Name: evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts at JoVE.com

Лаборатория Карнера поддерживается грантами Национального института здравоохранения R01 (AR076325 и AR071967) для C.M.K.

Все мышиные процедуры, описанные здесь, были одобрены комитетами по изучению животных в Юго-западном медицинском центре Техасского университета в Далласе. Радиационный протокол был одобрен Консультативным комитетом по радиационной безопасности в Юго-западном медицинском центре Тех?...

<ol>
	<li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+&#945;-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors.">Inhibition of &#945;-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes &amp; Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li><li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Krebs+to+clinic:+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy.">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li><li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts.">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species.">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li><li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation.">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia.">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).</li><li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells.">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li><li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney.">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li><li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells.">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li><li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression.">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li><li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor.">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457 (2016).</li><li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis.">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li><li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation.">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+sensor+Eif2ak4/GCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice.">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li><li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts.">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li><li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae.">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li><li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins.">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li><li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism.">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li><li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone:+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone.">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li><li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells.">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li><li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transporters+revisited:+New+views+in+health+and+disease.">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li></ol>

Протокол, описанный в настоящем описании, обеспечивает быстрый и чувствительный подход к оценке поглощения аминокислот в ответ на различные экспериментальные перестановки либо in vitro, либо ex vivo. По сравнению с коммерчески доступными наборами (например, Glutamine и Glutamate Determination Kit), ?...

Аминокислоты представляют собой органические соединения, которые содержат амино (-NH2) и карбоксильные (-COOH) функциональные группы с переменной боковой цепью, специфичной для каждой аминокислоты. В целом, аминокислоты хорошо известны как основная составляющая белка. Совсем недавно были выяснены новые применения и функции аминокислот. Например, отдельные аминокислоты могут метаболизироваться с образованием промежуточных метаболитов, которые способствуют биоэнергетике, функционируют как ферментативные кофакторы, регулируют активные формы кислорода или используются для синтеза других аминокислот 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Многие исследования показывают, что метаболизм аминокислот имеет решающее значение для плюрипотентности клеток, пролиферации и дифференцировки в различных контекстах 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Остеобласты являются секреторными клетками, которые производят и секретируют коллаген типа 1, богатый внеклеточным костным матриксом. Чтобы поддерживать высокие темпы синтеза белка во время формирования костей, остеобласты требуют постоянного предложения аминокислот. Чтобы удовлетворить этот спрос, остеобласты должны активно приобретать аминокислоты. В соответствии с этим, недавние исследования показывают важность поглощения аминокислот и метаболизма в активности остеобластов и формировании костей 15,16,17,18,19,20.
Остеобласты приобретают клеточные аминокислоты из трех основных источников: внеклеточной среды, внутриклеточной деградации белка и биосинтеза аминокислот de novo. Этот протокол будет сосредоточен на оценке поглощения аминокислот из внеклеточной среды. Наиболее распространенные методы измерения поглощения аминокислот основаны либо на радиомаркированных (например, 3H или 14C), либо на тяжелых изотопах, меченных (например, 13C) аминокислотах. Тяжелые изотопомерные анализы могут анализировать поглощение и метаболизм аминокислот более тщательно и безопасно, но занимают более много времени, чтобы завершить несколько дней, поскольку требуется день для подготовки и дериватизации образцов и несколько дней для анализа на масс-спектрометре в зависимости от количества образцов21,22. Для сравнения, радиоактивные анализы поглощения аминокислот не информативны о последующем метаболизме, но являются дешевыми и относительно быстрыми, будучи в состоянии быть завершенными в течение 2-3 ч с начала эксперимента23,24. Здесь мы описываем легко модифицируемый базовый протокол, предназначенный для оценки поглощения радиоактивными аминокислотами в культивируемых первичных клетках или клеточных линиях in vitro или отдельных костных стволах ex vivo. Применение этих двух протоколов может быть распространено на другие меченые радиоактивными аминокислотами и другими типами клеток и тканей, связанных с костями.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1123001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>choline chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forceps, scissors, scapels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET551250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z190535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium chloride solution, 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM&#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 15mL</td>
			<td>Biotix</td>
			<td>89511-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonic&#38;Materials</td>
			<td>VCX130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>648311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold (Scintillation solution)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(Methylamino)isobutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2383</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts

Развитие костей и гомеостаза зависит от дифференцировки и активности костеобразующих остеобластов. Дифференцировка остеобластов последовательно характеризуется пролиферацией, за которой следует синтез белка и, в конечном счете, секреция костного матрикса. Пролиферация и синтез белка требуют постоянного поступления аминокислот. Несмотря на это, очень мало известно о потреблении аминокислот в остеобластах. Здесь мы описываем очень чувствительный протокол, который предназначен для измерения потребления аминокислот с использованием радиомаркированных аминокислот. Этот метод оптимизирован для количественной оценки изменений в поглощении аминокислот, которые связаны с пролиферацией или дифференцировкой остеобластов, медикаментозным лечением или лечением фактора роста или различными генетическими манипуляциями. Важно отметить, что этот метод может быть использован взаимозаменяемо для количественной оценки потребления аминокислот в культивируемых клеточных линиях или первичных клетках in vitro или в изолированных костных стволах ex vivo. Наконец, наш метод может быть легко адаптирован для измерения транспорта любой из аминокислот, а также глюкозы и других радиоактивных меток питательных веществ.

Перенос аминокислот регулируется многими мембранно-связанными переносчиками аминокислот, которые были классифицированы в различные транспортные системы на основе многочисленных характеристик, включая специфичность субстрата, кинетику, а также зависимость от ионов и рН25</s...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts at JoVE.com

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

Этот протокол представляет собой радиоактивный анализ поглощения аминокислот, который полезен для оценки потребления аминокислот либо в первичных клетках, либо в изолированных костях.

Оценка потребления аминокислот в культивируемых костных клетках и изолированных костных стержнях

