Name: automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (1RO3AG069056-01) והאגודה למחלות זיהומיות של אמריקה המממנת ל- DMC. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף וניתוח הנתונים, בהחלטה על פרסום או בהכנת כתב היד. אנו מודים לחברי מעבדת Czyz על ההגהה של כתב היד. דמויות מצוירות נוצרו באמצעות רישיון בתשלום של BioRender.

<ol>
	<li>Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+the+role+of+protein+misfolding+in+neurodegenerative+diseases.">Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).</li><li>Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+as+a+modifier+of+neurodegenerative+disease+risk.">The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk.</a> Cell Host &amp; Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).</li><li>Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Our+gut+microbiome:+The+evolving+inner+self.">Our gut microbiome: The evolving inner self.</a> Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).</li><li>Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+understanding+the+role+of+the+gut+microbiota+in+brain+health+and+disease.">Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7 (1), 13023 (2016).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1003466 (2013).</li><li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network.">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Walker, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+with+human+enteric+bacterial+pathogens+leads+to+proteostasis+disruption+that+is+rescued+by+butyrate.">Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate.</a> PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510 (2021).</li><li>Goya, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Bacillus+subtilis+protects+against+&#945;-Synuclein+aggregation+in+C.+elegans.">Probiotic Bacillus subtilis protects against &#945;-Synuclein aggregation in C. elegans.</a> Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).</li><li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans.">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337 (2017).</li><li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins.">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).</li><li>Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+the+heat+shock+response+modulate+protein+homeostasis+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine+during+infection.">Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WorMachine:+machine+learning-based+phenotypic+analysis+tool+for+worms.">WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms.</a> BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 482 (2008).</li><li>Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-verified+two-allele+transposon+mutant+library+for+Pseudomona+aeruginosa+PA01.">Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).</li><li>Schulenburg, H., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+pathogen+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li><li>Haldimann, P., Muriset, M., V&#237;gh, L., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+hydroxylamine+derivative+ng-094+suppresses+polyglutamine+protein+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans.">The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).</li><li>Shinn-Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wrapping+culture+plates+with+Parafilm+M&#174;+increases+Caenorhabditis+elegans+growth.">Wrapping culture plates with Parafilm M&#174; increases Caenorhabditis elegans growth.</a> BMC Research Notes. 12 (1), (2019).</li><li>Alexander-Floyd, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+cell+type-dependent+effects+of+autophagy+on+polyglutamine+aggregation+revealed+by+natural+genetic+variation+in+C.+elegans.">Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans.</a> BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery.">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li></ol>

המחברים הצהירו כי לא קיימים ניגודי עניינים.

הפרוטוקול המתואר מתווה נהלים עבור גידול, הדמיה ועיבוד תמונה של C. elegans המשלבים את CellProfiler, תוכנה לניתוח תמונות בקוד פתוח. התוצאות הייצוגיות מדגימות יכולת שכפול, הפחתת הטיה ומדרגיות. הליך סטנדרטי זה ישפר את אסטרטגיות הסינון המופעלות בספריות חיידקים, גנומיות או תרופות גדולות. בעוד ששיטות אוטומטיות אחרות של C. elegans לזיהוי אובייקטים קיימות, הטכניקה המתוארת מציעה צינור סטנדרטי בעל תפוקה גבוהה יותר המשלב תרבות, רכישת תמונה וניתוח.
