Name: evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00
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El laboratorio Karner cuenta con el apoyo de subvenciones R01 del Instituto Nacional de Salud (AR076325 y AR071967) a C.M.K.

Todos los procedimientos con ratones descritos en este documento fueron aprobados por los Comités de Estudios Animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas. El protocolo de radiación fue aprobado por el Comité Asesor de Seguridad Radiológica del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas.
1. Captación de aminoácidos en las células (Protocolo I)
<ol><li>Placa 5 x 104 células ST2 en cada pocillo de una pl...

<ol>
	<li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+&#945;-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors.">Inhibition of &#945;-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes &amp; Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li><li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Krebs+to+clinic:+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy.">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li><li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts.">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species.">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li><li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation.">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia.">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).</li><li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells.">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li><li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney.">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li><li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells.">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li><li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression.">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li><li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor.">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457 (2016).</li><li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis.">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li><li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells.">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li><li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation.">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li><li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling.">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+sensor+Eif2ak4/GCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice.">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li><li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts.">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li><li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae.">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li><li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins.">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li><li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism.">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li><li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone:+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone.">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li><li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells.">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li><li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+transporters+revisited:+New+views+in+health+and+disease.">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li></ol>

El protocolo descrito en este documento proporciona un enfoque rápido y sensible para evaluar la absorción de aminoácidos en respuesta a diversas permutaciones experimentales, ya sea in vitro o ex vivo. En comparación con los kits disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de determinación de glutamina y glutamato), este método es mucho más sensible, más rápido y menos laborioso16,17,25. En nuestr...

Los aminoácidos son compuestos orgánicos que contienen un grupo funcional amino (-NH2) y carboxilo (-COOH) con una cadena lateral variable que es específica para cada aminoácido. En general, los aminoácidos son bien conocidos como el constituyente básico de la proteína. Más recientemente, se han dilucidado nuevos usos y funciones de los aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos individuales pueden metabolizarse para generar metabolitos intermedios que contribuyen a la bioenergética, funcionan como cofactores enzimáticos, regulan las especies reactivas de oxígeno o se utilizan para sintetizar otros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Muchos estudios demuestran que el metabolismo de los aminoácidos es crítico para la pluripotencia, proliferación y diferenciación celular en diversos contextos 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Los osteoblastos son células secretoras que producen y secretan la matriz ósea extracelular rica en colágeno tipo 1. Para mantener altas tasas de síntesis de proteínas durante la formación ósea, los osteoblastos exigen un suministro constante de aminoácidos. Para satisfacer esta demanda, los osteoblastos deben adquirir activamente aminoácidos. De acuerdo con esto, estudios recientes revelan la importancia de la absorción de aminoácidos y el metabolismo en la actividad de los osteoblastos y la formación ósea 15,16,17,18,19,20.
Los osteoblastos adquieren aminoácidos celulares de tres fuentes principales: medio extracelular, degradación de proteínas intracelulares y biosíntesis de aminoácidos de novo. Este protocolo se centrará en la evaluación de la absorción de aminoácidos del entorno extracelular. Los métodos más comunes para medir la absorción de aminoácidos se basan en aminoácidos radiomarcados (por ejemplo, 3H o 14C) o marcados con isótopos pesados (por ejemplo, 13C). Los ensayos de isotopómeros pesados pueden analizar la absorción y el metabolismo de aminoácidos de manera más exhaustiva y segura, pero requieren más tiempo y tardan varios días en completarse, ya que se tarda un día en preparar y derivar muestras y varios días en analizarlas en el espectrómetro de masas dependiendo del número de muestras21,22. En comparación, los ensayos de captación de aminoácidos radiomarcados no son informativos sobre el metabolismo posterior, pero son baratos y relativamente rápidos, pudiendo completarse dentro de las 2-3 h desde el inicio del experimento23,24. Aquí, describimos un protocolo básico fácilmente modificable diseñado para evaluar la absorción de aminoácidos radiomarcados en células primarias cultivadas o líneas celulares in vitro o ejes óseos individuales ex vivo. La aplicación de estos dos protocolos puede extenderse a otros aminoácidos radiomarcados y otros tipos de células y tejidos asociados al hueso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1123001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>choline chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forceps, scissors, scapels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET551250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z190535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium chloride solution, 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM&#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 15mL</td>
			<td>Biotix</td>
			<td>89511-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonic&#38;Materials</td>
			<td>VCX130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>648311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold (Scintillation solution)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(Methylamino)isobutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2383</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts

