjon og differensiering i ulike sammenhenger 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblaster er sekretoriske celler som produserer og utskiller kollagen type 1 rik ekstracellulær beinmatrise. For å opprettholde høye nivåer av proteinsyntese under beindannelse, krever osteoblaster en konstant tilførsel av aminosyrer. For å møte denne etterspørselen må osteoblaster aktivt skaffe aminosyrer. I samsvar med dette viser nyere studier viktigheten av aminosyreopptak og metabolisme i osteoblastaktivitet og beindannelse 15,16,17,18,19,20.
Osteoblaster får cellulære aminosyrer fra tre hovedkilder: ekstracellulært miljø, intracellulær proteinnedbrytning og de novo aminosyrebiosyntese. Denne protokollen vil fokusere på evaluering av aminosyreopptak fra ekstracellulært miljø. De vanligste metodene for å måle aminosyreopptak er avhengige av enten radiomerkede (f.eks. 3H eller 14C) eller tunge isotopmerkede (f.eks. 13C) aminosyrer. Tunge isotopomeranalyser kan analysere aminosyreopptak og metabolisme grundigere og sikrere, men tar mer tidkrevende flere dager å fullføre, da det tar en dag å forberede og derivere prøver og flere dager å analysere på massespektrometeret avhengig av antall prøver21,22. Til sammenligning er radiomerkede aminosyreopptaksanalyser ikke informative om nedstrøms metabolisme, men er billige og relativt raske, og kan fullføres innen 2-3 timer fra starten av forsøket23,24. Her beskriver vi en lett modifiserbar grunnprotokoll designet for å evaluere radiomerket aminosyreopptak i dyrkede primære celler eller cellelinjer in vitro eller individuelle benaksler ex vivo. Anvendelsen av disse to protokollene kan utvides til andre radiomerkede aminosyrer og andre beinassosierte celletyper og vev.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1123001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>choline chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forceps, scissors, scapels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET551250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z190535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium chloride solution, 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM&#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 15mL</td>
			<td>Biotix</td>
			<td>89511-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonic&#38;Materials</td>
			<td>VCX130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>648311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold (Scintillation solution)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(Methylamino)isobutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2383</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts

Benutvikling og homeostase er avhengig av differensiering og aktivitet av bendannende osteoblaster. Osteoblastdifferensiering karakteriseres sekvensielt ved proliferasjon etterfulgt av proteinsyntese og til slutt benmatrikssekresjon. Spredning og proteinsyntese krever konstant tilførsel av aminosyrer. Til tross for dette er svært lite kjent om aminosyreforbruk i osteoblaster. Her beskriver vi en svært følsom protokoll som er designet for å måle aminosyreforbruk ved hjelp av radiomerkede aminosyrer. Denne metoden er optimalisert for å kvantifisere endringer i aminosyreopptak som er forbundet med osteoblastproliferasjon eller differensiering, medikament- eller vekstfaktorbehandlinger eller ulike genetiske manipulasjoner. Det er viktig at denne metoden kan brukes om hverandre for å kvantifisere aminosyreforbruket i dyrkede cellelinjer eller primære celler in vitro eller i isolerte beinaksler ex vivo. Endelig kan metoden vår enkelt tilpasses for å måle transporten av noen av aminosyrene, samt glukose og andre radiomerkede næringsstoffer.

Aminosyretransport reguleres av mange membranbundne aminosyretransportører som har blitt kategorisert i forskjellige transportsystemer basert på mange egenskaper, inkludert substratspesifisitet, kinetikk, samt ion- og pH-avhengighet25. For eksempel kan glutaminopptak medieres av de Na+-avhengige transportsystemene A, ASC, γ+L og N eller det Na+-uavhengige system L. De Na+-avhengige systemene utmerker seg ved evnen til å erstatte Li+ for Na+ (System N...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts at JoVE.com

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

Denne protokollen presenterer en radiomerket aminosyreopptaksanalyse, som er nyttig for å evaluere aminosyreforbruk enten i primære celler eller i isolerte bein.

