Name: automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) en de Infectious Diseases Society of America financiering aan DMC. De financiers hadden geen rol in studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het manuscript. We bedanken de leden van het Czyz Lab voor het proeflezen van het manuscript. Cartoonfiguren werden gegenereerd met behulp van biorender betaalde licentie.

<ol>
	<li>Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+the+role+of+protein+misfolding+in+neurodegenerative+diseases.">Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).</li><li>Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+as+a+modifier+of+neurodegenerative+disease+risk.">The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk.</a> Cell Host &amp; Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).</li><li>Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Our+gut+microbiome:+The+evolving+inner+self.">Our gut microbiome: The evolving inner self.</a> Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).</li><li>Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+understanding+the+role+of+the+gut+microbiota+in+brain+health+and+disease.">Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7 (1), 13023 (2016).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1003466 (2013).</li><li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network.">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Walker, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+with+human+enteric+bacterial+pathogens+leads+to+proteostasis+disruption+that+is+rescued+by+butyrate.">Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate.</a> PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510 (2021).</li><li>Goya, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Bacillus+subtilis+protects+against+&#945;-Synuclein+aggregation+in+C.+elegans.">Probiotic Bacillus subtilis protects against &#945;-Synuclein aggregation in C. elegans.</a> Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).</li><li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans.">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337 (2017).</li><li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins.">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).</li><li>Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+the+heat+shock+response+modulate+protein+homeostasis+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine+during+infection.">Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WorMachine:+machine+learning-based+phenotypic+analysis+tool+for+worms.">WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms.</a> BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 482 (2008).</li><li>Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-verified+two-allele+transposon+mutant+library+for+Pseudomona+aeruginosa+PA01.">Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).</li><li>Schulenburg, H., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+pathogen+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li><li>Haldimann, P., Muriset, M., V&#237;gh, L., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+hydroxylamine+derivative+ng-094+suppresses+polyglutamine+protein+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans.">The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).</li><li>Shinn-Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wrapping+culture+plates+with+Parafilm+M&#174;+increases+Caenorhabditis+elegans+growth.">Wrapping culture plates with Parafilm M&#174; increases Caenorhabditis elegans growth.</a> BMC Research Notes. 12 (1), (2019).</li><li>Alexander-Floyd, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+cell+type-dependent+effects+of+autophagy+on+polyglutamine+aggregation+revealed+by+natural+genetic+variation+in+C.+elegans.">Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans.</a> BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery.">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li></ol>

De auteurs hebben verklaard dat er geen belangenconflicten bestaan.

