Name: automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) et l’Infectious Diseases Society of America qui finance DMC. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Nous remercions les membres du Czyz Lab d’avoir relu le manuscrit. Les figurines de dessins animés ont été générées à l’aide de la licence payante BioRender.

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G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery.">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li></ol>

Les auteurs ont déclaré qu’il n’y avait pas de conflits d’intérêts.

Le protocole décrit décrit les procédures de culture, d’imagerie et de traitement d’images de C. elegans qui intègre CellProfiler, un logiciel d’analyse d’images open source. Les résultats représentatifs démontrent la reproductibilité, la réduction des biais et l’évolutivité. Cette procédure normalisée améliorera les stratégies de dépistage utilisées dans les grandes bibliothèques bactériennes, génomiques ou pharmaceutiques. Bien qu’il existe d’autres méthodes automatisées de détection d’objets de C. elegans , la technique décrite offre un pipeline standardisé à haut débit qui intègre la culture, l’acquisition d’images et l’analyse.
Plusieurs variantes de la culture des vers ont dû être testées pour optimiser le protocole décrit ici. Initialement, les vers ont été transférés à l’échantillon de bactéries immédiatement après la synchronisation de l’âge (stade L1). Cependant, une telle approche a abouti à une population de vers de tailles variables, même parmi les vers dans le même puits. C. elegans est connu pour l’évitement des agents pathogènes19, ce qui aurait pu contribuer à la variabilité observée de la taille et finalement affecter la détection des vers d’imagerie en aval, en particulier. Pour éliminer cette variabilité, toute la zone NGM de chaque puits a été recouverte de bactéries d’essai. De plus, les vers ont été nourris avec E. coli OP50 et ont pu se développer complètement en jeunes adultes pendant 48 h à 25 °C. Permettre aux vers d’atteindre l’âge adulte sous E. coli OP50 avant de les transférer sur des bactéries d’essai a entraîné une taille corporelle plus uniforme. De plus, le surpeuplement et l’épuisement rapide des aliments par la progéniture ont été éliminés en complétant la gélose NGM par FUDR. La mise en œuvre de FUDR a supprimé la progéniture et amélioré l’identification automatisée des vers, qui a été obscurcie par le mélange de la progéniture avec la population parentale. Cependant, il est important d’être prudent et d’utiliser des contrôles appropriés lors de l’utilisation de FUDR, car le composé est connu pour affecter la protéostasie de C. elegans et la durée de vie20,21. Dans les conditions décrites dans ce protocole, le FUDR n’a pas affecté l’agrégation de polyQ intestinale (figure supplémentaire 5); par conséquent, son utilisation était appropriée et bénéfique pour la méthode décrite.
La congélation des échantillons avant l’imagerie s’est avérée être une étape critique dans l’utilisation réussie du pipeline. Les dénombrements agrégés avant la congélation étaient significativement plus élevés que les comptes manuels (figure 3B). Le maintien des vers à -20 °C pendant 18 à 48 h avant l’imagerie a permis de réduire la fluorescence de fond et, en fin de compte, d’améliorer la détection des agrégats (figure 3A). Les effets de la congélation sur la détection des agrégats n’ont été étudiés que pour le polyQ et ne devraient pas être généralisés à d’autres modèles sans une étude plus approfondie de ces effets.
Bien que toutes les conditions soient maintenues les mêmes, il a été observé que le nombre moyen d’agrégats par ver pouvait varier d’une série à l’autre, tandis que le rapport entre le nombre d’agrégats chez les animaux colonisés par OP50 et MPAO1 restait constant (figure 6, figure supplémentaire 2, figure supplémentaire 5). Par conséquent, il est essentiel de toujours inclure le contrôle E. coli OP50, ou tout contrôle de référence approprié supplémentaire, dans chaque exécution. Une telle variabilité du nombre d’agrégats entre les expériences pourrait être influencée par les conditions environnementales (température, humidité)22,23 ou le fond génétique8. En fait, il a été observé qu’après une culture prolongée, la fluorescence intestinale diminuait considérablement ou était complètement perdue, ce qui nécessitait la décongélation d’une nouvelle souche à partir de stocks congelés. La diminution observée de la fluorescence pourrait être le résultat de changements génétiques qui suppriment les transgènes toxiques, tels que ceux exprimant le polyQ. Néanmoins, la reproductibilité exceptionnelle des résultats observés entre différents expérimentateurs (figure supplémentaire 2), entre répliques biologiques (figure 5) et au sein d’un même échantillon (figure supplémentaire 3) souligne la force de cette approche.