היה צורך לבחון מספר וריאציות של גידול תולעים כדי לייעל את הפרוטוקול המתואר כאן. בתחילה, תולעים הועברו לדגימת חיידקים מיד לאחר סנכרון הגיל (שלב L1). עם זאת, גישה כזו הביאה לאוכלוסייה של תולעים בגדלים משתנים, אפילו בקרב תולעים בתוך אותה באר. C. elegans ידועים בהימנעות מפתוגנים19, מה שיכול היה לתרום לשונות הנצפית בגודל ובסופו של דבר להשפיע על זיהוי תולעי הדמיה במורד הזרם, בפרט. כדי למנוע שונות כזו, כל אזור ה-NGM בכל באר כוסה בחיידקי בדיקה. יתר על כן, תולעים הוזנו E. coli OP50 והותר להן להתפתח באופן מלא למבוגרים צעירים במשך 48 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. מתן אפשרות לתולעים להגיע לבגרות על E. coli OP50 לפני העברתן לחיידקי בדיקה הביא לגודל גוף עקבי יותר. בנוסף, צפיפות יתר ודלדול מזון מהיר על ידי צאצאים בוטלו על ידי תוספת NGM אגר עם FUDR. היישום של FUDR הסיר את הצאצאים ושיפר את זיהוי התולעים האוטומטי, שהוסתר על ידי התערבבות צאצאים עם אוכלוסיית ההורים. עם זאת, חשוב להיות זהירים ולהשתמש בבקרות מתאימות בעת שימוש ב- FUDR, שכן ידוע כי התרכובת משפיעה על C. elegans proteostasis ועל תוחלת החיים20,21. בתנאים המתוארים בפרוטוקול זה, FUDR לא השפיע על צבירה של פולי-Q במעיים (איור משלים 5); לכן, השימוש בו היה מתאים ומועיל לשיטה המתוארת.
הקפאת דגימות לפני ההדמיה התבררה כשלב קריטי בהעסקה מוצלחת של הצינור. הספירות המצטברות לפני ההקפאה היו גבוהות משמעותית מהספירה הידנית (איור 3B). שמירה על תולעים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 18-48 שעות לפני ההדמיה הפחיתה את הפלואורסצנציה ברקע ובסופו של דבר שיפרה את זיהוי הצבירה (איור 3A). ההשפעות של הקפאה על זיהוי צבירה נחקרו רק עבור polyQ ואין להכליל אותן למודלים אחרים ללא חקירה נוספת של השפעות כאלה.
למרות שכל התנאים נשמרו זהים, נצפה כי המספר הממוצע של אגרגטים לכל תולעת יכול להשתנות בין ריצות שונות, בעוד שהיחס בין מספר האגרגטים בבעלי חיים המיושבים עם OP50 לעומת MPAO1 נשאר עקבי (איור 6, איור משלים 2, איור משלים 5). לכן, חיוני לכלול תמיד פקד E. coli OP50, או כל פקדי ייחוס מתאימים נוספים, בכל ריצה. שונות כזו בספירה המצטברת בין הניסויים עשויה להיות מושפעת מתנאי הסביבה (טמפרטורה, לחות)22,23 או מרקע גנטי8. למעשה, נצפה כי לאחר תרבית ממושכת, פלואורסצנציה במעיים ירדה באופן דרסטי או אבדה לחלוטין, מה שדרש הפשרת זן חדש ממלאי קפוא. הירידה הנצפית בפלואורסצנציה יכולה להיות תוצאה של שינויים גנטיים המדכאים טרנסגנים רעילים, כמו אלה המבטאים פולי-קיו. עם זאת, יכולת השחזור יוצאת הדופן של התוצאות שנצפו בין נסיינים שונים (איור משלים 2), בין שכפולים ביולוגיים (איור 5), ובתוך אותה דגימה (איור משלים 3) מדגישה את חוזקה של גישה זו.
דיווחים רבים השתמשו בפולי-Q במעיים כדי לחקור פרוטאוסטזיס 9,11,12,13,24,25. עם זאת, השוואה ישירה בין התוצאות אינה יכולה להיעשות בשל שונות בין גישות ניסיוניות ושיטות קריאה. עם זאת, כמה תוצאות מנתונים שפורסמו בעבר מסוכמות על ידי הכימות האוטומטי המתואר כאן, כולל אינדוקציה חיידקית של צבירה 9,13 ומספר דומה של אגרגטים11. באופן קולקטיבי, הצינור המתואר מציע כלי רב ערך לחקר פרוטאוסטזיס.