Evaluering av aminosyreforbruk i dyrkede beinceller og isolerte benaksler

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

Aminosyreopptak og metabolisme er avgjørende for osteoblastspesifikasjon, differensiering og beindannelse. Denne protokollen gir en rask og sensitiv metode for å evaluere aminosyreopptak. Vår protokoll bruker radiomerkede aminosyrer for å kvantifisere aminosyreopptak.Det er en billig, følsom og rask metode som enkelt kan modifiseres for forskjellige forhold. Denne protokollen kan enkelt endres for å evaluere opptaket av andre radiomerkede næringsstoffer som glukose og fettsyrer i en rekke vev, samt primære eller transformere celler. For å starte aminosyreopptaksanalyseplate fem ganger 10 til fjerde ST2-celler i hver brønn i en 12-brønns vevskulturplate i alfa MEM-medium supplert med FBS, penicillin og streptomycin.Plate ekstra brønner av celler for å kvantifisere cellenummeret per betingelse for normaliseringene. Deretter inkuberer du celler i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i to til tre dager til de er sammenflytende. Etter inkubasjon aspirerer mediet og vasker cellene to ganger med en milliliter PBS ved pH 7,4.Deretter aspirerer PBS før du vasker cellene en gang med en milliliter Krebs-Ringers HEPES eller KRH. Inkuber celler med 0,5 milliliter nytilberedt KRH som inneholder fire mikrocuries per milliliter L34 tritiert glutamin arbeidsmedium i fem minutter. Etter inkubasjon, samle det radioaktive mediet for å dispensere i væskeavfallsbeholderen.Vask deretter cellene tre ganger med iskald KRH for å avslutte reaksjonen. Deretter tilsettes en milliliter 1% natriumdodecylsulfat til hver brønn og triturerer blandingen 10 ganger for å lyse og homogenisere cellene. Overfør deretter cellelysatene til et 1, 5 milliliter rør og klargjør lysatet ved sentrifugering med en minimumshastighet på 10.000 G i 10 minutter.Overfør supernatanten til et hetteglass med scintillasjon som inneholder åtte milliliter scintillasjonsoppløsning, og les radioaktivitet og telling per minutt ved hjelp av scintillasjonstelleren. Fra de resterende ikke-radioaktive celleplatene, trypsinisere, resuspendere og telle cellene for å estimere antall celler i de lyserte radioaktive kulturene. Ved hjelp av et hemacytometer teller antall celler per ikke-radioaktiv brønn for hver eksperimentell tilstand.For å bestemme aminosyreopptaket, skyll ut margen fra beinet før du veier benakselen. For å decellularisere beinet, kok en humerus i PBS ved 100 grader Celsius i 10 minutter. Balansere både levende og kokt humeri i en milliliter KRH i 30 minutter i cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius.Deretter inkuberer de eksperimentelle og kokte kontrollbenene separat i nytilberedt KRH som inneholder fire mikrocurries per milliliter L234 triciated arginin i opptil 90 minutter ved 37 grader Celsius. Etter å ha fjernet det radioaktive mediet, avslutt reaksjonen ved å vaske humerus tre ganger med en milliliter iskald KRH. Overfør hvert bein til et 1,5 milliliter rør med 500 mikroliter RIPA-buffer.Homogeniser deretter humerus og RIPA Buffer ved å hakke 100 ganger med saks, etterfulgt av sonikering ved 35% amplitude og ett sekund puls i 10 sekunder. Avklart lysatet ved sentrifugering i 10 minutter ved 10.000 ganger G ved romtemperatur. Etter sentrifugering, overfør 200 mikroliter av supernatanten til scintillasjonsflasker som inneholder åtte milliliter scintillasjonsoppløsning.Les radioaktivitet ved hjelp av scintillasjonstelleren. Kinetiske egenskaper til in vitro L34 tritiert glutaminopptak og konfluente ST2-celler ble evaluert i nærvær eller fravær av natriummetylaminoisosmørsyre eller litium. Fjerning av natrium førte til en 90% reduksjon i glutaminopptak.Tilstedeværelsen av litium økte glutaminopptaket med 2% sammenlignet med natriumfri tilstand. Mens metylaminoisosmørsyre ikke påvirket glutaminopptaket. Estimeringsprosentbidragene til system A, N, L eller ASC og gamma pluss L indikerte at det meste av glutaminopptaket er mediert av systemene ASC og gamma pluss L.System N er ansvarlig for omtrent 2% natriumavhengig glutaminopptak.Og system A viste 0% bidrag og opptak. X-VIVO L34 tritiert argininopptak i kokt og levende neonatal humeri ble analysert over et tidsforløp på to timer. Argininopptak økte lineært gjennom hele forsøket og levende humeri.Den kokte humeri viste ikke en dynamisk økning av argininopptak i forsøket. Den representative analysen viser normalisert og korrigert argininopptak. Det er viktig å koke det kontralaterale beinet som en aktiv kontroll.Dette trinnet er viktig da beinmatrisen kan absorbere radioaktive aminosyrer, noe som resulterer i unøyaktige resultater. Protokollen har gjort det mulig for oss å bekrefte aminosyreopptakskinetikk både in vitro og in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Langsgående Evaluering av Mouse Hind Limb Bone tap etter ryggmargsskade bruke Novel, In vivo Methodology

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Models of Bone Metastasis

Modeller for Bone Metastase

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Pre-kliniske Evaluering av tyrosinkinasehemmere for behandling av akutt leukemi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Femoral Bone Marrow Aspirasjon Live Mus

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In vivo avbilding og sporing av Technetium-99m Merket Bone Marrow stamceller i Equine tendinopati

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

Behandling med Vancomycin lastet kalsium sulfat og gjestfrihet bein i en forbedret kanin modell av benet infeksjon

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Database-guidede flowcytometri for evaluering av benmarg myelogen celle modning

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat

Bruke en kne Arthrometer å vurdere vev-spesifikke bidrag til kneet strekking Contracture i rotte

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Kvantitativ [18F]-NAF-pet-MRI analyse for evalueringen av drivkraft benomsetning inne en pasient med Facetogenic lav Ryggsmerte

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...