Name: automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) og Infectious Diseases Society of America finansiering til DMC. Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet. Vi takker medlemmerne af Czyz Lab for korrekturlæsning af manuskriptet. Tegneseriefigurer blev genereret ved hjælp af BioRender betalt licens.

<ol>
	<li>Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+the+role+of+protein+misfolding+in+neurodegenerative+diseases.">Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).</li><li>Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+as+a+modifier+of+neurodegenerative+disease+risk.">The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk.</a> Cell Host &amp; Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).</li><li>Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Our+gut+microbiome:+The+evolving+inner+self.">Our gut microbiome: The evolving inner self.</a> Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).</li><li>Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+understanding+the+role+of+the+gut+microbiota+in+brain+health+and+disease.">Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7 (1), 13023 (2016).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1003466 (2013).</li><li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network.">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Walker, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+with+human+enteric+bacterial+pathogens+leads+to+proteostasis+disruption+that+is+rescued+by+butyrate.">Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate.</a> PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510 (2021).</li><li>Goya, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Bacillus+subtilis+protects+against+&#945;-Synuclein+aggregation+in+C.+elegans.">Probiotic Bacillus subtilis protects against &#945;-Synuclein aggregation in C. elegans.</a> Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).</li><li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans.">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337 (2017).</li><li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins.">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).</li><li>Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+the+heat+shock+response+modulate+protein+homeostasis+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine+during+infection.">Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WorMachine:+machine+learning-based+phenotypic+analysis+tool+for+worms.">WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms.</a> BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 482 (2008).</li><li>Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-verified+two-allele+transposon+mutant+library+for+Pseudomona+aeruginosa+PA01.">Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).</li><li>Schulenburg, H., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+pathogen+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li><li>Haldimann, P., Muriset, M., V&#237;gh, L., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+hydroxylamine+derivative+ng-094+suppresses+polyglutamine+protein+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans.">The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).</li><li>Shinn-Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wrapping+culture+plates+with+Parafilm+M&#174;+increases+Caenorhabditis+elegans+growth.">Wrapping culture plates with Parafilm M&#174; increases Caenorhabditis elegans growth.</a> BMC Research Notes. 12 (1), (2019).</li><li>Alexander-Floyd, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+cell+type-dependent+effects+of+autophagy+on+polyglutamine+aggregation+revealed+by+natural+genetic+variation+in+C.+elegans.">Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans.</a> BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery.">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li></ol>

Forfatterne har erklæret, at der ikke findes interessekonflikter.

