Name: automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) och Infectious Diseases Society of America finansiering till DMC. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet. Vi tackar medlemmarna i Czyz Lab för korrekturläsning av manuskriptet. Tecknade figurer genererades med BioRender betald licens.

<ol>
	<li>Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+the+role+of+protein+misfolding+in+neurodegenerative+diseases.">Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).</li><li>Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+as+a+modifier+of+neurodegenerative+disease+risk.">The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk.</a> Cell Host &amp; Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).</li><li>Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Our+gut+microbiome:+The+evolving+inner+self.">Our gut microbiome: The evolving inner self.</a> Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).</li><li>Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+understanding+the+role+of+the+gut+microbiota+in+brain+health+and+disease.">Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7 (1), 13023 (2016).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1003466 (2013).</li><li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network.">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).</li><li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Walker, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+with+human+enteric+bacterial+pathogens+leads+to+proteostasis+disruption+that+is+rescued+by+butyrate.">Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate.</a> PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510 (2021).</li><li>Goya, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Bacillus+subtilis+protects+against+&#945;-Synuclein+aggregation+in+C.+elegans.">Probiotic Bacillus subtilis protects against &#945;-Synuclein aggregation in C. elegans.</a> Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).</li><li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans.">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337 (2017).</li><li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins.">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).</li><li>Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+the+heat+shock+response+modulate+protein+homeostasis+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine+during+infection.">Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WorMachine:+machine+learning-based+phenotypic+analysis+tool+for+worms.">WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms.</a> BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 482 (2008).</li><li>Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-verified+two-allele+transposon+mutant+library+for+Pseudomona+aeruginosa+PA01.">Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).</li><li>Schulenburg, H., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+pathogen+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li><li>Haldimann, P., Muriset, M., V&#237;gh, L., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+hydroxylamine+derivative+ng-094+suppresses+polyglutamine+protein+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans.">The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).</li><li>Shinn-Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wrapping+culture+plates+with+Parafilm+M&#174;+increases+Caenorhabditis+elegans+growth.">Wrapping culture plates with Parafilm M&#174; increases Caenorhabditis elegans growth.</a> BMC Research Notes. 12 (1), (2019).</li><li>Alexander-Floyd, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+cell+type-dependent+effects+of+autophagy+on+polyglutamine+aggregation+revealed+by+natural+genetic+variation+in+C.+elegans.">Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans.</a> BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery.">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li></ol>

Författarna har förklarat att inga intressekonflikter föreligger.