לשיטה המתוארת כאן יש כמה אתגרים מובנים. לדוגמה, זה דורש מספיק זמן כדי לשלוט בכל הרכיבים של פרוטוקול זה, וזה נכון במיוחד עבור סעיף 8 של הפרוטוקול, אשר דורש היכרות עם הבדיקה כדי לקבוע אם התמונות שנרכשו מתאימות לניתוח צינור. סטיות מהגדרות רכישת התמונה המשמשות בפרוטוקול זה אפשריות; עם זאת, סביר להניח שיידרש שינוי של ההגדרות וערכת האימונים של התולעים. צינור זה יכול להבחין בין אגרגטים בגדלים שונים לבין אלה שנוגעים בהם, מה שמגביל את "המיזוג" של אגרגטים ובסופו של דבר מגביר את רגישות הזיהוי. עם זאת, בעיות עלולות להתעורר בעת ניסיון לזהות אגרגטים גדולים החורגים מטווח הגודל המקובל, שכן הרחבת סף הגודל העליון עלולה להוביל לשגיאות הנגרמות על ידי זיהוי לקוי, כגון חוסר היכולת להבחין בין אגרגטים שנוגעים ללב. יש למצוא איזון בין דיוק, גודל ועוצמה לפני ניתוח התמונה. ניתן לשפר עוד יותר את היעילות של זיהוי הצבירה על ידי שילוב למידת מכונה ליצירת רשת עצבית המסוגלת לשפר את זיהוי הצבירה. שיפורים כאלה נבחנים כעת ויסייעו מאוד לטפל בבעיות אקטואליות כגון זיהוי אגרגטים הנמצאים במישורי מוקד שונים או בעלי צורות חריגות.
אחת החולשות הבולטות של השיטה המתוארת היא השונות בספירת אגרגטים אוטומטית, שכן הן לא תמיד משוחזרות על ידי ספירות ידניות בתולעים הניזונות מזני חיידקים שונים. לדוגמה, בהתבסס על ספירות אוטומטיות, לתולעים שניזונו ממוטציה P. aeruginosa 53 (M53) היו הרבה פחות אגרגטים בהשוואה לזן מסוג בר (MPAO1) (איור 7); עם זאת, אישור הפגיעה לא הראה הבדל משמעותי (איור משלים 4). באופן כללי, למסכי סמים בעלי תפוקה גבוהה יש שיעור גבוה של זיהוי פגיעות חיוביות כוזבות, והשיטה המתוארת אינה יוצאת דופן26. לפיכך, זהו חלק קריטי בפרוטוקול כדי לאשר את כל הפגיעות הפוטנציאליות.
בעוד שפרוטוקול זה הותאם כך שיתאים לאסטרטגיית סינון לזיהוי חיידקים המשפיעים על פרוטאוסטזיס מארח, ניתן לשנות כל שלב עוד יותר כדי לבחון את ההשפעה של ספריות RNAi גנומיות, מולקולות קטנות או תנאים אחרים. ניתן לבצע שינויים נוספים בכל שלב כדי להתאים לדרישות של אסטרטגיית סינון ספציפית. יתר על כן, טכניקה זו מספקת רמה של גמישות המאפשרת אופטימיזציה של כל שלב כך שתתאים למודל מסוים. לדוגמה, ניתן להרחיב גישה זו לצבירת polyQ ברקמות אחרות או לחילוץ תכונות אחרות שזוהו בתמונות כגון ניטור ביטוי גנים באמצעות כתבים פלואורסצנטיים בלתי ניתנים להשראה (למשל, גנים של הלם חום), הערכת לוקליזציה תת-תאית של חלבונים (למשל, לוקליזציה גרעינית של DAF-16), חקר צבירה במודלים אחרים של מחלות (Aβ1-42, α-סינוקלאין, TDP-43 וכו ') או הערכת פנוטיפים פיזיולוגיים, כגון גודל תולעת.