Den beskrevne protokol skitserer procedurer for C. elegans dyrkning, billeddannelse og billedbehandling, der inkorporerer CellProfiler, en open source billedanalysesoftware. De repræsentative resultater viser reproducerbarhed, reduktion af bias og skalerbarhed. Denne standardiserede procedure vil forbedre screeningsstrategier, der anvendes med store bakterielle, genomiske eller lægemiddelbiblioteker. Mens der findes andre automatiserede C. elegans-metoder til objektdetektion, tilbyder den beskrevne teknik en standardiseret pipeline med højere kapacitet, der integrerer dyrkning, billedoptagelse og analyse.
Flere variationer af ormedyrkning måtte testes for at optimere protokollen beskrevet heri. Oprindeligt blev orme overført til prøvebakterier umiddelbart efter alderssynkronisering (L1-trin). En sådan tilgang resulterede imidlertid i en population af orme med varierende størrelser, selv blandt orme inden for samme brønd. C. eleganer er kendt for patogenundgåelse19, hvilket kunne have bidraget til den observerede variation i størrelse og i sidste ende påvirke downstream imaging-ormdetektion, især. For at eliminere en sådan variabilitet blev hele NGM-området i hver brønd dækket af testbakterier. Desuden blev orme fodret med E. coli OP50 og fik lov til fuldt ud at udvikle sig til unge voksne i 48 timer ved 25 °C. At tillade orme at nå voksenalderen på E. coli OP50, før de overføres til testbakterier, resulterede i mere ensartet kropsstørrelse. Derudover blev overbelægning og hurtig udtømning af mad af afkom elimineret ved at supplere NGM-agar med FUDR. Implementeringen af FUDR fjernede afkom og forbedrede automatiseret ormidentifikation, som blev skjult af afkom, der blandede sig med forældrepopulationen. Det er dog vigtigt at være forsigtig og anvende passende kontroller, når du bruger FUDR, da forbindelsen vides at påvirke C. elegans proteostase og levetid20,21. Under de betingelser, der er beskrevet i denne protokol, påvirkede FUDR ikke intestinal polyQ-aggregering (supplerende figur 5); derfor var dens anvendelse egnet og gavnlig for den beskrevne metode.
Frysning af prøver før billeddannelse viste sig at være et kritisk skridt i den vellykkede anvendelse af rørledningen. De samlede tællinger før frysning var signifikant højere end manuelle tællinger (figur 3B). At holde orme ved -20 °C i 18-48 timer før billeddannelse reducerede baggrundsfluorescens og i sidste ende forbedret samlet detektion (figur 3A). Virkningerne af frysning på aggregeret detektion er kun blevet undersøgt for polyQ og bør ikke generaliseres til andre modeller uden yderligere undersøgelse af sådanne virkninger.
På trods af at alle betingelserne blev holdt de samme, blev det observeret, at det gennemsnitlige antal aggregater pr. orm kunne variere mellem forskellige kørsler, mens forholdet mellem antallet af aggregater hos dyr koloniseret med OP50 versus MPAO1 forblev konsistent (figur 6, supplerende figur 2, supplerende figur 5). Det er derfor vigtigt altid at medtage E. coli OP50-kontrol eller yderligere passende referencekontroller i alle løb. En sådan variation i de samlede tal mellem forsøg kan påvirkes af miljøforhold (temperatur, fugtighed)22,23 eller genetisk baggrund8. Faktisk blev det observeret, at tarmfluorescens efter langvarig kultur faldt drastisk eller var helt tabt, hvilket krævede optøning af en ny stamme fra frossen bestand. Det observerede fald i fluorescens kan være et resultat af genetiske ændringer, der undertrykker giftige transgener, såsom dem, der udtrykker polyQ. Ikke desto mindre understreger den ekstraordinære reproducerbarhed af de observerede resultater mellem forskellige eksperimenter (supplerende figur 2), mellem biologiske replikater (figur 5) og inden for samme prøve (supplerende figur 3) styrken af denne tilgang.