De nombreux rapports ont utilisé le polyQ intestinal pour étudier la protéostasie 9,11,12,13,24,25. Cependant, une comparaison directe entre les résultats ne peut être faite en raison de la variabilité entre les approches expérimentales et les méthodes de lecture. Néanmoins, quelques résultats de données publiées précédemment sont récapitulés par la quantification automatisée décrite ici, y compris l’induction bactérienne de l’agrégation 9,13 et un nombre comparable d’agrégats11. Collectivement, le pipeline décrit offre un outil précieux pour étudier la protéostasie.
La méthode décrite ici présente certains défis inhérents. Par exemple, il faut suffisamment de temps pour maîtriser tous les composants de ce protocole, ce qui est particulièrement vrai pour la section 8 du protocole, qui nécessite une connaissance approfondie du test pour déterminer si les images acquises sont appropriées pour l’analyse du pipeline. Des écarts par rapport aux paramètres d’acquisition d’images utilisés dans ce protocole sont possibles ; toutefois, une modification des paramètres et de l’ensemble d’entraînement des vers sera probablement nécessaire. Ce pipeline peut distinguer les agrégats de différentes tailles et ceux qui se touchent, ce qui limite le « mélange » des agrégats et augmente finalement la sensibilité de détection. Cependant, des problèmes peuvent survenir lorsque l’on tente d’identifier de grands agrégats qui dépassent la plage de taille acceptée, car l’élargissement du seuil de taille supérieur peut entraîner des erreurs causées par une mauvaise identification, telles que l’incapacité de différencier les agrégats qui se touchent. Un équilibre entre la précision, la taille et l’intensité doit être trouvé avant l’analyse de l’image. L’efficacité de l’identification des agrégats pourrait être encore améliorée en intégrant l’apprentissage automatique pour créer un réseau neuronal capable d’améliorer la détection des agrégats. De telles améliorations sont actuellement à l’étude et aideront grandement à résoudre les problèmes actuels tels que la détection d’agrégats qui se trouvent sur différents plans focaux ou qui ont des formes anormales.
Une faiblesse notable de la méthode décrite est la variabilité des comptages agrégés automatisés, car ils ne sont pas toujours récapitulés par des comptages manuels chez les vers nourris de différentes souches bactériennes. Par exemple, d’après les dénombrements automatisés, les vers nourris avec le mutant P. aeruginosa 53 (M53) avaient significativement moins d’agrégats que la souche de type sauvage (MPAO1) (figure 7); toutefois, la confirmation de la réponse n’a révélé aucune différence significative (figure supplémentaire 4). En général, les dépistages de drogues à haut débit ont un taux élevé de détection de faux positifs, et la méthode décrite ne fait pas exception26. Ainsi, c’est une partie essentielle du protocole de confirmer tous les résultats potentiels.
Bien que ce protocole ait été optimisé pour s’adapter à une stratégie de dépistage visant à identifier les bactéries qui affectent la protéostasie de l’hôte, chaque étape peut être modifiée pour tester l’effet des bibliothèques d’ARNi génomiques, des petites molécules ou d’autres conditions. Des modifications supplémentaires peuvent être apportées à chaque étape pour répondre aux exigences d’une stratégie de dépistage spécifique. De plus, cette technique offre un niveau de flexibilité qui permet d’optimiser chaque étape en fonction d’un modèle spécifique. Par exemple, cette approche peut être étendue à l’agrégation polyQ dans d’autres tissus ou à l’extraction d’autres caractéristiques détectées dans des images telles que la surveillance de l’expression des gènes à l’aide de rapporteurs fluorescents inductibles (par exemple, les gènes de choc thermique), l’évaluation de la localisation subcellulaire des protéines (par exemple, la localisation nucléaire de DAF-16), l’étude de l’agrégation dans d’autres modèles de maladies (Aβ1-42, α-synucléine, TDP-43, etc.) ou l’évaluation de phénotypes physiologiques, comme la taille du ver.

