Name: automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所(1RO3AG069056-01)とDMCへの資金提供を受けたアメリカ感染症学会の支援を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も持っていませんでした。原稿を校正してくれたCzyz Labのメンバーに感謝します。漫画のフィギュアは、BioRenderの有料ライセンスを使用して生成されました。

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wrapping+culture+plates+with+Parafilm+M&#174;+increases+Caenorhabditis+elegans+growth.">Wrapping culture plates with Parafilm M&#174; increases Caenorhabditis elegans growth.</a> BMC Research Notes. 12 (1), (2019).</li><li>Alexander-Floyd, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+cell+type-dependent+effects+of+autophagy+on+polyglutamine+aggregation+revealed+by+natural+genetic+variation+in+C.+elegans.">Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans.</a> BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery.">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li></ol>

著者らは、利益相反は存在しないと宣言している。

記載されているプロトコルは、オープンソースの画像解析ソフトウェアであるCellProfilerを組み込んだ C. elegans の培養、イメージング、および画像処理の手順を概説しています。代表的な結果は、再現性、バイアスの低減、およびスケーラビリティを実証しています。この標準化された手順は、大規模な細菌、ゲノム、または薬物ライブラリで使用されるスクリーニング戦略を改善します。物体検出の 自動化されたC. elegans メソッドは他にもありますが、ここで説明する手法は、培養、画像取得、および分析を統合する標準化された高スループットのパイプラインを提供します。
ワーム培養のいくつかのバリエーションは、本明細書に記載されるプロトコルを最適化するために試験されなければならなかった。当初、ワームは、年齢同期後(L1段階)に直ちに試料細菌に移された。しかし、そのようなアプローチは、同じ井戸内のワームの間でさえ、可変サイズのワームの集団をもたらした。C. elegansは病原体回避19で知られており、これは観察されたサイズの変動性に寄与し、最終的に下流のイメージングワーム検出に特に影響する可能性がある。このような変動性を排除するために、各ウェル中のNGM領域全体を試験細菌で覆った。さらに、ワームに大腸菌OP50を与え、25°Cで48時間の間、若年成人に完全に発達させた。 ワームを試験細菌に移す前に大腸菌OP50で成虫期に達することを可能にすると、より一貫した体の大きさが得られました。さらに、子孫による過密状態および急速な食物枯渇は、NGM寒天をFUDRで補うことによって排除された。FUDRの実装により、子孫が排除され、子孫が親集団と混ざり合うことによって不明瞭になっていた自動ワーム識別が強化されました。しかしながら、FUDRを利用する際には、化合物がC.エレガンス・プロテオスタシスおよび寿命に影響を及ぼすことが知られているため、慎重であり、適切な対照を使用することが重要である20,21。このプロトコルに記載されている条件下では、FUDRは腸のpolyQ凝集に影響を及ぼさなかった(補足図5)。したがって、その利用は、記載された方法に適切かつ有益であった。
イメージング前のサンプルの凍結は、パイプラインの採用を成功させるための重要なステップであることが判明しました。凍結前の集計カウントは、手動カウントよりも有意に高かった(図3B)。イメージングの前にワームを-20°Cで18~48時間保持すると、バックグラウンド蛍光が減少し、最終的に凝集体検出が改善されました(図3A)。凝集体検出に対する凍結の影響は、polyQについてのみ調査されており、そのような影響のさらなる調査なしに他のモデルに一般化されるべきではありません。