Talrige rapporter har anvendt intestinal polyQ til at studere proteostase 9,11,12,13,24,25. En direkte sammenligning mellem resultaterne kan imidlertid ikke foretages på grund af variabilitet mellem eksperimentelle tilgange og udlæsningsmetoder. Ikke desto mindre rekapituleres nogle få resultater fra tidligere offentliggjorte data ved den automatiserede kvantificering, der er beskrevet heri, herunder bakteriel induktion af aggregering 9,13 og et sammenligneligt antal aggregater11. Samlet set tilbyder den beskrevne rørledning et værdifuldt værktøj til at studere proteostase.
Den metode, der er beskrevet heri, har nogle iboende udfordringer. For eksempel kræver det tilstrækkelig tid til at mestre alle komponenter i denne protokol, hvilket især gælder for afsnit 8 i protokollen, hvilket kræver kendskab til analysen for at afgøre, om de erhvervede billeder er egnede til rørledningsanalyse. Afvigelser fra de billedoptagelsesindstillinger, der bruges i denne protokol, er mulige; dog vil ændring af indstillingerne og ormtræningssættet sandsynligvis være påkrævet. Denne rørledning kan skelne mellem aggregater i forskellige størrelser og dem, der rører ved, hvilket begrænser "blanding" af aggregater og i sidste ende øger detektionsfølsomheden. Der kan dog opstå problemer, når man forsøger at identificere store aggregater, der overskrider det accepterede størrelsesinterval, da en udvidelse af den øvre størrelsestærskel kan føre til fejl forårsaget af dårlig identifikation, f.eks. manglende evne til at skelne mellem aggregater, der rører ved hinanden. En balance mellem nøjagtighed, størrelse og intensitet skal findes inden billedanalyse. Effektiviteten af aggregeret identifikation kan forbedres yderligere ved at inkorporere maskinindlæring for at skabe et neuralt netværk, der er i stand til at forbedre aggregeret detektion. Sådanne forbedringer undersøges i øjeblikket og vil i høj grad hjælpe med at løse aktuelle problemer såsom påvisning af aggregater, der ligger på forskellige fokusplaner, eller som har unormale former.
En bemærkelsesværdig svaghed ved den beskrevne metode er variationen i automatiserede aggregerede tællinger, da de ikke altid rekapituleres ved manuelle tællinger i orme fodret med forskellige bakteriestammer. For eksempel, baseret på automatiserede tællinger, havde orme fodret med P. aeruginosa mutant 53 (M53) signifikant færre aggregater sammenlignet med vildtypestammen (MPAO1) (figur 7); Bekræftelsen af hittet viste imidlertid ingen signifikant forskel (supplerende figur 4). Generelt har lægemiddelskærme med høj kapacitet en høj grad af falsk-positiv hitdetektion, og den beskrevne metode er ingen undtagelse26. Det er således en kritisk del af protokollen at bekræfte alle potentielle hits.
Mens denne protokol blev optimeret til at passe til en screeningsstrategi for at identificere bakterier, der påvirker værtsproteostase, kan hvert trin ændres yderligere for at teste effekten af genomiske RNAi-biblioteker, små molekyler eller andre tilstande. Yderligere ændringer kan foretages på hvert trin for at passe til kravene i en specifik screeningstrategi. Desuden giver denne teknik et niveau af fleksibilitet, der giver mulighed for optimering af hvert trin, så det passer til en bestemt model. For eksempel kan denne tilgang udvides til polyQ-aggregering i andre væv eller ekstraktion af andre funktioner, der er påvist i billeder, såsom overvågning af genekspression ved hjælp af inducerbare fluorescerende reportere (f.eks. Varmechokgener), vurdering af subcellulær lokalisering af proteiner (f.eks. Nuklear lokalisering af DAF-16), undersøgelse af aggregering i andre sygdomsmodeller (Aβ1-42, α-synuclein, TDP-43 osv.) eller vurdering af fysiologiske fænotyper, såsom ormstørrelse.

