Automatisera aggregatkvantifiering i Caenorhabditis elegans

Ett enkelt tillvägagångssätt togs för att övervaka förändringar i proteostas genom att bedöma polyglutaminaggregering och tillhandahålla ett ramverk som kan användas för applikationer med hög genomströmning. Att göra en fenotyp som antalet aggregat av jag kan bli subjektivt. Automatisering av aggregaträkning gör att vi kan eliminera sådan bias, öka genomströmningen och reproducerbarheten.

Denna metod hjälper till att identifiera bakteriegener som bidrar till störning av värdproteostas. Att förstå enskilda bakteriegeners bidrag hjälper oss att förstå dess implikation i patogenesen av sjukdomar som Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons. Börja med att ta bort plattorna som innehåller maskar från frysen och låt dem tina vid rumstemperatur.

Torka sedan bort överflödig kondens och ta bort locket före avbildning. Använd mikroskopinställningarna med exponeringstid 500 millisekunder, förstoring på 40 X med 0,63 X kameraadapter och GFP-intensitet inställd på 100 % under bildtagning. Justera nu de överförda ljuskontrollerna tills maskarna verkar starkt upplysta i jämförelse med den mörka bakgrunden, vilket undviker överexponering.

Ändra maskarnas positioner i brunnen för att förhindra överdriven klumpning genom att använda en 10 mikroliterpipettspets för att försiktigt trycka maskar till önskat läge. Ställ in kanalen på GFP-filter för att upprätta ett fokalplan för båda bilderna. Fånga en ljus fältbild.

Ta en motsvarande fluorescensbild utan att störa plattan eller ändra mikroskopets fokus. Nu för att bedöma bilderna, ladda först ner CellProfiler. Öppna programvaran och dra och släpp bilderna av intresse i bildrutan.

Klicka på bilderna i fillistan för att öppna dem. Välj förstoringsglaset för att markera ett område av intresse och pilikonen för att mäta längden på både maskar och aggregat. Håll muspekaren över önskat objekt för att bestämma dess intensitetsvärde, vilket kan ses på den nedre delen av skärmen.

För att använda CellProfiler-bildanalyspipelinen, namnge bildparen ordentligt enligt beskrivningen i textmanuskriptet efter att ha laddat ner CellProfiler från den officiella webbplatsen. Ladda ned pipelinen och ladda upp den till CellProfiler genom att välja fil, import och pipeline från fil. Välj modulen untangled worms för att öppna dess inställningar för att läsa in en träningsuppsättning som används för att identifiera maskar i modulen untangled worms.

Identifiera sedan filnamnet för träningsuppsättningen. Välj ikonen för uppladdningsfil och ladda upp den kompletterande filen också. Ladda upp bilder genom att välja bildmodulen i det övre vänstra hörnet.

Och dra och släpp sedan korrekt namngivna bilder. Innan du analyserar bilderna väljer du önskad utmatningsmapp som ska användas för att lagra resultaten genom att klicka på knappen för utgångsinställningar som finns nära programmets nedre vänstra hörn. Välj sedan mappikonen till höger om standardutgången för att välja önskad utmatningsplats.

Välj ikonen analysera bilder för att påbörja bildanalysen. Om analysen tar för lång tid att slutföra och har fastnat i bearbetningen av en enda bild avbryter du körningen och identifierar den obearbetade bilden genom att sortera i utdatamappen och notera vilket bildnamn som inte hittas. Efter fullständig analys kommer programvaran att organisera resultaten i ett Excel-kalkylblad som innehåller enskilda maskar i kolumn N och respektive antal aggregat i kolumn K.Ladda ner metadataorganisatören för att bekvämt organisera data från den utgående CSV-filen från CellProfiler.

För Windows OS, leta reda på den nedladdade filen och extrahera den till önskad plats. Leta reda på och öppna den extraherade mappen med namnet gui_Windowsos_64x. Och starta programmet genom att klicka på GUI-applikationsikonen.

En prompt kan öppnas och begära tillstånd att köra. Välj mer info och klicka sedan på kör ändå. Metadataorganisatören är nu redo att dra och släppa CellProfiler-utdata CSV-filer.

För Mac OS letar du reda på den nedladdade filen och extraherar programfilen för filmetadataorganisatör. Öppna den extraherade mappen som finns i nedladdningar. Högerklicka på GUI-applikationen och välj öppna.

En uppmaning visas som ber om tillstånd att öppna på grund av bristen på en officiell licens. Välj öppna. När din metadataarrangörsapplikation är öppen i respektive operativsystem klickar du på ladda upp dina filer här eller drar och släpper önskade CellProfiler CSV-filer.

Klicka på organiseringsknappen, som tar användaren till en ny skärm med en nedladdningsfilknapp. Klicka på knappen och välj önskad plats för att spara utdatafilen. Utdatafilen visas som det ursprungliga filnamnet med _organized tillägg som läggs till i filnamnet.

I närvaro av FUDR hade maskar som matades med olika bakterier en mer konsekvent kroppsstorlek som möjliggjorde mer enhetlig och exakt maskdetektering, vilket löste problemet med överbeläggning. Frysning av maskarna förbättrade polyQ-aggregatdetekteringen genom att eliminera bakgrundsfluorescensen, liksom noggrannheten i automatiserad räkning jämförbar med manuell räkning. Inverterad ljusfältsbelysning användes för att detektera hela C.elegans- och GFP-kanalen för att avbilda polyQ YFP-aggregat.

Maskdetektering, lossning och aggregerad kvantifiering för varje mask gjordes genom att tillämpa en optimerad CellProfiler-bildbehandlingspipeline, vilket gör det möjligt att erhålla antalet aggregat per enskild mask. Skillnaden mellan effekten av automatiserad aggregerad kvantifiering och genom att använda CellProfiler-pipelinen var minimal, vilket indikerar att den automatiserade metoden kan tillämpas på storskaliga skärmar. Av 90 testade bakteriestammar visade kolonisering av C.elegans tarm med en kandidat en signifikant minskning av antalet aggregat.

Bekräftelseexperimenten genom manuell räkning avslöjade att ingen av mutanterna, inklusive den som signifikant minskade antalet aggregat påverkade polyQ-aggregeringen. Forskare som bestämmer sig för att använda detta ramverk bör förstå att de steg som beskrivs inte är absoluta. Modifiering och en grundläggande förståelse för hur man manipulerar CellProfiler är avgörande för framgång.

Ytterligare biokemiska metoder som western blotting kan användas för att bekräfta polyQ-aggregering.