El desarrollo óseo y la homeostasis dependen de la diferenciación y la actividad de los osteoblastos formadores de hueso. La diferenciación de osteoblastos se caracteriza secuencialmente por la proliferación seguida de la síntesis de proteínas y, en última instancia, la secreción de la matriz ósea. La proliferación y la síntesis de proteínas requieren un suministro constante de aminoácidos. A pesar de esto, se sabe muy poco sobre el consumo de aminoácidos en los osteoblastos. Aquí describimos un protocolo muy sensible que está diseñado para medir el consumo de aminoácidos utilizando aminoácidos radiomarcados. Este método está optimizado para cuantificar los cambios en la absorción de aminoácidos que están asociados con la proliferación o diferenciación de osteoblastos, tratamientos con medicamentos o factores de crecimiento, o diversas manipulaciones genéticas. Es importante destacar que este método se puede utilizar indistintamente para cuantificar el consumo de aminoácidos en líneas celulares cultivadas o células primarias in vitro o en ejes óseos aislados ex vivo. Finalmente, nuestro método se puede adaptar fácilmente para medir el transporte de cualquiera de los aminoácidos, así como la glucosa y otros nutrientes radiomarcados.

El transporte de aminoácidos está regulado por muchos transportadores de aminoácidos unidos a la membrana que han sido categorizados en distintos sistemas de transporte basados en numerosas características, incluyendo la especificidad del sustrato, la cinética, así como la dependencia de iones y pH25. Por ejemplo, la absorción de glutamina puede estar mediada por los sistemas de transporte dependientes de Na+ A, ASC, γ+L y N o el Sistema L independiente de Na+. Los si...

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Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

Este protocolo presenta un ensayo de captación de aminoácidos radiomarcado, que es útil para evaluar el consumo de aminoácidos en células primarias o en huesos aislados.

Evaluación del consumo de aminoácidos en células óseas cultivadas y tallos óseos aislados