Aldersafhængige neurodegenerative proteinkonformationssygdomme (PCD'er) såsom Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sygdomme eller amyotrofisk lateral sklerose er kendetegnet ved proteinfejlfoldning, der fører til aggregering, celledød og vævsdegeneration1. Mens protein misfolding anerkendes som synderen, er etiologien af disse sygdomme ikke klar. Som sådan er udviklingen af effektive terapier blevet hindret af manglende viden om de faktorer og tilstande, der bidrager til sygdomsdebut og progression. Nylige undersøgelser tyder på, at ændringer i mikrobiomet påvirker begyndelsen, progressionen og sværhedsgraden af PCD'er 2,3,4. Kompleksiteten af det menneskelige eller endda murinmikrobiom gør det imidlertid vanskeligt at gennemføre undersøgelser, der ville afsløre mikrobernes nøjagtige indflydelse på deres vært. Derfor bruges enklere organismer, såsom Caenorhabditis elegans, ofte som et opdagelsesværktøj 5,6,7,8. Nylige undersøgelser har anvendt C. elegans til at undersøge virkningen af bakterier på værtsproteostase og sygdomspatogenese 9,10. Bakteriel kolonisering, hormese og genomiske ændringer er blandt eksemplariske tilstande, der påvirker aggregeringen af polyglutamin (polyQ) kanaler 9,11,12. Derudover udviser disse misfoldede proteinklynger polyQ-længde- og aldersafhængig akkumulering inden for værten og er forbundet med nedsat bevægelighed 9,13. Den relativt enkle tilgang til kvantificering af fluorescerende mærket puncta kan generere vigtige data om forhold, faktorer eller lægemidler, der påvirker proteinfoldning og aggregering.
Selvom kvantificering af fluorescerende puncta har vist sig at være en pålidelig og relativt enkel procedure, er udfordringen fortsat at udvikle en protokol, der letter storstilet screening af forbindelser, bakterier eller tilstande, der påvirker proteinaggregering. Begrebet automatiseret C. elegans billedbehandling og punktkvantificering er ikke helt nyt, da der er udviklet en række praktiske støtteværktøjer 14,15. Integrationen af dyrkning, billedoptagelse og en behandlingspipeline er imidlertid afgørende for at eliminere variation i resultater og give mulighed for skærme med højere kapacitet.
Som sådan er hensigten med dette manuskript at standardisere den procedure, der anvendes til at kvantificere polyQ-aggregering i C. elegans som en proxy til påvisning af ændringer i proteostase. Denne opgave blev udført ved at anvende CellProfiler, en open source billedanalysesoftware16 , der er i stand til automatiseret orm og aggregeret identifikation, og er integreret i en større protokol til dyrkning af orme, erhvervelse af billeder og behandling af data.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#24-282</td>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipettes</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#12-104</td>
			<td>Plastic pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes, Racked</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#28-101</td>
			<td>Conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D2235100MG</td>
			<td>FUDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet Pro Pipette Controller</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>91-600RB</td>
			<td>Pipette gun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#BP1423-2</td>
			<td>Granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Graphical figure generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (Regular)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>Bar# 044600324111, Splash-less Bleach</td>
			<td>4.5% sodium hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM140, Q35::YFP</td>
			<td>Muscle polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM738, Q44::YFP</td>
			<td>Intestinal polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#C79-500</td>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#ICN10138201</td>
			<td>Cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating Water Bath Head</td>
			<td>Lauda</td>
			<td>26LE</td>
			<td>Lauda E 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>8114931</td>
			<td>Fluorescent light control and emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL Culture Tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td>Culture tubes, 17 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>E. coli control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450910</td>
			<td>Eyepiece set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Set ET GFP - MZ10F</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450588</td>
			<td>Filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v9.2.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Incubator IMP180</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51031562</td>
			<td>Refrigerated incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4000</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1192-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K5 Camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td>Stereomicroscope camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2P04</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#P285-3</td>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Imaging Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ10 F Optics Carrier</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450103</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#0215522805</td>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (Lennox)</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>Cat#11-125</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-49S</td>
			<td>Stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14491</td>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>8205</td>
			<td>Single frosted microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S373-500</td>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S671-500</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S318-3</td>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Achromat, f = 100 mm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10411597</td>
			<td>Objective microscope lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat#32-107G</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa Mutant Library</td>
			<td>Manoil Lab (University of Washington)</td>
			<td></td>
			<td>P. aeruginosa mutant library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-102</td>
			<td>Used for worm growth and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinocular Tube 100% M-series</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>ThermoFisher, Difco</td>
			<td>Cat#211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-400 Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat#75003181</td>
			<td>Swing bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Driven Filter System</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#25-227</td>
			<td>500 mL, PES Membrane, .22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Objective with C-Mount</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447367</td>
			<td>0.63x camera adapter tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans

En stigning i forekomsten af neurodegenerative proteinkonformationssygdomme (PCD'er) har skabt stor interesse for dette emne gennem årene. Denne øgede opmærksomhed har krævet diversificering og forbedring af dyremodeller, der er i stand til at reproducere sygdomsfænotyper observeret hos mennesker med PCD'er. Selvom murine-modeller har vist sig uvurderlige, er de dyre og er forbundet med besværlige metoder med lav kapacitet. Brug af Caenorhabditis elegans nematodemodellen til undersøgelse af PCD'er er blevet begrundet i dens relative lette vedligeholdelse, lave omkostninger og hurtige generationstid, hvilket giver mulighed for applikationer med høj kapacitet. Derudover gør høj bevarelse mellem C. elegans og humane genomer denne model til et uvurderligt opdagelsesværktøj. Nematoder, der udtrykker fluorescerende mærkede vævsspecifikke polyglutamin (polyQ) kanaler udviser alders- og polyQ-længdeafhængig aggregering karakteriseret ved fluorescerende foci. Sådanne journalister anvendes ofte som proxyer til at overvåge ændringer i proteostase på tværs af væv. Manuel aggregeret kvantificering er tidskrævende og begrænser eksperimentel gennemstrømning. Desuden kan manuel focikvantificering introducere bias, da aggregeret identifikation kan være meget subjektiv. Heri blev en protokol bestående af ormedyrkning, billedoptagelse og databehandling standardiseret til at understøtte aggregeret kvantificering med høj kapacitet ved hjælp af C. elegans , der udtrykker tarmspecifik polyQ. Ved at implementere en C. elegans-baseret billedbehandlingspipeline ved hjælp af CellProfiler, en billedanalysesoftware, er denne metode optimeret til at adskille og identificere individuelle orme og opregne deres respektive aggregater. Selvom begrebet automatisering ikke er helt unikt, er behovet for at standardisere sådanne procedurer for reproducerbarhed, eliminering af bias fra manuel tælling og øge gennemstrømningen høj. Det forventes, at disse metoder drastisk kan forenkle screeningsprocessen for store bakterielle, genomiske eller lægemiddelbiblioteker ved hjælp af C. elegans-modellen .

Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Følgende protokol beskriver udviklingen og optimeringen af en arbejdsgang med høj kapacitet til ormedyrkning, fluorescensbilleddannelse og automatiseret billedbehandling for at kvantificere polyglutaminaggregater som en vurdering af ændringer i proteostase.

Automatisering af aggregeret kvantificering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

En simpel tilgang blev taget til at overvåge ændringer i proteostase ved at vurdere polyglutaminaggregering og tilvejebringe en ramme, der kan bruges til applikationer med høj kapacitet. At score en fænotype som antallet af aggregater af jeg kan blive subjektiv. Automatisering af aggregeret tælling giver os mulighed for at eliminere sådan bias, øge gennemstrømning og reproducerbarhed.Denne metode hjælper med at identificere bakterielle gener, der bidrager til værtsproteostaseforstyrrelse. At forstå individuelle bakterielle geners bidrag vil hjælpe os med at forstå dens implikation i patogenesen af sygdomme som Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons. Begynd med at fjerne pladerne indeholdende orme fra fryseren og lad dem tø op ved stuetemperatur.Tør derefter overskydende kondens af, og fjern låget inden billeddannelse. Brug mikroskopindstillingerne med eksponeringstid 500 millisekunder, forstørrelse på 40 X med 0,63 X kameraadapter og GFP-intensitet indstillet til 100% under billedoptagelse. Juster nu de transmitterede lyskontroller, indtil ormene ser stærkt oplyste ud i forhold til den mørke baggrund, så du undgår overeksponering.Skift ormenes positioner i brønden for at forhindre overdreven klumpning ved at bruge en 10 mikroliter pipettespids til forsigtigt at skubbe orme i den ønskede position. Indstil kanalen til GFP-filter for at etablere et fokusplan for begge billeder. Tag et lyst feltbillede.Tag et tilsvarende fluorescensbillede uden at forstyrre pladen eller ændre mikroskopets fokus. For at vurdere billederne skal du først downloade CellProfiler. Åbn softwaren, og træk og slip billederne af interesse i billedfeltet.Klik på billederne på fillisten for at åbne dem. Vælg forstørrelsesglasset for at fremhæve et område af interesse og pilikonet for at måle længden af både orme og aggregater. Hold markøren over det ønskede objekt for at bestemme dets intensitetsværdi, som kan ses på den nederste del af skærmen.For at bruge CellProfiler-billedanalysepipelinen skal du navngive billedparene korrekt som beskrevet i tekstmanuskriptet efter download af CellProfiler fra det officielle websted. Download pipelinen, og upload den til CellProfiler ved at vælge fil, import og pipeline fra fil. Vælg modulet ufiltrerede orme for at åbne dets indstillinger for at indlæse et træningssæt, der bruges til at identificere orme i modulet ufiltrerede orme.Identificer derefter filnavnet på træningssættet. Vælg ikonet upload fil og upload også den supplerende fil. Upload billeder ved at vælge billedmodulet i øverste venstre hjørne.Og træk og slip derefter korrekt navngivne billeder. Før du analyserer billederne, skal du vælge den ønskede outputmappe, der skal bruges til at gemme resultaterne ved at klikke på knappen outputindstillinger i nederste venstre hjørne af programmet. Vælg derefter mappeikonet til højre for standardoutputtet for at vælge den ønskede outputplacering.Vælg ikonet analysér billeder for at starte billedanalysen. Hvis analysen tager for lang tid at fuldføre og sidder fast ved at behandle et enkelt billede, skal du afbryde kørslen og identificere det ubehandlede billede ved at sortere gennem outputmappen og bemærke, hvilket billednavn der ikke findes. Efter fuldstændig analyse organiserer softwaren resultaterne i et Excel-regneark, der indeholder individuelle orme i kolonne N, og det respektive antal aggregater i kolonne K.Download metadataarrangøren for bekvemt at organisere data fra output CSV-filen fra CellProfiler.For Windows OS skal du finde den downloadede fil og udpakke den til det ønskede sted. Find og åbn den udpakkede mappe med navnet gui_Windowsos_64x. Og start applikationen ved at klikke på GUI-applikationsikonet.En prompt kan åbne en anmodning om tilladelse til at køre. Vælg mere info, og klik derefter på kør alligevel. Metadataarrangøren er nu klar til at trække og slippe CellProfiler-output CSV-filer.For Mac OS skal du finde den downloadede fil og udpakke filmetadataarrangørapplikationsfilen. Åbn den udpakkede mappe, der findes i downloads. Højreklik på GUI-applikationen, og vælg åben.Der vises en prompt, der beder om tilladelse til at åbne på grund af manglen på en officiel licens. Vælg åben. Når din metadataarrangørapplikation er åben i det respektive operativsystem, skal du klikke på upload dine filer her eller trække og slippe de ønskede CellProfiler CSV-filer.Klik på knappen Organiser, som bringer brugeren til en ny skærm med en downloadfilknap. Klik på knappen, og vælg det ønskede sted for at gemme outputfilen. Outputfilen vises som det originale filnavn med _organized udvidelse tilføjet til filnavnet.I nærværelse af FUDR havde orme, der blev fodret med forskellige bakterier, en mere ensartet kropsstørrelse, som muliggjorde mere ensartet og nøjagtig ormdetektion og dermed løste problemet med overbelægning. Frysning af ormene forbedrede polyQ-aggregatedetektionen ved at eliminere baggrundsfluorescensen samt nøjagtigheden af automatiseret tælling, der kan sammenlignes med manuel tælling. Inverteret brightfield-belysning blev brugt til at detektere hele C.elegans- og GFP-kanalen til afbildning af polyQ YFP-aggregater.Ormregistrering, udfiltring og samlet kvantificering for hver orm blev udført ved at anvende en optimeret CellProfiler-billedbehandlingspipeline, som gør det muligt at opnå antallet af aggregater pr. individuel orm. Forskellen mellem effektiviteten af automatiseret aggregeret kvantificering og ved hjælp af CellProfiler-rørledningen var minimal, hvilket indikerer, at den automatiserede metode kan anvendes på skærme i stor skala. Ud af 90 testede bakteriestammer viste kolonisering af C.elegans tarm med en kandidat et signifikant fald i antallet af aggregater.Bekræftelseseksperimenterne ved manuel tælling afslørede, at ingen af mutanterne, inklusive den, der signifikant reducerede antallet af aggregater, påvirkede polyQ-aggregeringen. Forskere, der beslutter at bruge denne ramme, bør forstå, at de skitserede trin ikke er absolutte. Modifikation og en grundlæggende forståelse af, hvordan man manipulerer CellProfiler, er afgørende for succes.Yderligere biokemiske tilgange såsom western blotting kan bruges til at bekræfte polyQ-aggregering.

Research

JoVE Journal

Biology

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Udvinding og Analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation og Kvantificering af telomer og repetitive sekvenser Brug Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH) med PNA-prober i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrkning af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Kombinerede nukleotid og Protein ekstraktioner i Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Måling af ilt forbrug satser i intakt Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kvantificering af vævsspecifik proteostatisk tilbagegang i caenorhabditis eleganer

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...