Het beschreven protocol schetst procedures voor C. elegans-kweek - en beeldverwerking die CellProfiler bevat, een open-source beeldanalysesoftware. De representatieve resultaten tonen reproduceerbaarheid, vermindering van bias en schaalbaarheid. Deze gestandaardiseerde procedure zal de screeningstrategieën verbeteren die worden gebruikt met grote bacteriële, genomische of medicijnbibliotheken. Terwijl er andere geautomatiseerde C. elegans-methoden voor objectdetectie bestaan, biedt de beschreven techniek een gestandaardiseerde pijplijn met een hogere doorvoer die culturing, beeldacquisitie en analyse integreert.
Verschillende variaties van wormenteelt moesten worden getest om het hierin beschreven protocol te optimaliseren. Aanvankelijk werden wormen onmiddellijk na leeftijdssynchronisatie (L1-stadium) overgebracht naar monsters van bacteriën. Een dergelijke aanpak resulteerde echter in een populatie wormen met variabele groottes, zelfs onder wormen binnen dezelfde put. C. elegans staan bekend om het vermijden van pathogenen19, wat kan hebben bijgedragen aan de waargenomen variabiliteit in grootte en uiteindelijk van invloed kan zijn op downstream imaging-wormdetectie, in het bijzonder. Om dergelijke variabiliteit te elimineren, werd het hele NGM-gebied in elke put bedekt met testbacteriën. Bovendien kregen wormen E. coli OP50 en mochten ze zich gedurende 48 uur bij 25 °C volledig ontwikkelen tot jonge volwassenen. Het toestaan van wormen om volwassen te worden op E. coli OP50 voordat ze worden overgebracht op testbacteriën resulteerde in een consistentere lichaamsgrootte. Bovendien werden overbevolking en snelle voedseluitputting door nakomelingen geëlimineerd door NGM-agar aan te vullen met FUDR. De implementatie van FUDR verwijderde nakomelingen en verbeterde geautomatiseerde wormidentificatie, die werd verdoezeld door nageslacht dat zich mengde met de ouderlijke populatie. Het is echter belangrijk om voorzichtig te zijn en de juiste controles te gebruiken bij het gebruik van FUDR, omdat bekend is dat de verbinding C. elegans proteostase en levensduur20,21 beïnvloedt. Onder de in dit protocol beschreven omstandigheden had FUDR geen invloed op intestinale polyQ-aggregatie (aanvullende figuur 5); daarom was het gebruik ervan geschikt en gunstig voor de beschreven methode.
Het invriezen van monsters voorafgaand aan beeldvorming bleek een cruciale stap in de succesvolle werking van de pijpleiding. De geaggregeerde tellingen vóór het bevriezen waren significant hoger dan handmatige tellingen (figuur 3B). Wormen gedurende 18-48 uur bij -20 °C houden voorafgaand aan beeldvorming verminderde de achtergrondfluorescentie en verbeterde uiteindelijk de aggregaatdetectie (figuur 3A). De effecten van bevriezing op aggregaatdetectie zijn alleen onderzocht voor polyQ en mogen niet worden gegeneraliseerd naar andere modellen zonder verder onderzoek van dergelijke effecten.
Ondanks dat alle omstandigheden hetzelfde werden gehouden, werd waargenomen dat het gemiddelde aantal aggregaten per worm kon variëren tussen verschillende runs, terwijl de verhouding tussen het aantal aggregaten bij dieren gekoloniseerd met OP50 versus MPAO1 consistent bleef (figuur 6, aanvullende figuur 2, aanvullende figuur 5). Daarom is het van essentieel belang om altijd E. coli OP50-controle, of eventuele aanvullende geschikte referentiecontroles, in elke run op te nemen. Een dergelijke variabiliteit in geaggregeerde tellingen tussen experimenten kan worden beïnvloed door omgevingsomstandigheden (temperatuur, vochtigheid)22,23 of genetische achtergrond8. In feite werd waargenomen dat na langdurige kweek de darmfluorescentie drastisch afnam of volledig verloren ging, waardoor een nieuwe stam uit bevroren voorraad moest worden ontdooid. De waargenomen afname van fluorescentie kan een gevolg zijn van genetische veranderingen die toxische transgenen onderdrukken, zoals die welke polyQ tot expressie brengen. Niettemin benadrukt de uitzonderlijke reproduceerbaarheid van de resultaten waargenomen tussen verschillende experimentatoren (aanvullende figuur 2), tussen biologische replicaties (figuur 5) en binnen dezelfde steekproef (aanvullende figuur 3) de kracht van deze aanpak.