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

La absorción de aminoácidos y el metabolismo son esenciales para la especificación, diferenciación y formación ósea de los osteoblastos. Este protocolo proporciona un método rápido y sensible para evaluar la absorción de aminoácidos. Nuestro protocolo utiliza aminoácidos radiomarcados para cuantificar la absorción de aminoácidos.Es un método barato, sensible y rápido que se puede modificar fácilmente para diferentes condiciones. Este protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la absorción de otros nutrientes radiomarcados como la glucosa y los ácidos grasos en una variedad de tejidos, así como en células primarias o transformadas. Para comenzar el ensayo de captación de aminoácidos se realiza cinco veces 10 a la cuarta células ST2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos en medio alfa MEM suplementado con FBS, penicilina y estreptomicina.Placa pozos adicionales de células para cuantificar el número de células por condición para las normalizaciones. A continuación, incube las células en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante dos o tres días hasta que confluya. Después de la incubación, aspirar el medio y lavar las células dos veces con un mililitro de PBS a pH 7.4.Luego aspire el PBS antes de lavar las células una vez con un mililitro HEPES de Krebs-Ringer o KRH. Incubar células con 0,5 mililitros de KRH recién preparado que contiene cuatro microcuries por mililitro L34 de glutamina tritiada durante cinco minutos. Después de la incubación, recoger el medio radiactivo para dispensar en el contenedor de residuos líquidos.Luego lave las células tres veces con KRH helado para terminar la reacción. A continuación, agregue un mililitro de dodecil sulfato de sodio al 1% a cada pocillo y triture la mezcla 10 veces para lisar y homogeneizar las células. Luego transfiera los lisados celulares a un tubo de 1.5 mililitros y aclare el lisado centrifugando a una velocidad mínima de 10, 000 G durante 10 minutos.Transfiera el sobrenadante a un vial de centelleo que contenga ocho mililitros de la solución de centelleo y lea la actividad de radio y los recuentos por minuto utilizando el contador de centelleo. A partir de las placas no radiactivas restantes de las células, tripsinizar, resuspender y contar las células para estimar el número de células en los cultivos radiactivos lisados. Usando un hemacitómetro, cuente el número de células por pocillo no radiactivo para cada condición experimental.Para determinar la absorción de aminoácidos, enjuague la médula del hueso antes de pesar el eje óseo. Para descelularizar el hueso, hierva un húmero en PBS a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Equilibrar los húmeros vivos y hervidos en un mililitro de KRH durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados.A continuación, incube los huesos de control experimentales y hervidos por separado en KRH recién preparado que contiene cuatro microcurries por mililitro de arginina triciada L234 durante un máximo de 90 minutos a 37 grados centígrados. Después de eliminar el medio radiactivo, termine la reacción lavando el húmero tres veces con un mililitro de KRH helado. Transfiera cada hueso a un tubo de 1,5 mililitros con 500 microlitros de tampón RIPA.Luego homogeneice el húmero y el tampón RIPA cortando 100 veces con tijeras, seguido de la sonicación al 35% de amplitud y un segundo pulso durante 10 segundos. Clarificó el lisado por centrifugación durante 10 minutos a 10, 000 veces G a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, transfiera 200 microlitros del sobrenadante a viales de centelleo que contengan ocho mililitros de la solución de centelleo.Lea la actividad de radio usando el contador de centelleo. Se evaluaron las propiedades cinéticas de la captación in vitro de glutamina tritiada L34 y las células ST2 confluentes en presencia o ausencia de ácido metil amino isobutírico de sodio o litio. La eliminación de sodio condujo a una reducción del 90% en la absorción de glutamina.La presencia de litio aumentó la absorción de glutamina en un 2% en comparación con la condición libre de sodio. Mientras que el ácido metil amino isobutírico no afectó la absorción de glutamina. Las contribuciones porcentuales estimadas del sistema A, N, L o ASC y gamma más L indicaron que la mayor parte de la absorción de glutamina está mediada por los sistemas ASC y gamma más L. El sistema N es responsable de aproximadamente un 2% de absorción de glutamina dependiente de sodio.Y el sistema A mostró 0% de contribución y aceptación. La captación de arginina tritiada de X-VIVO L34 en húmeros neonatales hervidos y vivos se analizó en un transcurso de dos horas. La absorción de arginina aumentó linealmente a lo largo del experimento y el húmero vivo.El húmero hervido no exhibió un aumento dinámico de la absorción de arginina en el experimento. El análisis representativo muestra la absorción de arginina normalizada y corregida. Es importante hervir el hueso contralateral como control activo.Este paso es esencial ya que la matriz ósea puede absorber aminoácidos radiactivos, lo que resulta en resultados inexactos. El protocolo nos ha permitido confirmar la cinética de captación de aminoácidos tanto in vitro como in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Evaluación longitudinal de ratón posteriores pérdida de masa ósea del miembro después de una lesión de la médula espinal utilizando Novel, En vivo Metodología

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Investigación

Medicina

Models of Bone Metastasis

Los modelos de metástasis en los huesos

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

En vivo de imágenes y Seguimiento de tecnecio-99m Etiquetada células madre mesenquimales de médula ósea en Equinos tendinopatía

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

Tratamiento con vancomicina cargado sulfato de calcio y hueso autógeno en un modelo de conejo mayor de infección ósea

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat

Con una rodilla Arthrometer para evaluar las contribuciones específicas de tejido a contractura de flexión de rodilla en la rata

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Cuantitativo [18F]-Naf-PET-MRI Análisis para la evaluación de la rotación ósea dinámica en un paciente con dolor de espalda baja facetogénico

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis