Name: automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) e dalla Infectious Diseases Society of America che finanzia DMC. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamo i membri del Czyz Lab per la correzione di bozze del manoscritto. Le figure dei cartoni animati sono state generate utilizzando la licenza a pagamento di BioRender.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+the+heat+shock+response+modulate+protein+homeostasis+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine+during+infection.">Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WorMachine:+machine+learning-based+phenotypic+analysis+tool+for+worms.">WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms.</a> BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).</li><li>Jones, T. 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G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery.">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li></ol>

Gli autori hanno dichiarato che non esistono conflitti di interesse.

Il protocollo descritto delinea le procedure per la coltivazione, l'imaging e l'elaborazione delle immagini di C. elegans che incorpora CellProfiler, un software di analisi delle immagini open source. I risultati rappresentativi dimostrano riproducibilità, riduzione dei pregiudizi e scalabilità. Questa procedura standardizzata migliorerà le strategie di screening impiegate con grandi librerie batteriche, genomiche o farmacologiche. Mentre esistono altri metodi automatizzati di rilevamento degli oggetti di C. elegans , la tecnica descritta offre una pipeline standardizzata e a throughput più elevato che integra la coltivazione, l'acquisizione di immagini e l'analisi.
Diverse varianti della coltivazione dei vermi hanno dovuto essere testate per ottimizzare il protocollo qui descritto. Inizialmente, i vermi sono stati trasferiti ai batteri campione immediatamente dopo la sincronizzazione dell'età (stadio L1). Tuttavia, un tale approccio ha portato a una popolazione di vermi con dimensioni variabili, anche tra vermi all'interno dello stesso pozzo. C. elegans è noto per l'evitamento dei patogeni19, che potrebbe aver contribuito alla variabilità osservata in termini di dimensioni e, in ultima analisi, influenzare in particolare il rilevamento di worm di imaging a valle. Per eliminare tale variabilità, l'intera area NGM in ogni pozzo è stata coperta da batteri di prova. Inoltre, i vermi sono stati nutriti con E. coli OP50 e hanno permesso di svilupparsi completamente in giovani adulti per 48 ore a 25 °C. Consentire ai vermi di raggiungere l'età adulta su E. coli OP50 prima di trasferirli sui batteri di prova ha portato a dimensioni corporee più coerenti. Inoltre, il sovraffollamento e il rapido esaurimento alimentare da parte della progenie sono stati eliminati integrando NGM agar con FUDR. L'implementazione di FUDR ha rimosso la progenie e migliorato l'identificazione automatizzata dei vermi, che è stata oscurata dalla progenie che si mescola con la popolazione parentale. Tuttavia, è importante essere cauti e utilizzare controlli appropriati quando si utilizza FUDR, poiché il composto è noto per influenzare la proteostasi di C. elegans e la durata della vita20,21. Nelle condizioni descritte in questo protocollo, la FUDR non ha influenzato l'aggregazione del poliQ intestinale (Figura supplementare 5); pertanto, il suo utilizzo era adatto e vantaggioso per il metodo descritto.
Il congelamento dei campioni prima dell'imaging si è rivelato un passo fondamentale per il successo dell'impiego della pipeline. I conteggi aggregati prima del congelamento erano significativamente più alti dei conteggi manuali (Figura 3B). Mantenere i worm a -20 °C per 18-48 ore prima dell'imaging ha ridotto la fluorescenza di fondo e, in definitiva, migliorato il rilevamento degli aggregati (Figura 3A). Gli effetti del congelamento sul rilevamento aggregato sono stati studiati solo per polyQ e non dovrebbero essere generalizzati ad altri modelli senza ulteriori indagini su tali effetti.
Nonostante tutte le condizioni siano state mantenute invariate, è stato osservato che il numero medio di aggregati per verme potrebbe variare tra le diverse tirature, mentre il rapporto tra il numero di aggregati negli animali colonizzati con OP50 rispetto a MPAO1 è rimasto coerente (Figura 6, Figura supplementare 2, Figura supplementare 5). Pertanto, è essenziale includere sempre il controllo E. coli OP50, o eventuali ulteriori controlli di riferimento adeguati, in ogni corsa. Tale variabilità nei conteggi aggregati tra gli esperimenti potrebbe essere influenzata dalle condizioni ambientali (temperatura, umidità)22,23 o dal background genetico8. In effetti, è stato osservato che dopo una coltura prolungata, la fluorescenza intestinale diminuiva drasticamente o era completamente persa, il che richiedeva lo scongelamento di un nuovo ceppo dal brodo congelato. La diminuzione osservata della fluorescenza potrebbe essere il risultato di cambiamenti genetici che sopprimono i transgeni tossici, come quelli che esprimono polyQ. Tuttavia, l'eccezionale riproducibilità dei risultati osservati tra diversi sperimentatori (Figura supplementare 2), tra repliche biologiche (Figura 5) e all'interno dello stesso campione (Figura supplementare 3) sottolinea la forza di questo approccio.
Numerosi rapporti hanno impiegato il polyQ intestinale per studiare la proteostasi 9,11,12,13,24,25. Tuttavia, un confronto diretto tra i risultati non può essere effettuato a causa della variabilità tra approcci sperimentali e metodi di lettura. Tuttavia, alcuni risultati di dati precedentemente pubblicati sono ricapitolati dalla quantificazione automatizzata qui descritta, tra cui l'induzione batterica dell'aggregazione 9,13 e un numero comparabile di aggregati11. Collettivamente, la pipeline descritta offre uno strumento prezioso per studiare la proteostasi.
Il metodo qui descritto presenta alcune sfide intrinseche. Ad esempio, richiede tempo sufficiente per padroneggiare tutti i componenti di questo protocollo, il che è particolarmente vero per la sezione 8 del protocollo, che richiede familiarità con il test per determinare se le immagini acquisite sono appropriate per l'analisi della pipeline. Sono possibili deviazioni dalle impostazioni di acquisizione delle immagini utilizzate in questo protocollo; tuttavia, sarà probabilmente necessaria una modifica delle impostazioni e del set di addestramento dei worm. Questa pipeline è in grado di distinguere aggregati di varie dimensioni e quelli che si toccano, il che limita la "miscelazione" degli aggregati e, in definitiva, aumenta la sensibilità di rilevamento. Tuttavia, possono sorgere problemi quando si tenta di identificare aggregati di grandi dimensioni che superano l'intervallo di dimensioni accettato, poiché l'espansione della soglia di dimensione superiore può portare a errori causati da una scarsa identificazione, come l'impossibilità di differenziare gli aggregati che si toccano. Prima dell'analisi dell'immagine è necessario trovare un equilibrio tra precisione, dimensioni e intensità. L'efficienza dell'identificazione aggregata potrebbe essere ulteriormente migliorata incorporando l'apprendimento automatico per creare una rete neurale in grado di migliorare il rilevamento aggregato. Tali miglioramenti sono attualmente in fase di esplorazione e saranno di grande aiuto nell'affrontare questioni attuali come il rilevamento di aggregati che si trovano su diversi piani focali o che hanno forme anormali.
Un notevole punto debole del metodo descritto è la variabilità nei conteggi aggregati automatizzati, in quanto non sono sempre ricapitolati dai conteggi manuali in vermi alimentati con diversi ceppi batterici. Ad esempio, sulla base di conteggi automatizzati, i vermi alimentati con P. aeruginosa mutante 53 (M53) avevano significativamente meno aggregati rispetto al ceppo wild-type (MPAO1) (Figura 7); tuttavia, la conferma del successo non ha mostrato differenze significative (Figura supplementare 4). In generale, gli schermi di droga ad alto rendimento hanno un alto tasso di rilevamento di colpi falsi positivi e il metodo descritto non fa eccezione26. Pertanto, è una parte fondamentale del protocollo confermare tutti i potenziali colpi.
Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per adattarsi a una strategia di screening per identificare i batteri che influenzano la proteostasi dell'ospite, ogni passaggio può essere ulteriormente modificato per testare l'effetto delle librerie RNAi genomiche, delle piccole molecole o di altre condizioni. Ulteriori modifiche possono essere apportate in ogni fase per soddisfare i requisiti di una specifica strategia di screening. Inoltre, questa tecnica fornisce un livello di flessibilità che consente l'ottimizzazione di ogni passaggio per adattarsi a un modello specifico. Ad esempio, questo approccio può essere esteso all'aggregazione polyQ in altri tessuti o all'estrazione di altre caratteristiche rilevate in immagini come il monitoraggio dell'espressione genica utilizzando reporter fluorescenti inducibili (ad esempio, geni di shock termico), la valutazione della localizzazione subcellulare delle proteine (ad esempio, la localizzazione nucleare di DAF-16), lo studio dell'aggregazione in altri modelli di malattia (Aβ1-42, α-sinucleina, TDP-43, ecc.) o la valutazione di fenotipi fisiologici, come la dimensione del worm.

Le malattie conformazionali delle proteine neurodegenerative dipendenti dall'età (PCD) come l'Alzheimer, il Parkinson e la malattia di Huntington, o la sclerosi laterale amiotrofica, sono caratterizzate da un misfolding proteico che porta all'aggregazione, alla morte cellulare e alla degenerazione dei tessuti1. Mentre il misfolding proteico è riconosciuto come il colpevole, l'eziologia di queste malattie non è chiara. Come tale, lo sviluppo di terapie efficaci è stato ostacolato dalla mancanza di conoscenza dei fattori e delle condizioni che contribuiscono all'insorgenza e alla progressione della malattia. Studi recenti suggeriscono che i cambiamenti nel microbioma influenzano l'insorgenza, la progressione e la gravità delle PCD 2,3,4. Tuttavia, la complessità del microbioma umano, o addirittura murino, rende difficile condurre studi che rivelino l'esatta influenza dei microbi sul loro ospite. Pertanto, organismi più semplici, come Caenorhabditis elegans, sono spesso usati come strumento di scoperta 5,6,7,8. Studi recenti hanno impiegato C. elegans per studiare l'effetto dei batteri sulla proteostasi dell'ospite e sulla patogenesi della malattia 9,10. La colonizzazione batterica, l'ormesi e i cambiamenti genomici sono tra le condizioni esemplari che influenzano l'aggregazione dei tratti di poliglutammina (polyQ) 9,11,12. Inoltre, questi cluster proteici mal ripiegati mostrano un accumulo dipendente dalla lunghezza e dall'età del poliQ all'interno dell'ospite e sono associati a una motilitàcompromessa 9,13. L'approccio relativamente semplice di quantificare il puncta etichettato fluorescentemente può generare dati importanti su condizioni, fattori o farmaci che influenzano il ripiegamento e l'aggregazione delle proteine.
Sebbene la quantificazione della puncta fluorescente si sia dimostrata una procedura affidabile e relativamente semplice, la sfida rimane quella di sviluppare un protocollo che faciliti lo screening su larga scala di composti, batteri o condizioni che influenzano l'aggregazione proteica. Il concetto di elaborazione automatizzata delle immagini C. elegans e di quantificazione puntuale non è del tutto nuovo, poiché sono stati sviluppati numerosi strumenti di supporto pratico14,15. Tuttavia, l'integrazione della coltivazione, dell'acquisizione delle immagini e di una pipeline di elaborazione sono essenziali per eliminare la variabilità dei risultati e consentire schermi a throughput più elevato.
Come tale, l'intento di questo manoscritto è quello di standardizzare la procedura utilizzata per quantificare l'aggregazione polyQ in C. elegans come proxy per rilevare i cambiamenti nella proteostasi. Questo compito è stato realizzato utilizzando CellProfiler, un software di analisi delle immagini open source16 in grado di automatizzare l'identificazione di worm e aggregati, ed è integrato in un protocollo più ampio per la coltivazione di worm, l'acquisizione di immagini e l'elaborazione di dati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#24-282</td>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipettes</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#12-104</td>
			<td>Plastic pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes, Racked</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#28-101</td>
			<td>Conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D2235100MG</td>
			<td>FUDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet Pro Pipette Controller</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>91-600RB</td>
			<td>Pipette gun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#BP1423-2</td>
			<td>Granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Graphical figure generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (Regular)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>Bar# 044600324111, Splash-less Bleach</td>
			<td>4.5% sodium hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM140, Q35::YFP</td>
			<td>Muscle polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM738, Q44::YFP</td>
			<td>Intestinal polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#C79-500</td>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#ICN10138201</td>
			<td>Cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating Water Bath Head</td>
			<td>Lauda</td>
			<td>26LE</td>
			<td>Lauda E 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>8114931</td>
			<td>Fluorescent light control and emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL Culture Tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td>Culture tubes, 17 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>E. coli control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450910</td>
			<td>Eyepiece set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Set ET GFP - MZ10F</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450588</td>
			<td>Filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v9.2.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Incubator IMP180</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51031562</td>
			<td>Refrigerated incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4000</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1192-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K5 Camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td>Stereomicroscope camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2P04</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#P285-3</td>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Imaging Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ10 F Optics Carrier</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450103</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#0215522805</td>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (Lennox)</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>Cat#11-125</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-49S</td>
			<td>Stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14491</td>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>8205</td>
			<td>Single frosted microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S373-500</td>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S671-500</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S318-3</td>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Achromat, f = 100 mm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10411597</td>
			<td>Objective microscope lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat#32-107G</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa Mutant Library</td>
			<td>Manoil Lab (University of Washington)</td>
			<td></td>
			<td>P. aeruginosa mutant library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-102</td>
			<td>Used for worm growth and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinocular Tube 100% M-series</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>ThermoFisher, Difco</td>
			<td>Cat#211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-400 Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat#75003181</td>
			<td>Swing bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Driven Filter System</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#25-227</td>
			<td>500 mL, PES Membrane, .22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Objective with C-Mount</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447367</td>
			<td>0.63x camera adapter tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans

L'aumento della prevalenza delle malattie neurodegenerative conformazionali proteiche (PCD) ha favorito negli anni un grande interesse per questo argomento. Questa maggiore attenzione ha richiesto la diversificazione e il miglioramento dei modelli animali in grado di riprodurre i fenotipi di malattia osservati negli esseri umani con PCD. Sebbene i modelli murini si siano dimostrati inestimabili, sono costosi e sono associati a metodi laboriosi e a bassa produttività. L'uso del modello di nematode Caenorhabditis elegans per studiare le PCD è stato giustificato dalla sua relativa facilità di manutenzione, basso costo e tempi di generazione rapidi, che consentono applicazioni ad alto rendimento. Inoltre, l'elevata conservazione tra C. elegans e genomi umani rende questo modello uno strumento di scoperta inestimabile. I nematodi che esprimono tratti di poliglutammina (polyQ) marcati con tag fluorescenti mostrano un'aggregazione dipendente dalla lunghezza dell'età e del poliQ caratterizzata da focolai fluorescenti. Tali reporter sono spesso impiegati come proxy per monitorare i cambiamenti nella proteostasi tra i tessuti. La quantificazione manuale degli aggregati richiede molto tempo e limita la produttività sperimentale. Inoltre, la quantificazione manuale dei fuochi può introdurre distorsioni, poiché l'identificazione aggregata può essere altamente soggettiva. Qui, un protocollo costituito da coltivazione di vermi, acquisizione di immagini ed elaborazione dei dati è stato standardizzato per supportare la quantificazione aggregata ad alto rendimento utilizzando C. elegans che esprimono polyQ specifico dell'intestino. Implementando una pipeline di elaborazione delle immagini basata su C. elegans utilizzando CellProfiler, un software di analisi delle immagini, questo metodo è stato ottimizzato per separare e identificare i singoli worm ed enumerare i rispettivi aggregati. Sebbene il concetto di automazione non sia del tutto unico, la necessità di standardizzare tali procedure per la riproducibilità, l'eliminazione dei pregiudizi dal conteggio manuale e l'aumento della produttività è elevata. Si prevede che questi metodi possano semplificare drasticamente il processo di screening di grandi librerie batteriche, genomiche o di farmaci utilizzando il modello C. elegans .

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Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Il seguente protocollo descrive lo sviluppo e l'ottimizzazione di un flusso di lavoro ad alto rendimento per la coltivazione di vermi, l'imaging a fluorescenza e l'elaborazione automatizzata delle immagini per quantificare gli aggregati di poliglutammina come valutazione dei cambiamenti nella proteostasi.

Automatizzare la quantificazione aggregata in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

È stato adottato un approccio semplice per monitorare i cambiamenti nella proteostasi valutando l'aggregazione di poliglutammine e fornendo un framework che può essere utilizzato per applicazioni ad alto rendimento. Segnare un fenotipo come il numero di aggregati per I può diventare soggettivo. L'automazione del conteggio degli aggregati ci consente di eliminare tali distorsioni, aumentare il throughput e la riproducibilità.Questo metodo aiuta a identificare i geni batterici che contribuiscono all'interruzione della proteostasi dell'ospite. Comprendere il contributo dei singoli geni batterici ci aiuterà a capire la sua implicazione nella patogenesi di malattie come l'Alzheimer, il Parkinson e l'Huntington. Inizia rimuovendo le piastre contenenti vermi dal congelatore e lasciandole scongelare a temperatura ambiente.Quindi rimuovere la condensa in eccesso e rimuovere il coperchio prima dell'imaging. Utilizzare le impostazioni del microscopio con tempo di esposizione di 500 millisecondi, ingrandimento di 40 X con adattatore per fotocamera 0,63 X e intensità GFP impostata su 100% durante l'acquisizione dell'immagine. Ora regola i controlli della luce trasmessa fino a quando i vermi appaiono illuminati rispetto allo sfondo scuro, evitando la sovraesposizione.Modificare le posizioni dei vermi all'interno del pozzo per evitare eccessivi grumi utilizzando una punta della pipetta da 10 microlitri per spingere delicatamente i vermi nella posizione desiderata. Impostate il canale sul filtro GFP per stabilire un piano focale per entrambe le immagini. Cattura un'immagine in campo luminoso.Scatta un'immagine di fluorescenza corrispondente senza disturbare la piastra o cambiare la messa a fuoco del microscopio. Ora per valutare le immagini, prima scarica CellProfiler. Apri il software e trascina e rilascia le immagini di interesse nella casella delle immagini.Fare clic sulle immagini nell'elenco dei file per aprirle. Selezionare la lente di ingrandimento per evidenziare un'area di interesse e l'icona della freccia per misurare la lunghezza sia dei worm che degli aggregati. Passa il mouse sopra l'oggetto desiderato per determinarne il valore di intensità, che può essere visualizzato nella parte inferiore dello schermo.Per utilizzare la pipeline di analisi delle immagini di CellProfiler, denominare correttamente le coppie di immagini come descritto nel manoscritto di testo dopo aver scaricato CellProfiler dal sito Web ufficiale. Scaricare la pipeline e caricarla in CellProfiler selezionando file, importa e pipeline da file. Selezionare il modulo worm districati per aprirne le impostazioni e caricare un set di addestramento utilizzato per identificare i worm nel modulo worm districati.Quindi identificare il nome del file del set di allenamento. Seleziona l'icona di caricamento del file e carica anche il file supplementare. Carica le immagini selezionando il modulo immagini nell'angolo in alto a sinistra.E poi trascina e rilascia immagini con nome corretto. Prima di analizzare le immagini, selezionare la cartella di output desiderata che verrà utilizzata per memorizzare i risultati facendo clic sul pulsante delle impostazioni di output situato vicino all'angolo in basso a sinistra del programma. Quindi selezionare l'icona della cartella a destra dell'output predefinito per scegliere la posizione di output desiderata.Selezionare l'icona