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

Поглощение аминокислот и метаболизм необходимы для конкрементации остеобластов, дифференцировки и формирования костей. Этот протокол обеспечивает быстрый и чувствительный метод оценки поглощения аминокислот. Наш протокол использует радиомаркированные аминокислоты для количественной оценки поглощения аминокислот.Это дешевый, чувствительный и быстрый метод, который можно легко модифицировать для различных условий. Этот протокол может быть легко модифицирован для оценки поглощения других радиоактивных меток питательных веществ, таких как глюкоза и жирные кислоты, в различных тканях, а также первичных или трансформируемых клетках. Для начала забора аминокислот пластина для анализа пять раз от 10 до четвертой клетки ST2 в каждой лунке из 12 лунок тканевой культуральной пластины в альфа-MEM среде, дополненной FBS, пенициллином и стрептомицином.Пластинчатые дополнительные колодцы ячеек для количественной оценки количества ячеек для каждого условия для нормализации. Затем инкубируют клетки в увлажненном инкубаторе клеточной культуры при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение двух-трех дней до слияния. После инкубации аспирируют среду и дважды промывают клетки одним миллилитром PBS при рН 7,4.Затем аспирируйте PBS перед тем, как промыть клетки один раз с помощью одного миллилитра HEPES или KRH Кребса-Рингера. Инкубируйте клетки с 0,5 миллилитрами свежеприготовленного KRH, содержащего четыре микрокюри на миллилитр L34 тритиированной рабочей среды глутамина в течение пяти минут. После инкубации соберите радиоактивную среду для дозирования в контейнер для жидких отходов.Затем промыть клетки три раза ледяным холодом КРГ, чтобы прекратить реакцию. Затем добавьте один миллилитр 1% додецилсульфата натрия в каждую лунку и тритурируйте смесь 10 раз, чтобы лизировать и гомогенизировать клетки. Затем переложите лизаты клеток в 1,5-миллилитровую трубку и осветлите лизат центрифугированием с минимальной скоростью 10 000 G в течение 10 минут.Перенесите супернатант в сцинтилляционный флакон, содержащий восемь миллилитров сцинтилляционного раствора, и считывайте радиоактивность и подсчеты в минуту с помощью сцинтилляционного счетчика. Из оставшихся нерадиоактивных пластин клеток трипсинизируют, повторно суспендируют и подсчитывают клетки, чтобы оценить количество клеток в лизированных радиоактивных культурах. Используя гемацитометр, подсчитайте количество клеток на нерадиоактивную скважину для каждого экспериментального состояния.Чтобы определить поглощение аминокислот, вымывайте костный мозг из кости перед взвешиванием костного стержня. Чтобы децеллюляризировать кость, вскипятите одну плечевую кость в PBS при 100 градусах Цельсия в течение 10 минут. Уравновешивайте как живую, так и кипяченую плечевую кость в одном миллилитре КРГ в течение 30 минут в инкубаторе клеточных культур при 37 градусах Цельсия.Затем инкубируют экспериментальные и вареные контрольные кости отдельно в свежеприготовленном KRH, содержащем четыре микросу на миллилитр L234 трициированного аргинина в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия. После удаления радиоактивной среды прекращают реакцию, промыв плечевую кость три раза одним миллилитром ледяного холодного КРГ. Переведите каждую кость в 1,5-миллилитровую трубку с 500 микролитрами ripa Buffer.Затем гомогенизируйте плечевую кость и буфер RIPA, измельчив ножницами 100 раз, с последующим обработкой ультразвуком с амплитудой 35% и одним секундным импульсом в течение 10 секунд. Осветляют лизат центрифугированием в течение 10 минут при 10 000 g при комнатной температуре. После центрифугирования перенести 200 микролитров супернатанта в сцинтилляционные флаконы, содержащие восемь миллилитров сцинтилляционного раствора.Считывание радиоактивности с помощью сцинтилляционного счетчика. Кинетические свойства in vitro L34 тритиированного поглощения глутамина и сливающихся st2 клеток оценивали в присутствии или отсутствии метиламиномасляной кислоты натрия или лития. Удаление натрия привело к снижению поглощения глютамина на 90%.Присутствие лития увеличивало поглощение глютамина на 2% по сравнению с состоянием без натрия. В то время как метиламиносомасляная кислота не влияла на поглощение глютамина. Оценка процентных вкладов системы A, N, L или ASC и гамма плюс L показала, что большая часть поглощения глутамина опосредована системами ASC и гамма плюс L.Система N отвечает примерно за 2%-зависимое поглощение глутамина натрия.А система А показала 0% вклада и поглощения. Поглощение тритиированного аргинина X-VIVO L34 в кипяченой и живой неонатальной плечевой кости анализировалось в течение двух часов. Поглощение аргинина увеличивалось линейно на протяжении всего эксперимента и живой плечевой кости.Кипяченая плечевая кишка не проявляла динамического увеличения поглощения аргинина в эксперименте. Репрезентативный анализ показывает нормализованное и скорректированное поглощение аргинина. Важно кипятить контралатеральную кость в качестве активного контроля.Этот шаг имеет важное значение, так как костный матрикс может поглощать радиоактивные аминокислоты, что приводит к неточным результатам. Протокол позволил нам подтвердить кинетику поглощения аминокислот как in vitro, так и in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Продольные Оценка Мышь Задние потери костной массы конечности после Травма спинного мозга с использованием новых, В естественных условиях Методология

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Models of Bone Metastasis

Модели костных метастазов

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Доклинические Оценка тирозинкиназы ингибиторов для лечения острого лейкоза

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Костном мозге бедра Стремление в живых мышей

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

В естественных изображений и слежения за технеция-99m меченого костного мозга мезенхимальных стволовых клеток в Коневодство Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

Лечение с ванкомицин загружен сульфат кальция и аутогенных кости в модели улучшения кролик кость инфекции

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

База данных руководствуясь проточной цитометрии для оценки созревания миелоидных клеток костного мозга

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat

Для оценки ткани конкретных взносов сгибательная контрактура коленного сустава в крысах с использованием колена Arthrometer

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Количественный :18F-Naf-PET-МРТ Анализ для оценки динамического оборота костей у пациента с facetogenic Низкая боль в спине

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...