Name: sample preparation for computed tomography-based three-dimensional visualization of murine hind-limb vessels
Uploaded: 2021-10-07T14:30:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels at JoVE.com

אנו מודים ליסויו קימורה, מגומי נגהירו וסאקו טוקונאגה על התמיכה הטכנית המצוינת בניסויים בבעלי חיים.

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קומאמוטו (התייחסות לאישור לא. M30-040/A2020-105), התואמים את מדריך המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסום מס '85-23, מתוקן 2011).
1. הכנה
<ol><li>הכן את מנגנון הזלוף ואת מאגר vasodilator (4 מ"ג / L פפברין הידרוכלוריד, 4 g / L; אדנוזין, 1 g / L; הפרין, 1 U / mL מלוחים חוצצי פוספט (PBS)). הערה: מכשיר ריפלוקס ורייאגנטים מרחיבי כלי דם זהים לאלה שדווחו על ידי Weyers et al.5.</li>
	<li>חברו את הצנתר 22 G, צינור מאריך 2 מ"ל ו-stopcock תלת-כיווני (איור 1A). הערה: התאם את המד בהתאם לגודל החיה. עבור עכברי C57BL/6 בוגרים, 22 גרם הוא אופטימלי.</li>
	<li>מלאו את מנגנון זלוף הלחץ במאגר מרחיב כלי הדם (איור 1A). הערה: הימנעו מהיווצרות בועות כדי למנוע הפרעה במילוי המדיום הניגודי.</li>
</ol>2. זלוף
<ol><li>הזרקו 1 U/g הפרין ב-PBS לחלל הפנימי 30 דקות לפני הניתוח.</li>
	<li>להרדים לחלוטין את העכבר עם איזופלוריין ולהמית אותו על ידי נקע צוואר הרחם.</li>
	<li>לאחר עריפת הראש, לעשות חתך קו האמצע בעצם החזה ולתקן את בית החזה הפתוח עם סיכות. הערה: כדי למנוע דליפה של הניגודיות, הימנע מפגיעה בסרעפת.</li>
	<li>חותכים את אבי העורקים העולה ומסירים את הלב.</li>
	<li>הסר את הריאה ולחשוף את אבי העורקים היורד. הערה: אין לפגוע באבי העורקים היורד.</li>
	<li>חותכים את אבי העורקים היורד באלכסון כדי לחשוף את חתך הרוחב (איור 1B). הערה: אין לקלף את אבי העורקים; מקטע אלכסוני עדיף להכנסת קטטר.</li>
	<li>הכנס את הצנתר 22 G לתוך אבי העורקים היורד תוך הפעלת מאגר vasodilation. הערה: החדרת הצנתר בעת הפעלת מאגר vasodilation מונעת זיהום אוויר.</li>
	<li>הצמד את שורש הצנתר (איור 1C).</li>
	<li>צור קשר כדי למנוע דליפה עקב זרימה אחורית.</li>
	<li>יש לפזר תמיסה מחוממת של כלי דם (פפברין הידרוכלוריד, 4 גרם/ל'; אדנוזין, 1 ז/ל'; הפרין, 1 U/mL) למשך 3 דקות בלחץ קבוע בין 13 ל-15 kPa.</li>
	<li>Perfuse פתרון של 4% paraformaldehyde ב (PBS) במשך 3 דקות. הערה: את הצלחת הקיבעון ניתן לאשר על ידי תנועת כף הרגל (איור 1D).</li>
	<li>הכינו את מדיום הניגודיות ממש לפני הזלוף. הערה: התאם את קצב הדילול בהתאם למדגם; עבור עכברים בוגרים, לערבב את הכתם ודילול ביחס של 1:1.</li>
	<li>עצרו את הזלוף ומלאו את צינור ההרחבה ב-2 מ"ל של מדיום ניגודיות מדולל (איור 1E). הערה: יש להזריק את המדיום הניגודי לאט כדי למנוע פגיעה בכלי הדם.</li>
	<li>יש לפזר את מדיום הניגודיות בלחץ קבוע בין 13 ל-15 kPa.<ol>
<li>כדי לדמיין עורקים, בדקו את הציפורן כדי לוודא שמדיום הניגודיות הגיע לעורק (איור 1F).</li>
		<li>כדי לדמיין את כל כלי הדם, בדוק את הווריד התחתון של הסרעפת כדי לאשר מחזור מלא של מדיום הניגודיות. הערה: בהתחלה, הניגודיות מכילה את פתרון vasodilating; לפיכך, זרימת הדם הנכונה שלה היא חיונית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סגרו את העצירה התלת-כיוונית והסירו את הצינור (איור 1G). הערה: אם העצירה התלת-כיוונית אינה סגורה, החדות תזרום אחורה.</li>
	<li>לדגור על המדגם לילה ב 4 °C (5 °F).F.</li>
	<li>הסר את העור ולתקן אותו בתמיסת פורמלדהיד 10%.</li>
</ol>3. הדמיה
הערה: פרוטוקולי התצוגה החזותית משתנים בהתאם לסורק ה- CT. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בסורק CT רנטגן מיקרופוקוס. יש צורך לייעל את שיטת ההדמיה על פי כל סורק CT.
<ol><li>תקן את המדגם בצינור 50 מ"ל המכיל PBS.</li>
	<li>הנח את צינור הדגימה על השולחן.</li>
	<li>סרוק את הדגימה עם מתח של 50 kV וזרם של 600 μA, מה שמבטיח מרחק מיקוד למרכז של 75.2 מ"מ. הערה: ממד של 1 voxel היה 28.7 מיקרומטר x 28.7 מיקרומטר x 28.7 מיקרומטר בהגדרה זו.</li>
	<li>טען את נתוני התמונה שנרכשו באמצעות פיג'י, פלטפורמת קוד פתוח לניתוח תמונה ביולוגית.</li>
	<li>לקבוע את ערך voxel שריר באמצעות שריר gastrocnemius.<ol>
<li>בחר את שריר gastrocnemius באמצעות הכלי מלבן .</li>
		<li>בדוק את הממוצע ואת סטיית התקן (SD) מההיסטוגרמה (לנתח | היסטוגרמה).</li>
		<li>הגדר את צפיפות voxel שרירים כממוצע + 2SD של שריר gastrocnemius.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את צפיפות voxel השריר כרמת הסף התחתונה (תמונה | להתאים | | סף הגדר | רמת סף נמוכה יותר). הערה: אזור כלי הדם ואזור העצם נשארים בנתונים הבינוניים לאחר קביעת הסף.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual Review of Medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).</li><li>Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+perfusion+and+filling+of+mouse+coronary+vasculature+as+preparation+for+micro+computed+tomography+imaging.">Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).</li><li>Arima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+collateral+source+characteristics+with+3-dimensional+analysis+using+micro-X-ray+computed+tomography.">Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Fernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+liver+disease.">Angiogenesis in liver disease.</a> Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+pancreatic+cancer:+current+research+status+and+clinical+implications.">Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications.</a> Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

