De grootte van lipide nanodeeltjes beïnvloedt de biodistributie, het antitumoreffect en de genuitschakelingsprestaties. Daarom is de LNP-groottecontrolemethode een effectieve techniek voor het produceren van nanogeneesmiddelen, waaronder RNA-afgiftesystemen. Dit originele microfluïdische apparaat, het iLiNP-apparaat genaamd, was in staat om de LNP-grootte variërend van 20 tot 100 nanometer met intervallen van 10 nanometer te regelen.
Het iLiNP-apparaat kan niet alleen siRNA-geladen LNP's produceren, maar ook alle mRNA-geladen LNPS en ribonucleoproteïne geladen LNP's. Neem om te beginnen de lipide-ethanoloplossingen en produceer de siRNA-geladen LNP's door DOTAP-, DSPC-, cholesterol- en DMG-PEG2k-oplossingen te mengen in een molaire verhouding van 50 tot 10 tot 38,5 tot 1,5. Pas de totale lipideconcentratie aan op acht millimolar.
Neem vervolgens de waterige oplossingen van 154 millimolar zoutoplossing en 25 millimolar acetaatbuffer bij pH 4 en filter ze door 0,2 micrometer membraanfilters of spuitfilters. Bereid de siRNA-bufferoplossing door 70 microgram siGL4 op te lossen in één milliliter 25 millimolaire acetaatbuffer. Vul glazen spuiten van één milliliter met respectievelijk lipide- en waterige oplossingen.
Sluit de glazen spuiten aan op de piekcapillaris met behulp van spuitconnectoren, stel vervolgens het debiet van de lipide- en waterige oplossingen in en introduceer de lipide- en waterige oplossingen afzonderlijk in het iLiNP-apparaat met behulp van spuitpompen. Verzamel de LNP-suspensies in een microbuis uit de uitlaat van het iLiNP-apparaat. Dialyseer de LNP-suspensie met behulp van een dialysemembraan van 12 tot 14 kiloDalton moleculaire gewichtsafsnijdingen bij vier graden Celsius 's nachts tegen zoutoplossing of DPBS voor respectievelijk POPC LNP's en siRNA-geladen LNP's.
Verzamel de gedialyseerde LNP-suspensies in microbuisjes en pipetteer vervolgens 20 tot 30 microliter van de LNP-suspensie naar een microkwartscel. Meet ten slotte de LNP-grootte, LNP-grootteverdeling en polydispersiteitsindex door dynamische lichtverstrooiing. POPC LNP-grootteverdeling geproduceerd bij verschillende stroomomstandigheden, zoals het totale debiet en de stroomsnelheidsverhoudingen worden hier weergegeven.
Nauwkeurige LNP-maten variërend van 20 tot 100 nanometer kunnen worden geregeld met behulp van dit iLiNP-apparaat. Kleine LNP's worden gevormd bij hoge totale stroomsnelheidsomstandigheden. Bovendien zijn de LNP-maten die bij de FRR 5 worden gevormd kleiner dan die van de FRR 3, ongeacht het totale debiet.
De grootteverdeling van siRNA-geladen LNP's wordt hier weergegeven. siRNA's worden ingekapseld in de LNP's door elektrostatische interactie tussen het kationische lipide DOTAP en de negatief geladen siRNA's. Het iLiNP-apparaat produceerde 90 nanometer siRNA geladen kationische LNP's met een smalle verdeling.
De siRNA-inkapselingsefficiëntie was 95% vanwege de elektrostatische interactie tussen het kationische lipide en de negatief geladen siRNA's. Cytotoxiciteit en de gen-uitschakelingsactiviteit van de 19 nanometer siRNA geladen LNP's werden geëvalueerd. siRNA geladen LNP's vertoonden cytotoxiciteit bij een dosis van 10 tot 100 nanomolair siRNA.
Het expressieniveau van luciferase was verlaagd afhankelijk van de siRNA-concentratie. De siRNA geladen LNP's onderdrukten 80% luciferase expressie bij een dosis van 100 nanomolaire siRNA. Optimalisaties van de flowcondities zijn de belangrijkste stappen in het protocol om de gewenste grootte LNP's te verkrijgen.
De op microfluïdische basis gebaseerde LNP-productiemethode inclusief het iLiNP-apparaat vereist geen ingewikkelde procedure en zal naar verwachting worden gebruikt als de standaard LNP-productiemethode.