Analizza immagini per iniziare l'analisi delle immagini. Se il completamento dell'analisi richiede troppo tempo ed è bloccata durante l'elaborazione di una singola immagine, interrompere l'esecuzione e identificare l'immagine non elaborata ordinando la cartella di output e notando quale nome immagine non viene trovato. Dopo un'analisi completa, il software organizzerà i risultati in un foglio di calcolo Excel contenente singoli worm nella colonna N e il rispettivo numero di aggregati nella colonna K.Scarica l'organizzatore di metadati per organizzare comodamente i dati dal file CSV di output di CellProfiler.Per il sistema operativo Windows, individuare il file scaricato ed estrarlo nella posizione desiderata. Individuare e aprire la cartella estratta denominata gui_Windowsos_64x. E avvia l'applicazione facendo clic sull'icona dell'applicazione GUI.Potrebbe aprirsi un prompt che richiede l'autorizzazione per l'esecuzione. Seleziona ulteriori informazioni e quindi fai clic su Esegui comunque. L'organizzatore di metadati è ora pronto per trascinare e rilasciare i file CSV di output di CellProfiler.Per Mac OS, individuate il file scaricato ed estraete il file dell'applicazione dell'organizzatore dei metadati del file. Apri la cartella estratta trovata nei download. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'applicazione GUI e selezionare Apri.Apparirà un prompt che chiede il permesso di aprire a causa della mancanza di una licenza ufficiale. Seleziona Apri. Una volta che l'applicazione di metadata organizer è aperta nel rispettivo sistema operativo, fare clic su carica i file qui o trascinare e rilasciare i file CSV CellProfiler desiderati.Fare clic sul pulsante Organizza, che porterà l'utente a una nuova schermata con un pulsante di download dei file. Fare clic sul pulsante e selezionare la posizione desiderata per salvare il file di output. Il file di output verrà visualizzato come nome del file originale con _organized estensione aggiunta al nome del file.In presenza di FUDR, i vermi che sono stati alimentati con vari batteri avevano una dimensione corporea più consistente che consentiva un rilevamento dei vermi più uniforme e accurato, risolvendo così il problema del sovraffollamento. Il congelamento dei worm ha migliorato il rilevamento degli aggregati polyQ eliminando la fluorescenza di fondo e l'accuratezza del conteggio automatizzato paragonabile al conteggio manuale. L'illuminazione a campo luminoso invertito è stata utilizzata per rilevare l'intero canale C.elegans e GFP per l'immagine di aggregati polyQ YFP.Il rilevamento, il distringolo e la quantificazione aggregata dei worm per ogni worm sono stati eseguiti applicando una pipeline di elaborazione delle immagini CellProfiler ottimizzata, che consente di ottenere il numero di aggregati per singolo worm. La differenza tra l'efficacia della quantificazione automatizzata degli aggregati e l'utilizzo della pipeline CellProfiler era minima, indicando che il metodo automatizzato può essere applicato a schermi su larga scala. Su 90 ceppi batterici testati, la colonizzazione dell'intestino di C.elegans con un candidato ha mostrato una significativa diminuzione del numero di aggregati.Gli esperimenti di conferma mediante conteggio manuale hanno rivelato che nessuno dei mutanti, incluso quello che ha ridotto significativamente il numero di aggregati, ha influenzato l'aggregazione polyQ. I ricercatori che decidono di utilizzare questo framework dovrebbero capire che i passaggi delineati non sono assoluti. La modifica e una comprensione fondamentale di come manipolare CellProfiler sono essenziali per il successo.Ulteriori approcci biochimici come il western blotting possono essere utilizzati per confermare l'aggregazione polyQ.

Research

JoVE Journal

Biology

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

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