Det beskrivna protokollet beskriver procedurer för C. elegans odling, avbildning och bildbehandling som innehåller CellProfiler, en programvara för bildanalys med öppen källkod. De representativa resultaten visar reproducerbarhet, minskning av bias och skalbarhet. Detta standardiserade förfarande kommer att förbättra screeningstrategier som används med stora bakterie-, genom- eller läkemedelsbibliotek. Medan andra automatiserade C. elegans-metoder för objektdetektering finns, erbjuder den beskrivna tekniken en standardiserad pipeline med högre genomströmning som integrerar odling, bildförvärv och analys.
Flera varianter av maskodling måste testas för att optimera protokollet som beskrivs häri. Ursprungligen överfördes maskar till provbakterier omedelbart efter ålderssynkronisering (L1-steg). Ett sådant tillvägagångssätt resulterade emellertid i en population av maskar med varierande storlekar, även bland maskar inom samma brunn. C. elegans är kända för att undvikapatogener 19, vilket kan ha bidragit till den observerade variationen i storlek och i slutändan påverka nedströms avbildningsmaskdetektering, i synnerhet. För att eliminera sådan variation täcktes hela NGM-området i varje brunn med testbakterier. Dessutom utfodrades maskar med E. coli OP50 och tilläts utvecklas fullt ut till unga vuxna i 48 timmar vid 25 °C. Att låta maskar nå vuxen ålder på E. coli OP50 innan de överfördes till testbakterier resulterade i en mer konsekvent kroppsstorlek. Dessutom eliminerades överbeläggning och snabb matutarmning av avkomma genom att komplettera NGM-agar med FUDR. Implementeringen av FUDR tog bort avkomma och förbättrade automatiserad maskidentifiering, som doldes av avkomma som blandades med föräldrapopulationen. Det är dock viktigt att vara försiktig och använda lämpliga kontroller när du använder FUDR, eftersom föreningen är känd för att påverka C. elegans proteostas och livslängd20,21. Under de förhållanden som beskrivs i detta protokoll påverkade FUDR inte intestinal polyQ-aggregering (kompletterande figur 5); därför var dess användning lämplig och fördelaktig för den beskrivna metoden.
Frysning av prover före avbildning visade sig vara ett kritiskt steg i en framgångsrik anställning av rörledningen. Det sammanlagda antalet före frysningen var betydligt högre än det manuella antalet (figur 3B). Att hålla maskar vid -20 °C i 18-48 timmar före avbildning minskade bakgrundsfluorescensen och i slutändan förbättrade aggregatdetekteringen (figur 3A). Effekterna av frysning på aggregerad detektion har endast undersökts för polyQ och bör inte generaliseras till andra modeller utan ytterligare undersökning av sådana effekter.
Trots att alla förhållanden hölls desamma observerades att det genomsnittliga antalet aggregat per mask kunde variera mellan olika körningar, medan förhållandet mellan antalet aggregat hos djur som koloniserades med OP50 jämfört med MPAO1 förblev konsekvent (figur 6, kompletterande figur 2, kompletterande figur 5). Därför är det viktigt att alltid inkludera E. coli OP50-kontroll, eller eventuella ytterligare lämpliga referenskontroller, i varje körning. Sådan variation i aggregerat antal mellan experiment kan påverkas av miljöförhållanden (temperatur, fuktighet)22,23 eller genetisk bakgrund8. Faktum är att det observerades att efter långvarig odling minskade tarmfluorescensen drastiskt eller förlorades helt, vilket krävde upptining av en ny stam från fruset lager. Den observerade minskningen av fluorescens kan vara ett resultat av genetiska förändringar som undertrycker toxiska transgener, såsom de som uttrycker polyQ. Icke desto mindre betonar den exceptionella reproducerbarheten av de resultat som observerats mellan olika experimenter (kompletterande figur 2), mellan biologiska replikat (figur 5) och inom samma prov (kompletterande figur 3) styrkan i detta tillvägagångssätt.
