Name: evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00
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O laboratório Karner é apoiado por subsídios R01 do Instituto Nacional de Saúde (AR076325 e AR071967) para C.M.K.

Todos os procedimentos de camundongos aqui descritos foram aprovados pelos Comitês de Estudos Animais do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas, em Dallas. O protocolo de radiação foi aprovado pelo Comitê Consultivo de Segurança de Radiação do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas, em Dallas.
1. Absorção de aminoácidos nas células (Protocolo I)
<ol><li>Placa 5 x 104 células ST2 em cada poço de uma placa de cultura de tecido ...

<ol>
	<li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+&#945;-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors.">Inhibition of &#945;-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes &amp; Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li><li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Krebs+to+clinic:+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy.">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li><li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts.">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species.">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li><li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation.">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia.">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).</li><li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells.">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li><li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney.">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li><li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells.">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li><li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression.">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li><li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor.">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457 (2016).</li><li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis.">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li><li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation.">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+sensor+Eif2ak4/GCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice.">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li><li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts.">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li><li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae.">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li><li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins.">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li><li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism.">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li><li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone:+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone.">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li><li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells.">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li><li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transporters+revisited:+New+views+in+health+and+disease.">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li></ol>

O protocolo aqui descrito fornece uma abordagem rápida e sensível para avaliar a absorção de aminoácidos em resposta a várias permutações experimentais in vitro ou ex vivo. Quando comparado aos kits comercialmente disponíveis (por exemplo, Kit de Determinação de Glutamina e Glutamato), esse método é muito mais sensível, mais rápido e menos trabalhoso16,17,25. Em nosso protocolo, avaliamos a capta...

Os aminoácidos são compostos orgânicos que contêm um grupo funcional amino (-NH2) e carboxila (-COOH) com uma cadeia lateral variável que é específica para cada aminoácido. Em geral, os aminoácidos são bem conhecidos como o constituinte básico da proteína. Mais recentemente, novos usos e funções dos aminoácidos foram elucidados. Por exemplo, aminoácidos individuais podem ser metabolizados para gerar metabólitos intermediários que contribuem para a bioenergética, funcionam como cofatores enzimáticos, regulam espécies reativas de oxigênio ou são usados para sintetizar outros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Muitos estudos demonstram que o metabolismo de aminoácidos é crítico para a pluripotência, proliferação e diferenciação celular em vários contextos 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Os osteoblastos são células secretoras que produzem e secretam a rica matriz óssea extracelular rica em colágeno tipo 1. Para sustentar altas taxas de síntese de proteínas durante a formação óssea, os osteoblastos exigem um suprimento constante de aminoácidos. Para atender a essa demanda, os osteoblastos devem adquirir ativamente aminoácidos. Consistente com isso, estudos recentes revelam a importância da absorção e metabolismo de aminoácidos na atividade dos osteoblastos e na formação óssea 15,16,17,18,19,20.
Os osteoblastos adquirem aminoácidos celulares de três fontes principais: meio extracelular, degradação de proteínas intracelulares e biossíntese de aminoácidos de novo. Este protocolo se concentrará na avaliação da absorção de aminoácidos do ambiente extracelular. Os métodos mais comuns para medir a absorção de aminoácidos dependem de aminoácidos marcados radiomarcados (por exemplo, 3H ou 14C) ou isotopos pesados (por exemplo, 13C). Ensaios pesados de isotopômeros podem analisar a absorção e o metabolismo de aminoácidos de forma mais completa e segura, mas são mais demorados, levando vários dias para serem concluídos, pois leva um dia para preparar e derivar amostras e vários dias para analisar no espectrômetro de massa, dependendo do número de amostras21,22. Em comparação, os ensaios de captação de aminoácidos radiomarcados não são informativos sobre o metabolismo a jusante, mas são baratos e relativamente rápidos, podendo ser concluídos dentro de 2-3 h a partir do início do experimento23,24. Aqui, descrevemos um protocolo básico facilmente modificável projetado para avaliar a captação de aminoácidos radiomarcados em células primárias cultivadas ou linhagens celulares in vitro ou eixos ósseos individuais ex vivo. A aplicação desses dois protocolos pode ser estendida a outros aminoácidos radiomarcados e outros tipos de células e tecidos associados ao osso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1123001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>choline chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forceps, scissors, scapels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET551250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z190535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium chloride solution, 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM&#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 15mL</td>
			<td>Biotix</td>
			<td>89511-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonic&#38;Materials</td>
			<td>VCX130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>648311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold (Scintillation solution)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(Methylamino)isobutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2383</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts

O desenvolvimento ósseo e a homeostase dependem da diferenciação e da atividade dos osteoblastos formadores de ossos. A diferenciação de osteoblastos é caracterizada sequencialmente por proliferação seguida de síntese proteica e, finalmente, secreção da matriz óssea. A proliferação e a síntese de proteínas requerem um fornecimento constante de aminoácidos. Apesar disso, muito pouco se sabe sobre o consumo de aminoácidos em osteoblastos. Aqui descrevemos um protocolo muito sensível que é projetado para medir o consumo de aminoácidos usando aminoácidos radiomarcados. Este método é otimizado para quantificar as mudanças na absorção de aminoácidos que estão associadas à proliferação ou diferenciação de osteoblastos, tratamentos com drogas ou fatores de crescimento ou várias manipulações genéticas. É importante ressaltar que este método pode ser usado de forma intercambiável para quantificar o consumo de aminoácidos em linhagens celulares cultivadas ou células primárias in vitro ou em eixos ósseos isolados ex vivo. Finalmente, nosso método pode ser facilmente adaptado para medir o transporte de qualquer um dos aminoácidos, bem como glicose e outros nutrientes radiomarcados.

O transporte de aminoácidos é regulado por muitos transportadores de aminoácidos ligados à membrana que foram categorizados em sistemas de transporte distintos com base em inúmeras características, incluindo especificidade do substrato, cinética, bem como dependência de íons e pH25. Por exemplo, a absorção de glutamina pode ser mediada pelos sistemas de transporte dependentes de Na+ A, ASC, γ+L e N ou pelo Sistema L independente de Na+. Os sistemas dependentes de ...

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Este protocolo apresenta um ensaio de captação de aminoácidos radiomarcado, que é útil para avaliar o consumo de aminoácidos em células primárias ou em ossos isolados.

Avaliação do Consumo de Aminoácidos em Células Ósseas Cultivadas e Eixos Ósseos Isolados