すべての条件が同じに保たれているにもかかわらず、ワーム1匹当たりの平均凝集体数は異なる実行間で変化する可能性があることが観察されたが、OP50とMPAO1をコロニー形成した動物の凝集体数の間の比は一貫していた(図6、補足図2、補足図5)。したがって、すべての実行に大腸菌OP50コントロール、または追加の適切な参照コントロールを常に含めることが不可欠です。実験間の総計数のこのような変動は、環境条件(温度、湿度)22、23または遺伝的背景8によって影響される可能性がある。実際、長期培養後、腸内蛍光が劇的に減少するか完全に失われ、凍結ストックから新しい株を解凍する必要があることが観察された。観察された蛍光の減少は、polyQを発現する遺伝子などの毒性導入遺伝子を抑制する遺伝子変化の結果である可能性がある。それにもかかわらず、異なる実験者間(補足図2)、生物学的複製(図5)、および同じサンプル内(補足図3)内で観察された結果の例外的な再現性は、このアプローチの強さを強調している。
多数の報告が、プロテオスタシス9、11、12、13、24、25を研究するために腸内polyQを使用している。しかし、実験的アプローチと読み出し方法のばらつきにより、結果を直接比較することはできません。それにもかかわらず、以前に公表されたデータからのいくつかの結果は、凝集9、13および同程度の数の凝集体11の細菌誘導を含む、本明細書に記載の自動定量化によって要約される。まとめると、記載されたパイプラインは、プロテオスタシスを研究するための貴重なツールを提供します。
本明細書に記載される方法には、いくつかの固有の課題がある。たとえば、このプロトコルのすべてのコンポーネントを習得するには十分な時間が必要であり、これはプロトコルのセクション8に特に当てはまり、取得した画像がパイプライン解析に適しているかどうかを判断するためにアッセイに精通している必要があります。このプロトコルで使用される画像集録設定からの逸脱は可能です。ただし、設定とワームトレーニングセットの変更が必要になる可能性があります。このパイプラインは、さまざまなサイズの凝集体と接触しているものを区別できるため、凝集体の「ブレンド」が制限され、最終的に検出感度が向上します。ただし、許容サイズ範囲を超える大きなアグリゲートを特定しようとすると、上限サイズのしきい値を拡張すると、タッチしているアグリゲートを区別できないなど、識別不良によるエラーが発生する可能性があるため、問題が発生する可能性があります。画像解析の前に、精度、サイズ、強度のバランスを見つける必要があります。集約識別の効率は、機械学習を組み込んで集合体検出を強化できるニューラルネットワークを作成することによってさらに改善することができる。このような改善は現在検討中であり、異なる焦点面上に存在する凝集体や異常な形状を有する凝集体の検出などの現在の問題に対処するのに大いに役立つであろう。
記載された方法の注目すべき弱点の1つは、異なる細菌株を与えられたワームの手動カウントによって常に反復されるとは限らないため、自動集計カウントの変動性である。例えば、自動カウントに基づいて、 緑膿菌 変異体53(M53)を与えられたワームは、野生型株(MPAO1)と比較して有意に少ない凝集体を有していた(図7)。しかし、ヒットの確認では有意差は見られなかった(補足図4)。一般に、ハイスループット薬物スクリーニングは、偽陽性ヒット検出の高い率を有し、記載された方法も例外ではない26。したがって、すべての潜在的なヒットを確認することはプロトコルの重要な部分です。
このプロトコルは、宿主プロテオスタシスに影響を及ぼす細菌を同定するためのスクリーニング戦略に合うように最適化されましたが、各ステップをさらに変更して、ゲノムRNAiライブラリー、小分子、またはその他の条件の効果を試験することができます。特定のスクリーニング戦略の要件に合わせて、各ステップで追加の変更を行うことができます。さらに、この手法は、特定のモデルに合わせて各ステップの最適化を可能にするレベルの柔軟性を提供します。例えば、このアプローチは、他の組織におけるpolyQ凝集に拡張することができ、または、誘導性蛍光レポーター(例えば、ヒートショック遺伝子)を用いて遺伝子発現をモニタリングする、タンパク質の細胞内局在を評価する(例えば、DAF−16の核局在化)、他の疾患モデルにおける凝集を研究する(例えば、Aβ1−42、α−シヌクレイン、TDP−43など)または生理学的表現型を評価するなど、画像において検出された他の特徴を抽出すること、 ワームのサイズなど。

アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの年齢依存性神経変性タンパク質立体構造疾患(PCD)、または筋萎縮性側索硬化症は、凝集、細胞死、および組織変性につながるタンパク質のミスフォールディングによって特徴付けられる1。タンパク質のミスフォールディングが原因として認識されていますが、これらの疾患の病因は明らかではありません。このように、効果的な治療法の開発は、疾患の発症および進行に寄与する因子および状態に関する知識の欠如によって妨げられてきた。最近の研究は、マイクロバイオームの変化がPCDsの発症、進行、および重症度に影響を与えることを示唆している2,3,4。しかし、ヒト、あるいはネズミのマイクロバイオームの複雑さは、微生物が宿主に及ぼす正確な影響を明らかにする研究を行うことを困難にしている。したがって、Caenorhabditis elegansなどのより単純な生物は、発見ツール5、6、7、8としてよく使用される。最近の研究では、宿主プロテオスタシスおよび疾患病因に対する細菌の影響を調査するためにC.エレガンスを用いている9,10。細菌のコロニー形成、ホルミシス、およびゲノム変化は、ポリグルタミン(polyQ)管9、11、12の凝集に影響を及ぼす例示的な条件の1つである。さらに、これらのミスフォールディングされたタンパク質クラスターは、宿主内でpolyQの長さおよび年齢依存的な蓄積を示し、運動性の障害と関連している9,13。蛍光標識されたパンクタを定量する比較的単純なアプローチは、タンパク質の折り畳みおよび凝集に影響を及ぼす条件、因子、または薬物に関する重要なデータを生成することができる。
蛍光パンクタの定量は信頼性が高く比較的簡単な手順であることが証明されていますが、タンパク質凝集に影響を与える化合物、細菌、または条件の大規模なスクリーニングを容易にするプロトコルを開発することは課題が残っています。自動化されたC. elegans画像処理とプンクタ定量化の概念は、多くの実用的なサポートツールが開発されているため、完全に新しいものではありません14,15。しかし、培養、画像取得、および処理パイプラインの統合は、結果のばらつきを排除し、より高いスループットのスクリーニングを可能にするために不可欠です。
したがって、この原稿の目的は、プロテオスタシスの変化を検出するためのプロキシとして 、C. elegans におけるpolyQ凝集を定量化するために使用される手順を標準化することです。このタスクは、ワームおよび凝集体の識別を自動化することが可能なオープンソースの画像解析ソフトウェア16 であるCellProfilerを採用することによって達成され、ワームの培養、画像の取得、およびデータの処理のためのより大きなプロトコルに統合される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#24-282</td>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipettes</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#12-104</td>
			<td>Plastic pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes, Racked</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#28-101</td>
			<td>Conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D2235100MG</td>
			<td>FUDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet Pro Pipette Controller</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>91-600RB</td>
			<td>Pipette gun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#BP1423-2</td>
			<td>Granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Graphical figure generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (Regular)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>Bar# 044600324111, Splash-less Bleach</td>
			<td>4.5% sodium hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM140, Q35::YFP</td>
			<td>Muscle polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM738, Q44::YFP</td>
			<td>Intestinal polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#C79-500</td>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#ICN10138201</td>
			<td>Cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating Water Bath Head</td>
			<td>Lauda</td>
			<td>26LE</td>
			<td>Lauda E 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>8114931</td>
			<td>Fluorescent light control and emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL Culture Tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td>Culture tubes, 17 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>E. coli control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450910</td>
			<td>Eyepiece set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Set ET GFP - MZ10F</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450588</td>
			<td>Filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v9.2.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Incubator IMP180</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51031562</td>
			<td>Refrigerated incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4000</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1192-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K5 Camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td>Stereomicroscope camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2P04</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#P285-3</td>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Imaging Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ10 F Optics Carrier</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450103</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#0215522805</td>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (Lennox)</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>Cat#11-125</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-49S</td>
			<td>Stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14491</td>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>8205</td>
			<td>Single frosted microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S373-500</td>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S671-500</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S318-3</td>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Achromat, f = 100 mm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10411597</td>
			<td>Objective microscope lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat#32-107G</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa Mutant Library</td>
			<td>Manoil Lab (University of Washington)</td>
			<td></td>
			<td>P. aeruginosa mutant library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-102</td>
			<td>Used for worm growth and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinocular Tube 100% M-series</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>ThermoFisher, Difco</td>
			<td>Cat#211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-400 Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat#75003181</td>
			<td>Swing bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Driven Filter System</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#25-227</td>
			<td>500 mL, PES Membrane, .22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Objective with C-Mount</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447367</td>
			<td>0.63x camera adapter tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans

神経変性タンパク質立体構造疾患(PCD)の有病率の上昇は、長年にわたってこの主題への大きな関心を育んできました。この関心の高まりにより、PCDを有するヒトで観察される疾患表現型を再現することができる動物モデルの多様化および改善が求められている。マウスモデルは非常に貴重であることが証明されていますが、高価であり、面倒で低スループットの方法に関連しています。PCDを研究するための Caenorhabditis elegans 線虫モデルの使用は、メンテナンスの比較的容易さ、低コスト、および迅速な生成時間によって正当化されており、ハイスループットアプリケーションを可能にします。さらに、 C. elegans とヒトゲノムの間の高い保存性により、このモデルは非常に貴重な発見ツールとなっています。蛍光的にタグ付けされた組織特異的ポリグルタミン(polyQ)管を発現する線虫は、蛍光病巣を特徴とする年齢およびpolyQ長さ依存性凝集を示す。このようなレポーターは、組織全体のプロテオスタシスの変化を監視するためのプロキシとしてしばしば使用される。手作業による集計定量は時間がかかり、実験のスループットが制限されます。さらに、手動の病巣定量化は、凝集同定が非常に主観的であり得るので、バイアスを導入する可能性がある。本明細書では、ワーム培養、画像取得、およびデータ処理からなるプロトコルを標準化し、腸特異的polyQを発現する C.elegans を用いたハイスループット凝集定量をサポートする。画像解析ソフトウェアであるCellProfilerを使用して C. elegansベースの画像処理パイプラインを実装することにより、この方法は個々のワームを分離して識別し、それぞれの凝集体を列挙するように最適化されています。自動化の概念は完全に独特ではありませんが、再現性、手動カウントからのバイアスの排除、スループットの向上のために、このような手順を標準化する必要性は高いです。これらの方法は、 C. elegans モデルを用いて、大規模な細菌、ゲノム、または薬物ライブラリーのスクリーニングプロセスを大幅に簡素化できることが期待されています。

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Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

以下のプロトコルは、プロテオスタシスの変化の評価として、ワーム培養、蛍光イメージング、およびポリグルタミン凝集体を定量するための自動画像処理のためのハイスループットワークフローの開発と最適化について説明しています。