Många rapporter har använt intestinal polyQ för att studera proteostas 9,11,12,13,24,25. En direkt jämförelse mellan resultat kan dock inte göras på grund av variation mellan experimentella tillvägagångssätt och avläsningsmetoder. Icke desto mindre rekapituleras några resultat från tidigare publicerade data av den automatiserade kvantifiering som beskrivs häri, inklusive bakteriell induktion av aggregering 9,13 och ett jämförbart antal aggregat11. Sammantaget erbjuder den beskrivna pipelinen ett värdefullt verktyg för att studera proteostas.
Metoden som beskrivs häri har vissa inneboende utmaningar. Det tar till exempel tillräckligt med tid för att behärska alla komponenter i detta protokoll, vilket särskilt gäller för avsnitt 8 i protokollet, vilket kräver förtrogenhet med analysen för att avgöra om de förvärvade bilderna är lämpliga för pipelineanalys. Avvikelser från de bildförvärvsinställningar som används i detta protokoll är möjliga; det kommer dock sannolikt att krävas ändring av inställningarna och maskträningsuppsättningen. Denna pipeline kan skilja aggregat av olika storlekar och de som berör, vilket begränsar "blandning" av aggregat och i slutändan ökar detekteringskänsligheten. Problem kan dock uppstå när du försöker identifiera stora aggregat som överskrider det accepterade storleksintervallet, eftersom utvidgning av den övre storlekströskeln kan leda till fel som orsakas av dålig identifiering, till exempel oförmågan att skilja aggregat som berör. En balans mellan noggrannhet, storlek och intensitet måste hittas före bildanalysen. Effektiviteten för aggregerad identifiering kan förbättras ytterligare genom att införliva maskininlärning för att skapa ett neuralt nätverk som kan förbättra aggregatdetektering. Sådana förbättringar undersöks för närvarande och kommer i hög grad att hjälpa till att ta itu med aktuella frågor som detektering av aggregat som ligger på olika fokalplan eller som har onormala former.
En anmärkningsvärd svaghet med den beskrivna metoden är variationen i automatiserade aggregaträkningar, eftersom de inte alltid rekapituleras av manuella räkningar i maskar som matas med olika bakteriestammar. Till exempel, baserat på automatiserade räkningar, hade maskar som matades med P. aeruginosa mutant 53 (M53) signifikant färre aggregat jämfört med vildtypsstammen (MPAO1) (figur 7); Bekräftelsen av träffen visade dock ingen signifikant skillnad (kompletterande figur 4). I allmänhet har läkemedelsskärmar med hög genomströmning en hög frekvens av falskt positiv träffdetektering, och den beskrivna metoden är inget undantag26. Således är det en kritisk del av protokollet att bekräfta alla potentiella träffar.
Medan detta protokoll optimerades för att passa en screeningstrategi för att identifiera bakterier som påverkar värdproteostas, kan varje steg modifieras ytterligare för att testa effekten av genomiska RNAi-bibliotek, små molekyler eller andra tillstånd. Ytterligare ändringar kan göras vid varje steg för att passa kraven i en specifik screeningstrategi. Dessutom ger denna teknik en nivå av flexibilitet som möjliggör optimering av varje steg för att passa en specifik modell. Till exempel kan detta tillvägagångssätt utvidgas till polyQ-aggregering i andra vävnader eller extrahera andra funktioner som detekteras i bilder, såsom övervakning av genuttryck med hjälp av inducerbara fluorescerande reportrar (t.ex. värmechockgener), bedömning av subcellulär lokalisering av proteiner (t.ex. kärnlokalisering av DAF-16), studier av aggregering i andra sjukdomsmodeller (Aβ1-42, α-synuklein, TDP-43, etc.) eller bedömning av fysiologiska fenotyper, såsom maskstorlek.