מחלות קונפורמציה של חלבונים נוירודגנרטיביים תלויי גיל (PCDs) כגון אלצהיימר, פרקינסון ומחלות הנטינגטון, או טרשת אמיוטרופית צידית, מאופיינות בקיפול שגוי של חלבונים שמוביל לצבירה, למוות תאי ולניוון רקמות1. בעוד קיפול שגוי של חלבונים מוכר כאשם, האטיולוגיה של מחלות אלה אינה ברורה. ככזה, פיתוח טיפולים יעילים הופרע על ידי חוסר ידע לגבי הגורמים והתנאים התורמים להופעת המחלה והתקדמותה. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ששינויים במיקרוביום משפיעים על ההתחלה, ההתקדמות והחומרה של PCDs 2,3,4. עם זאת, המורכבות של המיקרוביום האנושי, או אפילו של מורין, מקשה על ביצוע מחקרים שיחשפו את ההשפעה המדויקת של מיקרובים על הפונדקאי שלהם. לכן, אורגניזמים פשוטים יותר, כגון Caenorhabditis elegans, משמשים לעתים קרובות ככלי גילוי 5,6,7,8. מחקרים אחרונים השתמשו ב-C. elegans כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים על פרוטאוסטזיס של המארח ועל פתוגנזה של מחלות 9,10. התיישבות חיידקית, הורמזיס ושינויים גנומיים הם בין התנאים המופתיים המשפיעים על צבירה של דרכי פוליגלוטמין (polyQ) 9,11,12. בנוסף, צבירי חלבונים מקופלים באופן שגוי אלה מציגים הצטברות תלוית אורך וגיל של polyQ בתוך הפונדקאי, והם קשורים לפגיעה בתנועתיות 9,13. הגישה הפשוטה יחסית של כימות פונקטה עם תווית פלואורסצנטית יכולה להפיק נתונים חשובים על תנאים, גורמים או תרופות המשפיעים על קיפול וצבירת חלבונים.
אף על פי שכימות של פונקטה פלואורסצנטית הוכח כהליך אמין ופשוט יחסית, האתגר נותר לפתח פרוטוקול שיאפשר סינון בקנה מידה גדול של תרכובות, חיידקים או מצבים המשפיעים על צבירת חלבונים. הרעיון של עיבוד תמונה אוטומטי של C. elegans וכימות פונקטה אינו חדש לחלוטין, שכן פותחו מספר כלי תמיכה מעשיים14,15. עם זאת, השילוב של תרבות, רכישת תמונה וצינור עיבוד חיוניים לביטול השונות בתוצאות ומאפשרים מסכים בעלי תפוקה גבוהה יותר.
ככזה, כוונתו של כתב יד זה היא לתקנן את הפרוצדורה המשמשת לכימות צבירה של polyQ ב- C. elegans כמייצג לזיהוי שינויים בפרוטאוסטזיס. משימה זו הושגה על ידי שימוש ב-CellProfiler, תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח16 המסוגלת לזהות תולעים וצברים אוטומטיים, והיא משולבת בפרוטוקול גדול יותר ללכידת תולעים, רכישת תמונות ועיבוד נתונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#24-282</td>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipettes</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#12-104</td>
			<td>Plastic pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes, Racked</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#28-101</td>
			<td>Conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D2235100MG</td>
			<td>FUDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet Pro Pipette Controller</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>91-600RB</td>
			<td>Pipette gun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#BP1423-2</td>
			<td>Granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Graphical figure generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (Regular)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>Bar# 044600324111, Splash-less Bleach</td>
			<td>4.5% sodium hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM140, Q35::YFP</td>
			<td>Muscle polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM738, Q44::YFP</td>
			<td>Intestinal polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#C79-500</td>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#ICN10138201</td>
			<td>Cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating Water Bath Head</td>
			<td>Lauda</td>
			<td>26LE</td>
			<td>Lauda E 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>8114931</td>
			<td>Fluorescent light control and emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL Culture Tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td>Culture tubes, 17 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>E. coli control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450910</td>
			<td>Eyepiece set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Set ET GFP - MZ10F</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450588</td>
			<td>Filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v9.2.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Incubator IMP180</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51031562</td>