Les maladies neurodégénératives conformationnelles des protéines (PCD) dépendantes de l’âge telles que les maladies d’Alzheimer, de Parkinson et de Huntington, ou la sclérose latérale amyotrophique, sont caractérisées par un mauvais repliement des protéines qui conduit à l’agrégation, à la mort cellulaire et à la dégénérescence tissulaire1. Bien que le mauvais repliement des protéines soit reconnu comme le coupable, l’étiologie de ces maladies n’est pas claire. En tant que tel, le développement de thérapies efficaces a été entravé par le manque de connaissances concernant les facteurs et les conditions qui contribuent à l’apparition et à la progression de la maladie. Des études récentes suggèrent que les changements dans le microbiome influencent l’apparition, la progression et la gravité des PCD 2,3,4. Cependant, la complexité du microbiome humain, voire murin, rend difficile la réalisation d’études qui révéleraient l’influence exacte des microbes sur leur hôte. Par conséquent, des organismes plus simples, tels que Caenorhabditis elegans, sont souvent utilisés comme outil de découverte 5,6,7,8. Des études récentes ont utilisé C. elegans pour étudier l’effet des bactéries sur la protéostasie de l’hôte et la pathogenèse de la maladie 9,10. La colonisation bactérienne, l’hormèse et les changements génomiques font partie des conditions exemplaires qui affectent l’agrégation des tracts de polyglutamine (polyQ) 9,11,12. De plus, ces amas de protéines mal repliés présentent une accumulation polyQ dépendante de la longueur et de l’âge chez l’hôte et sont associés à une motilité altérée 9,13. L’approche relativement simple de la quantification des ponctuations marquées par fluorescence peut générer des données importantes sur les conditions, les facteurs ou les médicaments qui affectent le repliement et l’agrégation des protéines.
Bien que la quantification de la ponctuation fluorescente se soit avérée être une procédure fiable et relativement simple, le défi reste de développer un protocole qui faciliterait le dépistage à grande échelle des composés, des bactéries ou des conditions qui affectent l’agrégation des protéines. Le concept de traitement automatisé de l’image C. elegans et de quantification puncta n’est pas entièrement nouveau, car un certain nombre d’outils de support pratiques ont été développés14,15. Cependant, l’intégration de la culture, de l’acquisition d’images et d’un pipeline de traitement est essentielle pour éliminer la variabilité des résultats et permettre des écrans à plus haut débit.
En tant que tel, l’intention de ce manuscrit est de normaliser la procédure utilisée pour quantifier l’agrégation polyQ chez C. elegans comme proxy pour détecter les changements dans la protéostasie. Cette tâche a été accomplie en utilisant CellProfiler, un logiciel d’analyse d’images open source16 capable d’identification automatisée des vers et des agrégats, et est intégré dans un protocole plus large pour la culture de vers, l’acquisition d’images et le traitement des données.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#24-282</td>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipettes</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#12-104</td>
			<td>Plastic pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes, Racked</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#28-101</td>
			<td>Conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D2235100MG</td>
			<td>FUDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet Pro Pipette Controller</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>91-600RB</td>
			<td>Pipette gun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#BP1423-2</td>
			<td>Granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Graphical figure generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (Regular)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>Bar# 044600324111, Splash-less Bleach</td>
			<td>4.5% sodium hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM140, Q35::YFP</td>
			<td>Muscle polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM738, Q44::YFP</td>
			<td>Intestinal polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#C79-500</td>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#ICN10138201</td>
			<td>Cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating Water Bath Head</td>
			<td>Lauda</td>
			<td>26LE</td>
			<td>Lauda E 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>8114931</td>
			<td>Fluorescent light control and emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL Culture Tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td>Culture tubes, 17 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>E. coli control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450910</td>
			<td>Eyepiece set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Set ET GFP - MZ10F</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450588</td>
			<td>Filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v9.2.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Incubator IMP180</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51031562</td>
			<td>Refrigerated incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4000</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1192-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K5 Camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td>Stereomicroscope camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2P04</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#P285-3</td>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Imaging Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ10 F Optics Carrier</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450103</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#0215522805</td>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (Lennox)</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>Cat#11-125</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-49S</td>
			<td>Stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14491</td>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>8205</td>
			<td>Single frosted microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S373-500</td>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S671-500</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S318-3</td>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Achromat, f = 100 mm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10411597</td>
			<td>Objective microscope lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat#32-107G</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa Mutant Library</td>
			<td>Manoil Lab (University of Washington)</td>
			<td></td>
			<td>P. aeruginosa mutant library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-102</td>
			<td>Used for worm growth and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinocular Tube 100% M-series</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>ThermoFisher, Difco</td>
			<td>Cat#211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-400 Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat#75003181</td>
			<td>Swing bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Driven Filter System</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#25-227</td>
			<td>500 mL, PES Membrane, .22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Objective with C-Mount</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447367</td>
			<td>0.63x camera adapter tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans

L’augmentation de la prévalence des maladies neurodégénératives de conformation des protéines (PCD) a suscité un grand intérêt pour ce sujet au fil des ans. Cette attention accrue a appelé à la diversification et à l’amélioration des modèles animaux capables de reproduire les phénotypes de maladies observés chez l’homme atteints de PCD. Bien que les modèles murins se soient avérés inestimables, ils sont coûteux et associés à des méthodes laborieuses et à faible débit. L’utilisation du modèle de nématode Caenorhabditis elegans pour étudier les PCD a été justifiée par sa relative facilité d’entretien, son faible coût et son temps de génération rapide, qui permettent des applications à haut débit. De plus, la conservation élevée entre le génome de C. elegans et les génomes humains fait de ce modèle un outil de découverte inestimable. Les nématodes qui expriment des voies de polyglutamine spécifiques aux tissus (polyQ) marquées par fluorescence présentent une agrégation dépendante de l’âge et de la longueur de la polyQ caractérisée par des foyers fluorescents. Ces rapporteurs sont souvent utilisés comme mandataires pour surveiller les changements dans la protéostasie à travers les tissus. La quantification manuelle des agrégats prend beaucoup de temps et limite le débit expérimental. En outre, la quantification manuelle des foyers peut introduire un biais, car l’identification globale peut être très subjective. Ici, un protocole comprenant la culture de vers, l’acquisition d’images et le traitement de données a été normalisé pour prendre en charge la quantification agrégée à haut débit à l’aide de C. elegans qui expriment le polyQ spécifique à l’intestin. En mettant en œuvre un pipeline de traitement d’image basé sur C. elegans à l’aide de CellProfiler, un logiciel d’analyse d’images, cette méthode a été optimisée pour séparer et identifier les vers individuels et énumérer leurs agrégats respectifs. Bien que le concept d’automatisation ne soit pas tout à fait unique, la nécessité de normaliser ces procédures pour la reproductibilité, l’élimination des biais du comptage manuel et l’augmentation du débit est élevée. On s’attend à ce que ces méthodes puissent simplifier considérablement le processus de criblage des grandes bibliothèques bactériennes, génomiques ou de médicaments à l’aide du modèle C. elegans .

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Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Le protocole suivant décrit le développement et l’optimisation d’un flux de travail à haut débit pour la culture de vers, l’imagerie par fluorescence et le traitement automatisé d’images afin de quantifier les agrégats de polyglutamines en tant qu’évaluation des changements dans la protéostasie.

Automatisation de la quantification agrégée chez Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Une approche simple a été adoptée pour surveiller les changements dans la protéostasie en évaluant l’agrégation des polyglutamines et en fournissant un cadre pouvant être utilisé pour des applications à haut débit. Noter un phénotype tel que le nombre d’agrégats par I peut devenir subjectif. L’automatisation du comptage des agrégats nous permet d’éliminer ces biais, d’augmenter le débit et la reproductibilité.Cette méthode aide à identifier les gènes bactériens contribuant à la perturbation de la protéostasie de l’hôte. Comprendre la contribution individuelle des gènes bactériens nous aidera à comprendre son implication dans la pathogenèse de maladies comme la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. Commencez par retirer les plaques contenant des vers du congélateur et laissez-les décongeler à température ambiante.Essuyez ensuite l’excès de condensation et retirez le couvercle avant l’imagerie. Utilisez les paramètres du microscope avec un temps d’exposition de 500 millisecondes, un grossissement de 40 X avec un adaptateur de caméra 0,63 X et une intensité GFP réglée à 100% pendant la capture d’image. Maintenant, ajustez les commandes de lumière transmise jusqu’à ce que les vers apparaissent brillamment éclairés par rapport à l’arrière-plan sombre, évitant ainsi la surexposition.Modifiez les positions des vers dans le puits pour éviter un agglutination excessive en utilisant une pointe de pipette de 10 microlitres pour pousser doucement les vers dans la position souhaitée. Définissez le canal sur le filtre GFP pour établir un plan focal pour les deux images. Capturez une image en champ lumineux.Prenez une image de fluorescence correspondante sans perturber la plaque ou changer la mise au point du microscope. Maintenant, pour évaluer les images, téléchargez d’abord cellProfiler. Ouvrez le logiciel et faites glisser et déposez les images d’intérêt dans la boîte d’images.Cliquez sur les images dans la liste des fichiers pour les ouvrir. Sélectionnez la loupe pour mettre en surbrillance une région d’intérêt et l’icône en forme de flèche pour mesurer la longueur des vers et des agrégats. Passez le curseur de la souris sur l’objet souhaité pour déterminer sa valeur d’intensité, qui peut être vue dans la partie inférieure de l’écran.Pour utiliser le pipeline d’analyse d’images CellProfiler, nommez correctement les paires d’images comme décrit dans le manuscrit textuel après avoir téléchargé CellProfiler à partir du site officiel. Téléchargez le pipeline et téléchargez-le dans CellProfiler en sélectionnant fichier, importer et pipeline à partir du fichier. Sélectionnez le module vers non intriqués pour ouvrir ses paramètres afin de charger un jeu d’entraînement utilisé pour identifier les vers dans le module vers non intriqués.Identifiez ensuite le nom du fichier de l’ensemble de formation. Sélectionnez l’icône de téléchargement du fichier et téléchargez également le fichier supplémentaire. Téléchargez des images en sélectionnant le module images dans le coin supérieur gauche.Et puis faites glisser et déposez des images correctement nommées. Avant d’analyser les images, sélectionnez le dossier de sortie souhaité qui sera utilisé pour stocker les résultats en cliquant sur le bouton des paramètres de sortie situé dans le coin inférieur gauche du programme. Sélectionnez ensuite l’icône de dossier à droite de la sortie par défaut pour choisir l’emplacement de sortie souhaité.Sélectionnez l’icône Analyser les images pour commencer l’analyse des images. Si l’analyse prend trop de temps à terminer et est bloquée dans le traitement d’une seule image, abandonnez l’exécution et identifiez l’image non traitée en triant le dossier de sortie et en notant quel nom d’image est introuvable. Après une analyse complète, le logiciel organisera les résultats dans une feuille de calcul Excel contenant des vers individuels dans la colonne N et le nombre respectif d’agrégats dans la colonne K.Téléchargez l’organisateur de métadonnées pour organiser facilement les données du fichier CSV de sortie de CellProfiler.Pour le système d’exploitation Windows, localisez le fichier téléchargé et extrayez-le à l’emplacement souhaité. Recherchez et ouvrez le dossier extrait nommé gui_Windowsos_64x. Et lancez l’application en cliquant sur l’icône de l’application GUI.Une invite peut s’ouvrir pour demander l’autorisation d’exécuter. Sélectionnez plus d’informations, puis cliquez sur exécuter quand même. L’organisateur de métadonnées est maintenant prêt à glisser-déposer les fichiers CSV de sortie CellProfiler.Pour Mac OS, recherchez le fichier téléchargé et extrayez le fichier d’application de l’organisateur de métadonnées de fichier. Ouvrez le dossier extrait trouvé dans les téléchargements. Faites un clic droit sur l’application GUI et sélectionnez Ouvrir.Une invite apparaîtra demandant la permission d’ouvrir en raison de l’absence d’une licence officielle. Sélectionnez Ouvrir. Une fois que votre application d’organisateur de métadonnées est ouverte dans le système d’exploitation respectif, cliquez sur télécharger vos fichiers ici, ou faites glisser et déposez les fichiers CSV CellProfiler souhaités.Cliquez sur le bouton organiser, ce qui amènera l’utilisateur à un nouvel écran avec un bouton de téléchargement de fichiers. Cliquez sur le bouton et sélectionnez l’emplacement souhaité pour enregistrer le fichier de sortie. Le fichier de sortie apparaîtra comme le nom de fichier d’origine avec _organized’extension ajoutée au nom de fichier.En présence de FUDR, les vers nourris avec diverses bactéries avaient une taille corporelle plus constante, ce qui permettait une détection plus uniforme et plus précise des vers, résolvant ainsi le problème de la surpopulation. La congélation des vers a amélioré la détection des agrégats polyQ en éliminant la fluorescence de fond, ainsi que la précision du comptage automatisé comparable au comptage manuel. L’éclairage en champ lumineux inversé a été utilisé pour détecter l’ensemble du canal C.elegans et GFP pour imager les agrégats polyQ YFP.La détection des vers, le démêlage et la quantification des agrégats pour chaque ver ont été effectués en appliquant un pipeline de traitement d’image CellProfiler optimisé, ce qui permet d’obtenir le nombre d’agrégats par ver individuel. La différence entre l’efficacité de la quantification automatisée des agrégats et l’utilisation du pipeline CellProfiler était minime, ce qui indique que la méthode automatisée peut être appliquée à des écrans à grande échelle. Sur 90 souches bactériennes testées, la colonisation de l’intestin de C.elegans avec un candidat a montré une diminution significative du nombre d’agrégats.Les expériences de confirmation par comptage manuel ont révélé qu’aucun des mutants, y compris celui qui a significativement diminué le nombre d’agrégats, n’a affecté l’agrégation polyQ. Les chercheurs qui décident d’utiliser ce cadre doivent comprendre que les étapes décrites ne sont pas absolues. La modification et une compréhension fondamentale de la façon de manipuler CellProfiler sont essentielles au succès.D’autres approches biochimiques telles que le western blotting peuvent être utilisées pour confirmer l’agrégation polyQ.

Research

JoVE Journal

Biology

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

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