Åldersberoende neurodegenerativa proteinkonformationssjukdomar (PCD) såsom Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdomar, eller amyotrofisk lateralskleros, kännetecknas av felveckning av protein som leder till aggregering, celldöd och vävnadsdegenerering1. Medan proteinfelveckning erkänns som den skyldige, är etiologin för dessa sjukdomar inte klar. Som sådan har utvecklingen av effektiva terapier hindrats av bristen på kunskap om de faktorer och tillstånd som bidrar till sjukdomsdebut och progression. Nya studier tyder på att förändringar i mikrobiomet påverkar uppkomsten, progressionen och svårighetsgraden av PCD 2,3,4. Komplexiteten hos det mänskliga, eller till och med murina, mikrobiomet gör det emellertid svårt att genomföra studier som skulle avslöja mikrobernas exakta inflytande på deras värd. Därför används enklare organismer, såsom Caenorhabditis elegans, ofta som ett upptäcktsverktyg 5,6,7,8. Nyligen genomförda studier har använt C. elegans för att undersöka effekten av bakterier på värdproteostas och sjukdomspatogenes 9,10. Bakteriell kolonisering, hormesis och genomiska förändringar är bland exemplifierande förhållanden som påverkar aggregeringen av polyglutamin (polyQ) kanaler 9,11,12. Dessutom uppvisar dessa felveckade proteinkluster polyQ-längd- och åldersberoende ackumulering inom värden och är associerade med nedsatt rörlighet 9,13. Det relativt enkla tillvägagångssättet att kvantifiera fluorescerande märkt puncta kan generera viktiga data om förhållanden, faktorer eller läkemedel som påverkar proteinveckning och aggregering.
Även om kvantifiering av fluorescerande puncta har visat sig vara ett tillförlitligt och relativt enkelt förfarande, återstår utmaningen att utveckla ett protokoll som skulle underlätta storskalig screening av föreningar, bakterier eller tillstånd som påverkar proteinaggregering. Konceptet automatiserad C. elegans bildbehandling och punctakvantifiering är inte helt nytt, eftersom ett antal praktiska stödverktyg har utvecklats14,15. Integrationen av odling, bildförvärv och en bearbetningspipeline är dock avgörande för att eliminera variationer i resultat och möjliggöra skärmar med högre genomströmning.
Som sådan är avsikten med detta manuskript att standardisera proceduren som används för att kvantifiera polyQ-aggregering i C. elegans som en proxy för att upptäcka förändringar i proteostas. Denna uppgift uppnåddes genom att använda CellProfiler, en programvara för bildanalys med öppen källkod16 som kan automatisera mask- och aggregatidentifiering, och är integrerad i ett större protokoll för odling av maskar, förvärv av bilder och bearbetning av data.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#24-282</td>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipettes</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#12-104</td>
			<td>Plastic pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes, Racked</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>Cat#28-101</td>
			<td>Conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D2235100MG</td>
			<td>FUDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet Pro Pipette Controller</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>91-600RB</td>
			<td>Pipette gun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#BP1423-2</td>
			<td>Granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Graphical figure generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (Regular)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>Bar# 044600324111, Splash-less Bleach</td>
			<td>4.5% sodium hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM140, Q35::YFP</td>
			<td>Muscle polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)]</td>
			<td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td>
			<td>AM738, Q44::YFP</td>
			<td>Intestinal polyQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#C79-500</td>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#ICN10138201</td>
			<td>Cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating Water Bath Head</td>
			<td>Lauda</td>
			<td>26LE</td>
			<td>Lauda E 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>8114931</td>
			<td>Fluorescent light control and emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL Culture Tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td>Culture tubes, 17 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>E. coli control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450910</td>
			<td>Eyepiece set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Set ET GFP - MZ10F</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450588</td>
			<td>Filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v9.2.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Incubator IMP180</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51031562</td>
			<td>Refrigerated incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4000</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1192-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K5 Camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td>Stereomicroscope camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2P04</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#P285-3</td>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Imaging Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ10 F Optics Carrier</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450103</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#0215522805</td>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (Lennox)</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>Cat#11-125</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-49S</td>
			<td>Stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14491</td>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>8205</td>
			<td>Single frosted microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S373-500</td>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S671-500</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#S318-3</td>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Achromat, f = 100 mm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10411597</td>
			<td>Objective microscope lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat#32-107G</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa Mutant Library</td>
			<td>Manoil Lab (University of Washington)</td>
			<td></td>
			<td>P. aeruginosa mutant library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-102</td>
			<td>Used for worm growth and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinocular Tube 100% M-series</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>ThermoFisher, Difco</td>
			<td>Cat#211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX-400 Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat#75003181</td>
			<td>Swing bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Driven Filter System</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>Cat#25-227</td>
			<td>500 mL, PES Membrane, .22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Objective with C-Mount</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447367</td>
			<td>0.63x camera adapter tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating aggregate quantification in caenorhabditis elegans