Talrijke rapporten hebben intestinale polyQ gebruikt om proteostase 9,11,12,13,24,25 te bestuderen. Een directe vergelijking tussen de resultaten kan echter niet worden gemaakt vanwege de variabiliteit tussen experimentele benaderingen en uitleesmethoden. Niettemin worden enkele resultaten van eerder gepubliceerde gegevens samengevat door de geautomatiseerde kwantificering die hierin wordt beschreven, waaronder bacteriële inductie van aggregatie 9,13 en een vergelijkbaar aantal aggregaten11. Gezamenlijk biedt de beschreven pijplijn een waardevol hulpmiddel om proteostase te bestuderen.
De hierin beschreven methode heeft een aantal inherente uitdagingen. Het vereist bijvoorbeeld voldoende tijd om alle componenten van dit protocol onder de knie te krijgen, wat met name geldt voor sectie 8 van het protocol, dat bekendheid met de test vereist om te bepalen of de verkregen afbeeldingen geschikt zijn voor pijplijnanalyse. Afwijkingen van de beeldacquisitie-instellingen die in dit protocol worden gebruikt, zijn mogelijk; wijziging van de instellingen en wormtrainingsset zal echter waarschijnlijk nodig zijn. Deze pijplijn kan aggregaten van verschillende groottes onderscheiden en die raken, wat het "mengen" van aggregaten beperkt en uiteindelijk de detectiegevoeligheid verhoogt. Er kunnen zich echter problemen voordoen bij het identificeren van grote aggregaten die het geaccepteerde groottebereik overschrijden, omdat het uitbreiden van de bovenste groottedrempel kan leiden tot fouten die worden veroorzaakt door slechte identificatie, zoals het onvermogen om aggregaten te onderscheiden die elkaar raken. Voorafgaand aan de beeldanalyse moet een balans worden gevonden tussen nauwkeurigheid, grootte en intensiteit. De efficiëntie van geaggregeerde identificatie kan verder worden verbeterd door machine learning op te nemen om een neuraal netwerk te creëren dat in staat is om aggregaatdetectie te verbeteren. Dergelijke verbeteringen worden momenteel onderzocht en zullen enorm helpen bij het aanpakken van actuele problemen, zoals de detectie van aggregaten die op verschillende brandpuntsvlakken liggen of abnormale vormen hebben.
Een opmerkelijke zwakte van de beschreven methode is de variabiliteit in geautomatiseerde geaggregeerde tellingen, omdat ze niet altijd worden samengevat door handmatige tellingen in wormen die verschillende bacteriestammen krijgen. Op basis van geautomatiseerde tellingen hadden wormen die P. aeruginosa-mutant 53 (M53) kregen bijvoorbeeld significant minder aggregaten in vergelijking met de wildtypestam (MPAO1) (figuur 7); de bevestiging van de treffer vertoonde echter geen significant verschil (aanvullende figuur 4). Over het algemeen hebben high-throughput drugsscreenings een hoge mate van vals-positieve hitdetectie, en de beschreven methode is geen uitzondering26. Het is dus een cruciaal onderdeel van het protocol om alle potentiële hits te bevestigen.
Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd om te passen in een screeningstrategie om bacteriën te identificeren die de proteostase van de gastheer beïnvloeden, kan elke stap verder worden gewijzigd om het effect van genomische RNAi-bibliotheken, kleine moleculen of andere aandoeningen te testen. Bij elke stap kunnen aanvullende wijzigingen worden aangebracht om aan de vereisten van een specifieke screeningstrategie te voldoen. Bovendien biedt deze techniek een niveau van flexibiliteit dat de optimalisatie van elke stap mogelijk maakt om bij een specifiek model te passen. Deze benadering kan bijvoorbeeld worden uitgebreid tot polyQ-aggregatie in andere weefsels of het extraheren van andere kenmerken die in afbeeldingen worden gedetecteerd, zoals het monitoren van genexpressie met behulp van induceerbare fluorescerende reporters (bijv. Hitteschokgenen), het beoordelen van subcellulaire lokalisatie van eiwitten (bijv. Nucleaire lokalisatie van DAF-16), het bestuderen van aggregatie in andere ziektemodellen (Aβ1-42, α-synucleïne, TDP-43, enz.) of het beoordelen van fysiologische fenotypen, zoals wormgrootte.