			<td>Refrigerated incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4000</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1192-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K5 Camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td>Stereomicroscope camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2P04</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#P285-3</td>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Imaging Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ10 F Optics Carrier</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450103</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#0215522805</td>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (Lennox)</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>Cat#11-125</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-49S</td>
			<td>Stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14491</td>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>8205</td>
			<td>Single frosted microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S373-500</td>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S671-500</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S318-3</td>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Achromat, f = 100 mm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10411597</td>
			<td>Objective microscope lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat#32-107G</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa Mutant Library</td>
			<td>Manoil Lab (University of Washington)</td>
			<td></td>
			<td>P. aeruginosa mutant library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-102</td>
			<td>Used for worm growth and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinocular Tube 100% M-series</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>ThermoFisher, Difco</td>
			<td>Cat#211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-400 Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat#75003181</td>
			<td>Swing bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Driven Filter System</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#25-227</td>
			<td>500 mL, PES Membrane, .22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Objective with C-Mount</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447367</td>
			<td>0.63x camera adapter tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans

עלייה בשכיחות של מחלות קונפורמציה של חלבונים נוירודגנרטיביים (PCDs) טיפחה עניין רב בנושא זה לאורך השנים. תשומת לב מוגברת זו קראה לגיוון ולשיפור של מודלים של בעלי חיים המסוגלים לשחזר פנוטיפים של מחלות שנצפו בבני אדם עם PCDs. אף על פי שמודלים של מורין הוכיחו את עצמם כבעלי ערך רב, הם יקרים וקשורים לשיטות מייגעות ותפוקה נמוכה. השימוש במודל הנמטודה Caenorhabditis elegans לחקר PCDs הוצדק על ידי קלות התחזוקה היחסית שלו, העלות הנמוכה וזמן הייצור המהיר, המאפשרים יישומים בתפוקה גבוהה. בנוסף, שימור גבוה בין ה-C. elegans לבין הגנומים האנושיים הופך את המודל הזה לכלי גילוי שלא יסולא בפז. נמטודות המבטאות דרכי פוליגלוטאמין (polyQ) ספציפיות לרקמות המתויגות באופן פלואורסצנטי מפגינות צבירה תלוית גיל ופולי-Q המאופיינת במוקדים פלואורסצנטיים. כתבים כאלה משמשים לעתים קרובות כפרוקסים כדי לעקוב אחר שינויים בפרוטאוסטזיס על פני רקמות. כימות צבירה ידני גוזל זמן רב, ומגביל את התפוקה הניסויית. יתר על כן, כימות מוקדים ידני יכול להציג הטיה, שכן זיהוי מצרפי יכול להיות סובייקטיבי מאוד. כאן, פרוטוקול המורכב מחקלאות תולעים, רכישת תמונה ועיבוד נתונים תוקן כדי לתמוך בכימות מצטבר בתפוקה גבוהה באמצעות C. elegans המבטאים polyQ ספציפי למעי. על ידי יישום צינור עיבוד תמונה מבוסס C. elegans באמצעות CellProfiler, תוכנה לניתוח תמונות, שיטה זו הותאמה להפרדה ולזיהוי של תולעים בודדות ולמנות את הצברים שלהן בהתאמה. למרות שהמושג אוטומציה אינו ייחודי לחלוטין, הצורך לתקנן נהלים כאלה לצורך שכפול, ביטול ההטיה מספירה ידנית והגדלת התפוקה הוא גבוה. הצפי הוא ששיטות אלה יכולות לפשט באופן דרסטי את תהליך הסינון של ספריות חיידקים, גנומיות או תרופות גדולות באמצעות מודל C. elegans .

Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

גישה פשוטה ננקטה כדי לעקוב אחר שינויים בפרוטאוסטזיס על ידי הערכת צבירת פוליגלוטמין ומתן מסגרת שיכולה לשמש ליישומי תפוקה גבוהה. ניקוד פנוטיפ כמו מספר הצברים על ידי אני יכול להיות סובייקטיבי. אוטומציה של ספירה מצטברת מאפשרת לנו לחסל הטיה כזו, להגדיל את התפוקה ואת יכולת השכפול.שיטה זו מסייעת לזהות גנים חיידקיים התורמים לשיבוש הפרוטאוסטזיס של המארח. הבנת תרומתם של גנים חיידקיים בודדים תסייע לנו להבין את משמעותה בפתוגנזה של מחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון והנטינגטון. התחילו בהסרת הצלחות המכילות תולעים מהמקפיא ותנו להן להפשיר בטמפרטורת החדר.לאחר מכן נגבו את העיבוי העודף והסירו את המכסה לפני ההדמיה. השתמש בהגדרות המיקרוסקופ עם זמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה, הגדלה של 40 X עם מתאם מצלמה של 0.63 X ועוצמת GFP המוגדרת ל-100% במהלך לכידת התמונה. כעת התאימו את פקדי האור המועברים עד שהתולעים ייראו מוארות בבהירות בהשוואה לרקע הכהה, תוך הימנעות מחשיפת יתר.שנה את מיקומי התולעים בתוך הבאר כדי למנוע גוש יתר על ידי שימוש בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי לדחוף בעדינות את התולעים לתנוחה הרצויה. הגדר את הערוץ למסנן GFP ליצירת מישור מוקד עבור שתי התמונות. צלם תמונת שדה בהיר.צלם תמונה פלואורסצנטית מתאימה מבלי להפריע לצלחת, או לשנות את המיקוד של המיקרוסקופ. עכשיו כדי להעריך את התמונות, תחילה להוריד את CellProfiler. פתח את התוכנה, גרור ושחרר את התמונות המעניינות לתוך תיבת התמונות.לחץ על התמונות ברשימת הקבצים כדי לפתוח אותן. בחר את זכוכית המגדלת כדי להדגיש אזור עניין ואת סמל החץ כדי למדוד את אורך התולעים והאגרגטים. רחף מעל האובייקט הרצוי כדי לקבוע את ערך העוצמה שלו, אותו ניתן לראות בחלק התחתון של המסך.כדי להשתמש בצנרת ניתוח התמונות של CellProfiler, תן שם לצמדי התמונות כראוי כמתואר בכתב היד של הטקסט לאחר הורדת CellProfiler מהאתר הרשמי. הורד את הצינור והעלה אותו ל- CellProfiler על-ידי בחירת קובץ, ייבוא וצינור מהקובץ. בחר את מודול התולעים הלא סבוכות כדי לפתוח את ההגדרות שלו כדי לטעון ערכת אימון המשמשת לזיהוי תולעים במודול התולעים הלא סבוכות.לאחר מכן זהה את שם הקובץ של ערכת האימונים. בחר את סמל קובץ ההעלאה והעלה גם את הקובץ המשלים. העלה תמונות על-ידי בחירת מודול התמונות בפינה השמאלית העליונה.ולאחר מכן גרור ושחרר תמונות בעלות שם תקין. לפני ניתוח התמונות, בחר את תיקיית הפלט הרצויה שתשמש לאחסון התוצאות על ידי לחיצה על לחצן הגדרות הפלט הממוקם בסמוך לפינה השמאלית התחתונה של התוכנית. לאחר מכן בחר את סמל התיקיה מימין לפלט ברירת המחדל כדי לבחור את מיקום הפלט הרצוי.