דו"ח זה מציג שיטה מתוחכמת לדמיין כלי דם בפלג הגוף התחתון. ישנם מספר שלבים קריטיים בתהליך זה: הראשון הוא preperfusion לפני הזרקת מדיום ניגודיות. אם לא יוסר מספיק דם, הניגודיות לא תמלא את המערכת. בנוסף, הכללת בועות אוויר מפריעה למילוי הניגודיות; לפיכך, יש להסיר לחלוטין את האוויר במעגל. יתר על כן, מכיוון שמדיום הניגודיות אינו מתמצק מיד לאחר ההזרקה, אין להזיז את המדגם יתר על המידה.
שיטה זו שימושית כדי להעריך את היווצרות מוגברת של כלי דם ומחזור הדם, כגון זרימת הדם בטחונות. לעומת זאת, כמגבלה, קשה להעריך כלי דם מצומצמים, שכן קשה להבחין בין היצרות לבין ירידה מלאכותית במדיום ניגודיות. בנוסף, זה מאתגר להעריך את כלי הדם בעצמות, כמו ההפרדה של דם ועצמות קשה.
שיטה חלופית להדמיה תלת-ממדית היא חיסון. באמצעות טכניקת ניקוי הרקמות, מספר שיטות זמינות עבור הדמיה 3D7. חיסון הוא יתרון כפי שהוא מאפשר כתמים של חלבונים ספציפיים באמצעות נוגדנים. דו"ח שנערך לאחרונה מאתגר הדמיה לכל הגוף בהתבסס על חיסון8; עם זאת, הדמיה מבוססת CT אינה דורשת טיפול מקדים לניקוי רקמות. 
שיטה זו מאפשרת הדמיה של כל כלי הדם מתחת לסרעפת, כולל איברי הבטן. אנגיוגנזה באיברי הבטן יש השפעה חזקה על שמירה על הומאוסטזיס ופיתוח מחלות9,10. כמו פרוטוקול זה היה מותאם להערכה של כלי הגפיים התחתונות, פרימינג ספציפי לאיברים יאפשר הדמיה של אנגיוגנזה הקשורים לכל גורם, כגון דלקת או גידולים.