En ökning av förekomsten av neurodegenerativa proteinkonformationssjukdomar (PCD) har främjat ett stort intresse för detta ämne genom åren. Denna ökade uppmärksamhet har krävt diversifiering och förbättring av djurmodeller som kan reproducera sjukdomsfenotyper som observerats hos människor med PCD. Även om murina modeller har visat sig vara ovärderliga, är de dyra och är förknippade med mödosamma metoder med låg genomströmning. Användning av Caenorhabditis elegans nematodmodell för att studera PCD har motiverats av dess relativa enkla underhåll, låga kostnad och snabba generationstid, vilket möjliggör applikationer med hög genomströmning. Dessutom gör hög bevarande mellan C. elegans och mänskliga genom denna modell till ett ovärderligt upptäcktsverktyg. Nematoder som uttrycker fluorescerande taggade vävnadsspecifika polyglutamin (polyQ) -kanaler uppvisar ålders- och polyQ-längdberoende aggregering som kännetecknas av fluorescerande foci. Sådana reportrar används ofta som ombud för att övervaka förändringar i proteostas över vävnader. Manuell aggregerad kvantifiering är tidskrävande, vilket begränsar experimentell genomströmning. Dessutom kan manuell focikvantifiering införa bias, eftersom aggregerad identifiering kan vara mycket subjektiv. Häri standardiserades ett protokoll bestående av maskodling, bildförvärv och databehandling för att stödja aggregerad kvantifiering med hög genomströmning med C . elegans som uttrycker tarmspecifik polyQ. Genom att implementera en C. elegans-baserad bildbehandlingspipeline med CellProfiler, en bildanalysprogramvara, har denna metod optimerats för att separera och identifiera enskilda maskar och räkna upp deras respektive aggregat. Även om begreppet automatisering inte är helt unikt är behovet av att standardisera sådana procedurer för reproducerbarhet, eliminering av förspänning från manuell räkning och ökning av genomströmningen hög. Det förväntas att dessa metoder drastiskt kan förenkla screeningprocessen för stora bakterie-, genom- eller läkemedelsbibliotek med hjälp av C. elegans-modellen .