Caenorhabditis elegansにおける凝集定量の自動化

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

ポリグルタミン凝集を評価し、ハイスループットアプリケーションに使用できるフレームワークを提供することにより、プロテオスタシスの変化を監視するための簡単なアプローチが取られました。集計数などの表現型をスコアリングすることで主観的になり得る。集計カウントを自動化することで、このようなバイアスを排除し、スループットと再現性を向上させることができます。この方法は、宿主プロテオスタシス破壊に寄与する細菌遺伝子を同定するのに役立つ。個々の細菌遺伝子の寄与を理解することは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの疾患の病因におけるその影響を理解するのに役立ちます。まず、ワームを含むプレートを冷凍庫から取り出し、室温で解凍させます。その後、余分な結露を拭き取り、フタを外してからイメージングを行います。画像キャプチャ中に、露光時間500ミリ秒、倍率40 X、0.63 Xカメラアダプター、GFP強度を100%に設定した顕微鏡設定を使用します。次に、ワームが暗い背景と比較して明るく照らされて表示されるまで、透過光コントロールを調整して、露出過多を回避します。10マイクロリットルのピペットチップを使用してワームを目的の位置に穏やかに押し込むことにより、ウェル内のワームの位置を変更して過度の凝集を防ぎます。チャンネルをGFPフィルタに設定して、両方の画像の焦点面を確立します。明視野画像をキャプチャします。プレートを乱すことなく、または顕微鏡の焦点を変えることなく、対応する蛍光画像を撮影します。次に、画像を評価するには、まず CellProfiler をダウンロードします。ソフトウェアを開き、目的の画像を画像ボックスにドラッグアンドドロップします。ファイルリスト内の画像をクリックして開きます。拡大鏡ガラスを選択して関心領域を強調表示し、矢印アイコンを選択してワームと凝集体の両方の長さを測定します。目的のオブジェクトにカーソルを合わせると、画面の下部に表示される強度の値が表示されます。CellProfiler画像解析パイプラインを利用するには、公式WebサイトからCellProfilerをダウンロードした後、テキスト原稿の説明に従って画像ペアに適切な名前を付けます。パイプラインをダウンロードし、ファイル、インポート、およびファイルからのパイプラインを選択して、CellProfiler にアップロードします。もつれのないワームモジュールを選択して設定を開き、もつれのないワームモジュール内のワームを識別するために使用されるトレーニングセットをロードします。次に、トレーニングセットのファイル名を特定します。ファイルのアップロードアイコンを選択し、補足ファイルもアップロードします。左上隅にある画像モジュールを選択して、画像をアップロードします。そして、適切な名前の画像をドラッグアンドドロップします。画像を分析する前に、プログラムの左下隅近くにある出力設定ボタンをクリックして、結果を保存するために使用される目的の出力フォルダを選択します。次に、デフォルトの出力の右側にあるフォルダアイコンを選択して、目的の出力場所を選択します。[画像の分析] アイコンを選択して、画像分析を開始します。分析の完了に時間がかかりすぎて、1 つのイメージの処理が停止している場合は、実行を中止し、出力フォルダーを並べ替えて、見つからないイメージ名を書き留めて、未処理のイメージを識別します。完全な分析の後、ソフトウェアは、列Nの個々のワームと列K.Downloadの集計のそれぞれの数を含むExcelスプレッドシートに結果を整理し、CellProfilerからの出力CSVファイルからのデータを便利に整理します。Windows OSの場合は、ダウンロードしたファイルを見つけて目的の場所に解凍します。gui_Windowsos_64xという名前の抽出されたフォルダーを見つけて開きます。GUIアプリケーションアイコンをクリックしてアプリケーションを起動します。実行の許可を要求するプロンプトが開くことがあります。詳細情報を選択し、[実行]をクリックします。これで、メタデータ オーガナイザーは、CellProfiler 出力 CSV ファイルをドラッグ アンド ドロップする準備ができました。Mac OS の場合は、ダウンロードしたファイルを見つけて、ファイル・メタデータ・オーガナイザー・アプリケーション・ファイルを抽出します。ダウンロードで見つかった抽出されたフォルダを開きます。GUIアプリケーションを右クリックし、[開く]を選択します。公式ライセンスがないために、開く許可を求めるプロンプトが表示されます。[開く] を選択します。メタデータオーガナイザーアプリケーションがそれぞれのOSで開いたら、ここにファイルをアップロードするか、目的のCellProfiler CSVファイルをドラッグアンドドロップします。整理ボタンをクリックすると、ファイルのダウンロードボタンで新しい画面にユーザーが表示されます。ボタンをクリックして、出力ファイルを保存する場所を選択します。出力ファイルは、ファイル名に拡張子が追加された元のファイル名_organized表示されます。FUDRの存在下では、様々な細菌を与えられたワームは、より均一な正確なワーム検出を可能にし、したがって過密の問題を解決する、より一貫した体の大きさを有していた。ワームを凍結すると、バックグラウンド蛍光を排除することでpolyQ凝集体検出が向上し、手動カウントに匹敵する自動カウントの精度が向上しました。反転明視野照明は、polyQ YFP凝集体を画像化するためにC.elegansおよびGFPチャネル全体を検出するために使用した。各ワームのワーム検出、もつれの解除、および凝集の定量化は、最適化されたCellProfiler画像処理パイプラインを適用して行われ、個々のワームあたりの凝集体数を取得できます。自動凝集定量とCellProfilerパイプラインの使用の有効性の差は最小限であり、自動化された方法を大規模なスクリーンに適用できることを示しています。試験した90の細菌株のうち、1つの候補によるC.elegans腸のコロニー形成は、凝集体の数の有意な減少を示した。手動計数による確認実験により、凝集体の数を有意に減少させたものを含む変異体のいずれもpolyQ凝集に影響しないことが明らかになった。このフレームワークを使用することを決めた研究者は、概説されている手順が絶対的ではないことを理解する必要があります。CellProfiler の操作方法の変更と基本的な理解は、成功に不可欠です。ウェスタンブロッティングなどの追加の生化学的アプローチを使用して、polyQ凝集を確認することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列<em&gt;その場で</emPNAプローブのある&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

の栽培<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;ラボにおける三次元で

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

結合されたヌクレオチドおよび線虫のタンパク質抽出

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

そのまま線虫の酸素消費量の測定

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

カエノハブディティス・エレガンスにおける組織特異的プロテオスタティック低下の定量化

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...