כלי דם הם רשתות מורכבות עם מבנים דמויי עץ. אנגיוגנזה ויצירת כלי דם חדשים ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הומאוסטזיס איברים1. אנגיוגנזה מווסתת לטיפול במחלות איסכמיות וממאירות2. לכן חיוני להבין את המנגנונים הבסיסיים של אנגיוגנזה. כלי דם אחוריים מורין משמשים לעתים קרובות כמודל שימושי למחקר כלי דם3; קשירה ipsilateral של איליאק או עורק הירך הוא מודל איסכמיה אחורית ידועה המשמש להערכת אנגיוגנזה ושיפוץ כלי דם אנגיוגנזה פיזיולוגית ופתולוגית4. עם זאת, ההערכה של אנגיוגנזה מבוצעת בעיקר על ידי כתמי סעיף, ושיטות להערכת מורפולוגיה כלי דם 3D מוגבלות במיוחד.
בהשוואה לכתמי מקטעים, CT מאפשר הדמיה תלת-ממדית. לאחרונה, Weyers ואח ' דיווח פרוטוקול מתוחכם מתאים הדמיה CT, המאפשר הדמיה של מערכת הדם הכלילית למבוגרים murine5. שינינו את השיטה שלהם כדי ליצור שיטת הכנת מדגם המתאימה להדמיית CT של כלי הדם בגפיים התחתונות6. כאן, שרף אטום קרינה מוזרק דרך אבי העורקים היורד, וכלי הדם בגפיים התחתונות מלאים בצבע. על ידי התאמת הזמן של הזרקת צבע, מילוי ספציפי לעורקים אפשרי גם, ודגימות ניתן להשיג עם כל מכשיר טומוגרפיה ממוחשב מיקרו-רנטגן. שיטת ניגודיות זו מספקת טכניקה בסיסית להערכה תלת-ממדית של כלי דם מוריניים מתחת לסרעפת ובאברי הבטן ובגפיים התחתונות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin Solution</td>
			<td>Fujifilm-Wako</td>
			<td>068-03841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline (-) (PBS)</td>
			<td>Fujifilm-Wako</td>
			<td>163-25265</td>
			<td>Prepare 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G catheter (22 G S5 x 1&#34; V(F))</td>
			<td>MEDIKIT</td>
			<td>HP2140</td>
			<td>Only catheter is used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2325R</td>
			<td>Use as a pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Fujifilm-Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Suture with needle</td>
			<td>Alfresa Pharma Corporation</td>
			<td>ER1205SB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9251-5G</td>
			<td>For vasodilating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No.11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TOP</td>
			<td>X2-FL50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No.11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium 5,000 units/5 mL</td>
			<td>Mochida Co. Ltd.</td>
			<td>224122458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fujifilm-Wako</td>
			<td>099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil Injection Compounds</td>
			<td>Flow Tech Inc.</td>
			<td>MV-117</td>
			<td>Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papaverine hydrochloride</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>164-18002</td>
			<td>For vasodilating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Anesthetizer</td>
			<td>Muromachi Kikai Co. Ltd.</td>
			<td>MK-A100ecoW-ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors - Angled to Side</td>
			<td>FST</td>
			<td>No.15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>No.14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-way cock</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>TS-TR1K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>SAMCO SCIENTIFIC</td>
			<td>SM262-1S</td>
			<td>Use for mixing contrast medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray CT scanner</td>
			<td>Toshiba IT &#38; Control Systems Corporation</td>
			<td>TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for computed tomography-based three-dimensional visualization of murine hind-limb vessels

כלי הדם הם רשתות מורכבות עם מבנים דמויי עץ, ורשתות כלי דם חיוניות לשמירה על זרימת הדם ושמירה על תפקוד האיברים. הבהרת המנגנון של היווצרות כלי הדם היא אפוא שימושית ביותר להבהרת תהליכים התפתחותיים ומנגנונים פתולוגיים. כלי גב-גפיים מורין משמשים לעתים קרובות כמודל לאנגיוגנזה פיזיולוגית ופתולוגית. ההערכה מתבצעת בעיקר באמצעות שיטה דו-ממדית באמצעות מקטעי רקמות. עם זאת, שיטות להערכת מורפולוגיה כלי דם תלת מימדית (3D) מוגבלות במיוחד. מאמר זה מציג שיטה להדמיה של איברים אחוריים מוריניים באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת (CT). שרף אטום קרינה מוזרק דרך אבי העורקים היורד, וכלי דם שלמים מלאים בצבע. על ידי התאמת הזמן של הזרקת צבע, מילוי ספציפי לעורקים אפשרי גם, ודגימות ניתן להשיג עם כל מכשיר CT מיקרו-רנטגן. שיטת ניגודיות זו מספקת טכניקה בסיסית להערכה תלת-ממדית של כלי דם מוריניים בגפיים התחתונות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לדמיין את כל כלי הדם מתחת לסרעפת ולהעריך את כלי הדם באיברי הבטן.