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

A absorção e o metabolismo de aminoácidos são essenciais para a especificação, diferenciação e formação óssea de osteoblastos. Este protocolo fornece um método rápido e sensível para avaliar a absorção de aminoácidos. Nosso protocolo usa aminoácidos radiomarcados para quantificar a absorção de aminoácidos.É um método barato, sensível e rápido que pode ser facilmente modificado para diferentes condições. Este protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a absorção de outros nutrientes radiomarcados como glicose e ácidos graxos em uma variedade de tecidos, bem como células primárias ou transformadas. Para iniciar a placa de ensaio de absorção de aminoácidos cinco vezes 10 para a quarta célula ST2 em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços em meio alfa MEM suplementado com FBS, penicilina e estreptomicina.Placa de poços extras de células para quantificar o número de células por condição para as normalizações. Em seguida, incube as células em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por dois a três dias até ficar confluente. Após incubação aspirar o meio e lavar as células duas vezes com um mililitro de PBS a pH 7,4.Em seguida, aspirar o PBS antes de lavar as células uma vez com um mililitro de Krebs-Ringer HEPES ou KRH. Incubar células com 0,5 mililitros de KRH recém-preparado contendo quatro microcuries por mililitro L34 tritiada glutamina durante cinco minutos. Após a incubação, colete o meio radioativo para dispensar no recipiente de resíduos líquidos.Em seguida, lave as células três vezes com KRH gelado para encerrar a reação. Em seguida, adicione um mililitro de dodecil sulfato de sódio a 1% a cada poço e triture a mistura 10 vezes para lisar e homogeneizar as células. Em seguida, transfira os lisados celulares para um tubo de 1,5 mililitro e esclareça o lisado centrifugando a uma velocidade mínima de 10.000 G por 10 minutos.Transfira o sobrenadante para um frasco para injetáveis de cintilação contendo oito mililitros da solução de cintilação e leia a atividade de rádio e as contagens por minuto utilizando o contador de cintilação. A partir das placas não radioativas restantes das células, tripsinize, ressuspenda e conte as células para estimar o número de células nas culturas radioativas lisadas. Usando um hemacitômetro, conte o número de células por poço não radioativo para cada condição experimental.Para determinar a absorção de aminoácidos, lave a medula do osso antes de pesar o eixo ósseo. Para descelularizar o osso, ferva um úmero em PBS a 100 graus Celsius por 10 minutos. Equilibre os úmeros vivos e cozidos em um mililitro de KRH por 30 minutos na incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius.Em seguida, incube os ossos de controle experimentais e cozidos separadamente em KRH recém-preparado contendo quatro microcaril por mililitro de arginina triciada L234 por até 90 minutos a 37 graus Celsius. Depois de remover o meio radioativo, termine a reação lavando o úmero três vezes com um mililitro de KRH gelado. Transfira cada osso para um tubo de 1,5 mililitro com 500 microlitros de buffer RIPA.Em seguida, homogeneize o úmero e o tampão RIPA cortando 100 vezes com uma tesoura, seguido de sonicação a 35% de amplitude e um segundo de pulso por 10 segundos. Clarificado o lisado por centrifugação durante 10 minutos a 10.000 vezes G à temperatura ambiente. Após a centrifugação, transferir 200 microlitros do sobrenadante para frascos de cintilação contendo oito mililitros da solução de cintilação.Leia a atividade de rádio usando o contador de cintilação. As propriedades cinéticas da captação de glutamina tritiada in vitro L34 e das células ST2 confluentes foram avaliadas na presença ou ausência de ácido metil aminoisobutírico ou lítio. A remoção de sódio levou a uma redução de 90% na absorção de glutamina.A presença de lítio aumentou a absorção de glutamina em 2% em comparação com a condição livre de sódio. Considerando que o ácido metil aminoisobutírico não afetou a absorção de glutamina. As contribuições percentuais de estimação do sistema A, N, L ou ASC e gama mais L indicaram que a maior parte da absorção de glutamina é mediada pelos sistemas ASC e gama mais L.O sistema N é responsável por aproximadamente 2% de absorção de glutamina dependente de sódio.E o sistema A mostrou 0% de contribuição e absorção. A captação de arginina tritiada X-VIVO L34 em úmeros neonatais cozidos e vivos foi analisada ao longo de um período de tempo de duas horas. A absorção de arginina aumentou linearmente ao longo do experimento e do úmero vivo.Os úmeros cozidos não apresentaram aumento dinâmico da captação de arginina no experimento. A análise representativa mostra a captação de arginina normalizada e corrigida. É importante ferver o osso contralateral como um controle ativo.Esta etapa é essencial, pois a matriz óssea pode absorver aminoácidos radioativos, resultando em resultados imprecisos. O protocolo nos permitiu confirmar a cinética de absorção de aminoácidos tanto in vitro quanto in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

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Avaliação longitudinal do rato Perda Hind Limb óssea após lesão medular usando Novel, In vivo Metodologia,

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Medicina

Models of Bone Metastasis

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Modelos de metástase óssea

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

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In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur (Video) | JoVE

Na Vivo Avaliação do desenvolvimento de calo de fratura durante a consolidação óssea em ratos usando um dispositivo de osteossíntese compatível com MRI para o fêmur de Mouse

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection (Video) | JoVE

Tratamento com vancomicina carregado de sulfato de cálcio e osso autógeno em um modelo melhorado coelho de infecção óssea

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation (Video) | JoVE

Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat (Video) | JoVE

Usando um artrômetro de joelho para avaliar as contribuições de tecido-específica para contratura de flexão do joelho em ratos

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain (Video) | JoVE

Análise quantitativa [18F]-NAF-PET-RM para avaliação da rotatividade óssea dinâmica em paciente com dor nas costas Facetogênica

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model (Video) | JoVE

Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...