Leeftijdsafhankelijke neurodegeneratieve eiwitconformatieziekten (PCD's) zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson en Huntington, of amyotrofische laterale sclerose, worden gekenmerkt door eiwitmisvouwing die leidt tot aggregatie, celdood en weefseldegeneratie1. Hoewel eiwitmisvouwen wordt erkend als de boosdoener, is de etiologie van deze ziekten niet duidelijk. Als zodanig is de ontwikkeling van effectieve therapieën belemmerd door het gebrek aan kennis over de factoren en aandoeningen die bijdragen aan het begin en de progressie van de ziekte. Recente studies suggereren dat veranderingen in het microbioom het begin, de progressie en de ernst van PCD's beïnvloeden 2,3,4. De complexiteit van het menselijke, of zelfs murine, microbioom maakt het echter moeilijk om studies uit te voeren die de exacte invloed van microben op hun gastheer zouden onthullen. Daarom worden eenvoudiger organismen, zoals Caenorhabditis elegans, vaak gebruikt als ontdekkingsmiddel 5,6,7,8. Recente studies hebben C. elegans gebruikt om het effect van bacteriën op de proteostase van de gastheer en ziektepathogenese te onderzoeken 9,10. Bacteriële kolonisatie, hormese en genomische veranderingen behoren tot de voorbeeldaandoeningen die de aggregatie van polyglutamine (polyQ) -kanalen beïnvloeden 9,11,12. Bovendien vertonen deze verkeerd gevouwen eiwitclusters polyQ-lengte- en leeftijdsafhankelijke accumulatie in de gastheer en zijn ze geassocieerd met verminderde beweeglijkheid 9,13. De relatief eenvoudige benadering van het kwantificeren van fluorescerend gelabelde puncta kan belangrijke gegevens genereren over aandoeningen, factoren of geneesmiddelen die van invloed zijn op het vouwen en aggregeren van eiwitten.
Hoewel kwantificering van fluorescerende puncta een betrouwbare en relatief eenvoudige procedure is gebleken, blijft de uitdaging om een protocol te ontwikkelen dat grootschalige screening van verbindingen, bacteriën of aandoeningen die van invloed zijn op eiwitaggregatie zou vergemakkelijken. Het concept van geautomatiseerde C. elegans beeldverwerking en puncta kwantificering is niet helemaal nieuw, aangezien er een aantal praktische ondersteuningstools zijn ontwikkeld14,15. De integratie van culturing, beeldacquisitie en een verwerkingspijplijn zijn echter essentieel om variabiliteit in resultaten te elimineren en schermen met een hogere doorvoer mogelijk te maken.
Als zodanig is de bedoeling van dit manuscript om de procedure te standaardiseren die wordt gebruikt om polyQ-aggregatie in C. elegans te kwantificeren als een proxy om veranderingen in proteostase te detecteren. Deze taak werd volbracht door Gebruik te maken van CellProfiler, een open-source beeldanalysesoftware16 die in staat is tot geautomatiseerde worm- en aggregaatidentificatie, en is geïntegreerd in een groter protocol voor het kweken van wormen, het verkrijgen van afbeeldingen en het verwerken van gegevens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#24-282</td>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipettes</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#12-104</td>
			<td>Plastic pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes, Racked</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#28-101</td>
			<td>Conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D2235100MG</td>
			<td>FUDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet Pro Pipette Controller</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>91-600RB</td>
			<td>Pipette gun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#BP1423-2</td>
			<td>Granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Graphical figure generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (Regular)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>Bar# 044600324111, Splash-less Bleach</td>
			<td>4.5% sodium hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM140, Q35::YFP</td>
			<td>Muscle polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM738, Q44::YFP</td>
			<td>Intestinal polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#C79-500</td>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#ICN10138201</td>
			<td>Cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating Water Bath Head</td>
			<td>Lauda</td>
			<td>26LE</td>
			<td>Lauda E 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>8114931</td>
			<td>Fluorescent light control and emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL Culture Tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td>Culture tubes, 17 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>E. coli control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450910</td>
			<td>Eyepiece set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Set ET GFP - MZ10F</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450588</td>
			<td>Filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v9.2.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Incubator IMP180</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51031562</td>
			<td>Refrigerated incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4000</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1192-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K5 Camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td>Stereomicroscope camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2P04</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#P285-3</td>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Imaging Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ10 F Optics Carrier</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450103</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#0215522805</td>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (Lennox)</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>Cat#11-125</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-49S</td>
			<td>Stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14491</td>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>8205</td>
			<td>Single frosted microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S373-500</td>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S671-500</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S318-3</td>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Achromat, f = 100 mm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10411597</td>
			<td>Objective microscope lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat#32-107G</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa Mutant Library</td>
			<td>Manoil Lab (University of Washington)</td>
			<td></td>
			<td>P. aeruginosa mutant library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-102</td>
			<td>Used for worm growth and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinocular Tube 100% M-series</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>ThermoFisher, Difco</td>
			<td>Cat#211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-400 Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat#75003181</td>
			<td>Swing bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Driven Filter System</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#25-227</td>
			<td>500 mL, PES Membrane, .22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Objective with C-Mount</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447367</td>
			<td>0.63x camera adapter tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans

Een toename van de prevalentie van neurodegeneratieve eiwitconformatieziekten (PCD's) heeft in de loop der jaren een grote interesse in dit onderwerp aangewakkerd. Deze toegenomen aandacht heeft opgeroepen tot de diversificatie en verbetering van diermodellen die in staat zijn om ziektefenotypen te reproduceren die zijn waargenomen bij mensen met PCD's. Hoewel muizenmodellen van onschatbare waarde zijn gebleken, zijn ze duur en worden ze geassocieerd met bewerkelijke methoden met een lage doorvoer. Het gebruik van het Caenorhabditis elegans nematodemodel om PCD's te bestuderen, wordt gerechtvaardigd door het relatieve onderhoudsgemak, de lage kosten en de snelle generatietijd, die toepassingen met een hoge doorvoer mogelijk maken. Bovendien maakt een hoge conservering tussen de C. elegans en menselijke genomen dit model een waardevol ontdekkingsinstrument. Nematoden die fluorescerend gelabelde weefselspecifieke polyglutamine (polyQ) kanalen uitdrukken, vertonen leeftijds- en polyQ-lengteafhankelijke aggregatie die wordt gekenmerkt door fluorescerende foci. Dergelijke verslaggevers worden vaak gebruikt als proxy's om veranderingen in proteostase in weefsels te volgen. Handmatige geaggregeerde kwantificering is tijdrovend en beperkt de experimentele doorvoer. Bovendien kan handmatige foci-kwantificering vertekening introduceren, omdat geaggregeerde identificatie zeer subjectief kan zijn. Hierin werd een protocol bestaande uit wormenkweek, beeldacquisitie en gegevensverwerking gestandaardiseerd om aggregatenkwantificering met hoge doorvoer te ondersteunen met behulp van C. elegans die darmspecifieke polyQ tot expressie brengen. Door een op C. elegans gebaseerde beeldverwerkingspijplijn te implementeren met CellProfiler, een beeldanalysesoftware, is deze methode geoptimaliseerd om individuele wormen te scheiden en te identificeren en hun respectieve aggregaten op te sommen. Hoewel het concept van automatisering niet helemaal uniek is, is de noodzaak om dergelijke procedures voor reproduceerbaarheid te standaardiseren, vertekening door handmatig tellen te elimineren en de doorvoer te verhogen hoog. Verwacht wordt dat deze methoden het screeningproces van grote bacteriële, genomische of medicijnbibliotheken drastisch kunnen vereenvoudigen met behulp van het C. elegans-model .

Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van een high-throughput workflow voor het kweken van wormen, fluorescentie beeldvorming en geautomatiseerde beeldverwerking om polyglutamine aggregaten te kwantificeren als een beoordeling van veranderingen in proteostase.

Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Een eenvoudige aanpak werd gekozen om veranderingen in proteostase te monitoren door polyglutamineaggregatie te beoordelen en een raamwerk te bieden dat kan worden gebruikt voor toepassingen met een hoge doorvoer. Het scoren van een fenotype zoals het aantal aggregaten door ik kan subjectief worden. Het automatiseren van aggregaattellingen stelt ons in staat om dergelijke vertekeningen te elimineren, de doorvoer en reproduceerbaarheid te verhogen.Deze methode helpt bij het identificeren van bacteriële genen die bijdragen aan verstoring van de proteostase van de gastheer. Het begrijpen van de bijdrage van individuele bacteriële genen zal ons helpen de implicatie ervan in de pathogenese van ziekten zoals Alzheimer, Parkinson en Huntington te begrijpen. Begin met het verwijderen van de platen met wormen uit de vriezer en laat ze ontdooien bij kamertemperatuur.Veeg vervolgens overtollige condensatie weg en verwijder het deksel voordat u het in beeld brengt. Gebruik de microscoopinstellingen met een belichtingstijd van 500 milliseconden, een vergroting van 40 X met een 0,63 X cameraadapter en een GFP-intensiteit ingesteld op 100% tijdens het vastleggen van afbeeldingen. Pas nu de doorgelaten lichtregeling aan totdat de wormen fel verlicht lijken in vergelijking met de donkere achtergrond, waardoor overbelichting wordt vermeden.Verander de posities van wormen in de put om overmatig samenklonteren te voorkomen door een pipetpunt van 10 microliter te gebruiken om wormen voorzichtig in de gewenste positie te duwen. Stel het kanaal in op het GFP-filter voor het instellen van een brandpuntsvlak voor beide afbeeldingen. Leg een helder veldbeeld vast.Maak een overeenkomstig fluorescentiebeeld zonder de plaat te verstoren of de focus van de microscoop te veranderen. Download nu de CellProfiler om de afbeeldingen te beoordelen. Open de software en sleep de interessante afbeeldingen naar het vak afbeeldingen.Klik op de afbeeldingen in de bestandslijst om ze te openen. Selecteer het vergrootglas om een interessant gebied te markeren en het pijlpictogram om de lengte van zowel wormen als aggregaten te meten. Plaats de muisaanwijzer op het gewenste object om de intensiteitswaarde te bepalen, die te zien is op het onderste gedeelte van het scherm.Om de CellProfiler-beeldanalysepijplijn te gebruiken, geeft u de afbeeldingsparen de juiste naam zoals beschreven in het tekstmanuscript na het downloaden van de CellProfiler van de officiële website. Download de pijplijn en upload deze naar CellProfiler door bestand, import en pijplijn uit bestand te selecteren. Selecteer de module ontwarde wormen om de instellingen te openen om een trainingsset te laden die wordt gebruikt om wormen in de module voor ontwarde wormen te identificeren.Identificeer vervolgens de bestandsnaam van de trainingsset. Selecteer het pictogram uploadbestand en upload ook het aanvullende bestand. Upload afbeeldingen door de afbeeldingsmodule in de linkerbovenhoek te selecteren.En sleep vervolgens afbeeldingen met de juiste naam naartoe. Voordat u de afbeeldingen analyseert, selecteert u de gewenste uitvoermap die wordt gebruikt om de resultaten op te slaan door op de knop uitvoerinstellingen in de linkerbenedenhoek van het programma te klikken. Selecteer vervolgens het mappictogram rechts van de standaarduitvoer om de gewenste uitvoerlocatie te kiezen.Selecteer het pictogram Afbeeldingen analyseren om de afbeeldingsanalyse te starten. Als de analyse te lang duurt en vastzit aan het verwerken