בחר את סמל ניתוח התמונות כדי להתחיל בניתוח תמונות. אם הניתוח לוקח זמן רב מדי להשלים והוא תקוע בעיבוד תמונה בודדת, בטל את הריצה וזיהה את התמונה הלא מעובדת על ידי מיון בתיקיית הפלט, וציין איזה שם תמונה לא נמצא. לאחר ניתוח מלא, התוכנה תארגן את התוצאות לגיליון אלקטרוני של Excel המכיל תולעים בודדות בעמודה N, ואת מספר הצברים המתאים בעמודה K.הורד את מארגן המטא-נתונים כדי לארגן בנוחות נתונים מקובץ ה- CSV של הפלט מ- CellProfiler.עבור מערכת ההפעלה Windows, אתר את הקובץ שהורדת וחלץ אותו למיקום הרצוי. אתר ופתח את התיקיה שחולצה בשם gui_Windowsos_64x. והפעל את היישום על ידי לחיצה על סמל היישום GUI.בקשה עשויה להיפתח ולבקש הרשאה לפעול. בחר מידע נוסף ולאחר מכן לחץ על הפעל בכל מקרה. מארגן המטא-נתונים מוכן כעת לגרור ולשחרר קבצי CSV של פלט CellProfiler.עבור Mac OS, אתר את הקובץ שהורדת וחלץ את קובץ היישום של מערך המטא-נתונים של הקובץ. פתח את התיקיה שחולצה ונמצאה בהורדות. לחץ לחיצה ימנית על יישום ממשק המשתמש הגרפי ובחר פתח.תופיע הנחיה המבקשת רשות לפתוח בשל היעדר רישיון רשמי. בחר פתח. לאחר שיישום מארגן המטא-נתונים שלך פתוח במערכת ההפעלה המתאימה, לחץ על העלה את הקבצים שלך לכאן, או גרור ושחרר את קבצי ה- CSV הרצויים של CellProfiler.לחץ על כפתור הארגון, שיביא את המשתמש למסך חדש עם כפתור הורדת קבצים. לחץ על הלחצן ובחר את המיקום הרצוי כדי לשמור את קובץ הפלט. קובץ הפלט יופיע כשם הקובץ המקורי עם סיומת _organized שנוספה לשם הקובץ.בנוכחות FUDR, לתולעים שניזונו מחיידקים שונים היה גודל גוף עקבי יותר שאיפשר זיהוי תולעים אחיד ומדויק יותר, ובכך פתר את בעיית הצפיפות. הקפאת התולעים שיפרה את זיהוי הצבירה של PolyQ על ידי ביטול הפלואורסצנציה ברקע, כמו גם הדיוק של ספירה אוטומטית הדומה לספירה ידנית. תאורת שדה בהיר הפוכה שימשה לזיהוי כל C.elegans וערוץ GFP כדי לצלם אגרגטים של polyQ YFP.זיהוי תולעים, התרת סבך וכימות צבירה עבור כל תולעת נעשו על ידי החלת צינור עיבוד תמונה מותאם CellProfiler, המאפשר קבלת מספר האגרגטים לכל תולעת בודדת. ההבדל בין היעילות של כימות צבירה אוטומטי לבין שימוש בצנרת CellProfiler היה מזערי, מה שמצביע על כך שניתן ליישם את השיטה האוטומטית על מסכים בקנה מידה גדול. מתוך 90 זני חיידקים שנבדקו, התיישבות במעי C.elegans עם מועמד אחד הראתה ירידה משמעותית במספר הצברים.ניסויי האישור על ידי ספירה ידנית גילו שאף אחד מהמוטאנטים, כולל זה שהפחית באופן משמעותי את מספר האגרגטים, לא השפיע על צבירת ה-polyQ. חוקרים המחליטים להשתמש במסגרת זו צריכים להבין שהצעדים המתוארים אינם מוחלטים. שינוי והבנה בסיסית של כיצד לתמרן את CellProfiler חיוניים להצלחה.ניתן להשתמש בגישות ביוכימיות נוספות כגון כתם מערבי כדי לאשר צבירה של polyQ.

Research

JoVE Journal

Biology

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...