Watch this Scientific Journal Video about Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Följande protokoll beskriver utvecklingen och optimeringen av ett arbetsflöde med hög genomströmning för maskodling, fluorescensavbildning och automatiserad bildbehandling för att kvantifiera polyglutaminaggregat som en bedömning av förändringar i proteostas.

Automatisera aggregatkvantifiering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Ett enkelt tillvägagångssätt togs för att övervaka förändringar i proteostas genom att bedöma polyglutaminaggregering och tillhandahålla ett ramverk som kan användas för applikationer med hög genomströmning. Att göra en fenotyp som antalet aggregat av jag kan bli subjektivt. Automatisering av aggregaträkning gör att vi kan eliminera sådan bias, öka genomströmningen och reproducerbarheten.Denna metod hjälper till att identifiera bakteriegener som bidrar till störning av värdproteostas. Att förstå enskilda bakteriegeners bidrag hjälper oss att förstå dess implikation i patogenesen av sjukdomar som Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons. Börja med att ta bort plattorna som innehåller maskar från frysen och låt dem tina vid rumstemperatur.Torka sedan bort överflödig kondens och ta bort locket före avbildning. Använd mikroskopinställningarna med exponeringstid 500 millisekunder, förstoring på 40 X med 0,63 X kameraadapter och GFP-intensitet inställd på 100 % under bildtagning. Justera nu de överförda ljuskontrollerna tills maskarna verkar starkt upplysta i jämförelse med den mörka bakgrunden, vilket undviker överexponering.Ändra maskarnas positioner i brunnen för att förhindra överdriven klumpning genom att använda en 10 mikroliterpipettspets för att försiktigt trycka maskar till önskat läge. Ställ in kanalen på GFP-filter för att upprätta ett fokalplan för båda bilderna. Fånga en ljus fältbild.Ta en motsvarande fluorescensbild utan att störa plattan eller ändra mikroskopets fokus. Nu för att bedöma bilderna, ladda först ner CellProfiler. Öppna programvaran och dra och släpp bilderna av intresse i bildrutan.Klicka på bilderna i fillistan för att öppna dem. Välj förstoringsglaset för att markera ett område av intresse och pilikonen för att mäta längden på både maskar och aggregat. Håll muspekaren över önskat objekt för att bestämma dess intensitetsvärde, vilket kan ses på den nedre delen av skärmen.För att använda CellProfiler-bildanalyspipelinen, namnge bildparen ordentligt enligt beskrivningen i textmanuskriptet efter att ha laddat ner CellProfiler från den officiella webbplatsen. Ladda ned pipelinen och ladda upp den till CellProfiler genom att välja fil, import och pipeline från fil. Välj modulen untangled worms för att öppna dess inställningar för att läsa in en träningsuppsättning som används för att identifiera maskar i modulen untangled worms.Identifiera sedan filnamnet för träningsuppsättningen. Välj ikonen för uppladdningsfil och ladda upp den kompletterande filen också. Ladda upp bilder genom att välja bildmodulen i det övre vänstra hörnet.Och dra och släpp sedan korrekt namngivna bilder. Innan du analyserar bilderna väljer du önskad utmatningsmapp som ska användas för att lagra resultaten genom att klicka på knappen för utgångsinställningar som finns nära programmets nedre vänstra hörn. Välj sedan mappikonen till höger om standardutgången för att välja önskad utmatningsplats.Välj ikonen analysera bilder för att påbörja bildanalysen. Om analysen tar för lång tid att slutföra och har fastnat i bearbetningen av en enda bild avbryter du körningen och identifierar den obearbetade bilden genom att sortera i utdatamappen och notera vilket bildnamn som inte hittas. Efter fullständig analys kommer programvaran att organisera resultaten i ett Excel-kalkylblad som innehåller enskilda maskar i kolumn N och respektive antal aggregat i kolumn K.Ladda ner metadataorganisatören för att bekvämt organisera data från den utgående CSV-filen från CellProfiler.För Windows OS, leta reda på den nedladdade filen och extrahera den till önskad plats. Leta reda på och öppna den extraherade mappen med namnet gui_Windowsos_64x. Och starta programmet genom att klicka på GUI-applikationsikonen.En prompt kan öppnas och begära tillstånd att köra. Välj mer info och klicka sedan på kör ändå. Metadataorganisatören är nu redo att dra och släppa CellProfiler-utdata CSV-filer.För Mac OS letar du reda på den nedladdade filen och extraherar programfilen för filmetadataorganisatör. Öppna den extraherade mappen som finns i nedladdningar. Högerklicka på GUI-applikationen och välj öppna.En uppmaning visas som ber om tillstånd att öppna på grund av bristen på en officiell licens. Välj öppna. När din metadataarrangörsapplikation är öppen i respektive operativsystem klickar du på ladda upp dina filer här eller drar och släpper önskade CellProfiler CSV-filer.Klicka på organiseringsknappen, som tar användaren till en ny skärm med en nedladdningsfilknapp. Klicka på knappen och välj önskad plats för att spara utdatafilen. Utdatafilen visas som det ursprungliga filnamnet med _organized tillägg som läggs till i filnamnet.I närvaro av FUDR hade maskar som matades med olika bakterier en mer konsekvent kroppsstorlek som möjliggjorde mer enhetlig och exakt maskdetektering, vilket löste problemet med överbeläggning. Frysning av maskarna förbättrade polyQ-aggregatdetekteringen genom att eliminera bakgrundsfluorescensen, liksom noggrannheten i automatiserad räkning jämförbar med manuell räkning. Inverterad ljusfältsbelysning användes för att detektera hela C.elegans- och GFP-kanalen för att avbilda polyQ YFP-aggregat.Maskdetektering, lossning och aggregerad kvantifiering för varje mask gjordes genom att tillämpa en optimerad CellProfiler-bildbehandlingspipeline, vilket gör det möjligt att erhålla antalet aggregat per enskild mask. Skillnaden mellan effekten av automatiserad aggregerad kvantifiering och genom att använda CellProfiler-pipelinen var minimal, vilket indikerar att den automatiserade metoden kan tillämpas på storskaliga skärmar. Av 90 testade bakteriestammar visade kolonisering av C.elegans tarm med en kandidat en signifikant minskning av antalet aggregat.Bekräftelseexperimenten genom manuell räkning avslöjade att ingen av mutanterna, inklusive den som signifikant minskade antalet aggregat påverkade polyQ-aggregeringen. Forskare som bestämmer sig för att använda detta ramverk bör förstå att de steg som beskrivs inte är absoluta. Modifiering och en grundläggande förståelse för hur man manipulerar CellProfiler är avgörande för framgång.Ytterligare biokemiska metoder som western blotting kan användas för att bekräfta polyQ-aggregering.

Research

JoVE Journal

Biology

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolering och In vitro Aktivering av Caenorhabditis elegans Spermier

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-baserade dietrestriktioner i Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraktion och analys i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation och kvantifiering av Telomer och repetitiva sekvenser användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH) med PNA prober<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

odling av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Kombinerade nukleotid och Protein extraktioner i Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mätning av syre förbrukning i intakt Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kvantifiering av vävnadsspecifik proteostatisk nedgång i caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...