van een enkele afbeelding, onderbreekt u de uitvoering en identificeert u de onbewerkte afbeelding door de uitvoermap te sorteren en op te merken welke afbeeldingsnaam niet wordt gevonden. Na volledige analyse organiseert de software de resultaten in een Excel-spreadsheet met individuele wormen in kolom N en het respectieve aantal aggregaten in kolom K.Download de metadata-organizer om gemakkelijk gegevens uit het CSV-uitvoerbestand van CellProfiler te organiseren.Zoek voor Windows OS het gedownloade bestand en pak het uit naar de gewenste locatie. Zoek en open de uitgepakte map met de naam gui_Windowsos_64x. En start de applicatie door op het GUI-toepassingspictogram te klikken.Er kan een prompt worden geopend waarin toestemming wordt gevraagd om uit te voeren. Selecteer meer info en klik dan toch op uitvoeren. De metadata organizer is nu klaar om CellProfiler output CSV-bestanden te slepen en neer te zetten.Zoek voor Mac OS het gedownloade bestand en pak het toepassingsbestand voor bestandsmetagegevens uit. Open de uitgepakte map in downloads. Klik met de rechtermuisknop op de GUI-toepassing en selecteer openen.Er verschijnt een prompt waarin om toestemming wordt gevraagd om te openen vanwege het ontbreken van een officiële licentie. Selecteer openen. Zodra uw metadata organizer-applicatie is geopend in het betreffende besturingssysteem, klikt u hier op uw bestanden uploaden of sleept u de gewenste CellProfiler CSV-bestanden.Klik op de knop Organiseren, die de gebruiker naar een nieuw scherm brengt met een knop Bestanden downloaden. Klik op de knop en selecteer de gewenste locatie om het uitvoerbestand op te slaan. Het uitvoerbestand wordt weergegeven als de oorspronkelijke bestandsnaam met _organized extensie toegevoegd aan de bestandsnaam.In aanwezigheid van FUDR hadden wormen die verschillende bacteriën kregen een consistentere lichaamsgrootte die een meer uniforme en nauwkeurige wormdetectie mogelijk maakte, waardoor het probleem van overbevolking werd opgelost. Het bevriezen van de wormen verbeterde de polyQ-aggregaatdetectie door de achtergrondfluorescentie te elimineren, evenals de nauwkeurigheid van geautomatiseerd tellen vergelijkbaar met handmatig tellen. Omgekeerde brightfield-verlichting werd gebruikt om het hele C.elegans- en GFP-kanaal te detecteren om polyQ YFP-aggregaten in beeld te brengen.Wormdetectie, ontwarring en aggregaatkwantificering voor elke worm werden gedaan door een geoptimaliseerde CellProfiler-beeldverwerkingspijplijn toe te passen, waarmee het aantal aggregaten per individuele worm kan worden verkregen. Het verschil tussen de effectiviteit van geautomatiseerde aggregaatkwantificering en het gebruik van de CellProfiler-pijplijn was minimaal, wat aangeeft dat de geautomatiseerde methode kan worden toegepast op grootschalige schermen. Van de 90 geteste bacteriestammen vertoonde de kolonisatie van de darm van C.elegans met één kandidaat een significante afname van het aantal aggregaten.De bevestigingsexperimenten door handmatig tellen onthulden dat geen van de mutanten, inclusief degene die het aantal aggregaten aanzienlijk verminderde, de polyQ-aggregatie beïnvloedde. Onderzoekers die besluiten dit raamwerk te gebruiken, moeten begrijpen dat de geschetste stappen niet absoluut zijn. Modificatie en een fundamenteel begrip van hoe CellProfiler te manipuleren zijn essentieel voor succes.Aanvullende biochemische benaderingen zoals western blotting kunnen worden gebruikt om polyQ-aggregatie te bevestigen.

Research

JoVE Journal

Biology

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolatie en In vitro Activering van Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

teelt van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drie dimensies in het Laboratorium

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...