ניתן לדמיין את כל כלי הדם בגפיים התחתונות אם פרוטוקול זה מבוצע כראוי (איור 2A). במודל איסכמיה של הגפיים האחוריות, עורק הירך הלא קשור פועל במקביל לווריד הירך (איור 2B), ועורק ירך קשור יכול להיות מאושר על ידי הפרעה של מדיה ניגודית (איור 2C). התוצאות חשפו התפתחות של כלי שיט נלווים (איור 2D). זרימת הדם הסביבתית נוצרת בין העורקים הפרוקסימליים לעורק הקשור ולעורק באזור הרגל התחתונה ובצדדים הגחוניים והגביים של עורק הירך. עורק העכוז התחתון המתחיל בצד הגבי של האגן ופועל בצד הרוחבי של הירך - מתרחב בחוזקה בצד האיסכמי.
כלים מלאים בניגודיות מלאים במדיום הניגודיות (איור 2E); ההפרעה בניגוד מצביעה על ערבוב של מדיה לא-קונטרסטית (למשל דם, מאגר מרחיב כלי דם או בועות) או זלוף לא מספיק של הניגודיות (איור 2F). Vasodilatation וקיבעון לא יעבוד טוב אם כלי הדם התכווצו. למרות שהדמיה CT יכולה רק לדמיין את המדיום הניגודי, ניתן לראות את העורקים על פני השטח של הגוף על ידי תצפית מקרוסקופית או סטריאומיקרוסקופית (איור 2G). לכן, קל יותר להעריך פגמים באמצעות המדיום הניגודי (איור 2H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63009/63009fig01.jpg"> איור 1: מתווה ההליך. (A) מנגנון זלוף לחץ וצנתר 22 G המחוברים באמצעות צינור מאריך 2 מ"ל ופסק זמן תלת-כיווני. (ב) אבי העורקים העולה נחתך באלכסון כדי לחשוף את חתך הרוחב (חץ צהוב). (ג) הצנתר תוקן באמצעות שני סיכות (חצים צהובים). (ד) הגפיים התחתונות הקבועות נמשכות על פי קיבעון (חצים צהובים). (ה) הזרקת ניגודיות דרך עצירה משולשת. כיוון ההזרקה מצוין על ידי חץ צהוב. (ו) הציפורן האחורית מלאה בניגודיות (חץ צהוב). (ז) העצירה סגורה ומוסרת ממנגנון הזלוף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63009/63009fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63009/63009fig02.jpg"> איור 2: תמונות של כלי שיט. (א) תמונה שלמה של העצמות והכלים האחוריים. (ב) עורק הירך (חץ אדום) וריד (חץ כחול). (ג) עורק הירך הכרוך (חץ צהוב). הפריפריה נקטעת על ידי החסימה (קו מנוקד צהוב). (ד) כלי נלווה בצד הכרוך (חצים צהובים). הקו המקווקו הצהוב מייצג את עורק הירך שנקטע. (ה) מדגם מלא היטב של העורק הספני (חץ אדום) וריד (חץ כחול). (ו) זלוף לקוי מוביל להפרעה של כלי סאפינוס (קו מנוקד צהוב). (ז) תצפית סטריאומיקרוסקופית של מדגם מייצג. עורק הירך הימני (חץ צהוב) מלא במדיום ניגודיות. (H) תצפית סטריאומיקרוסקופית של מדגם כושל. עורק הירך הימני (חץ צהוב) חסר בינוני ניגודיות. סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ (B-F), 2 מ"מ (G, H), 10 מ"מ (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63009/63009fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels at JoVE.com

Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה וכימות לכלי גפיים אחוריות של מורין באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו-רנטגן.

הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית מבוססת טומוגרפיה ממוחשבת של כלי דם הינדיים של מורין

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...

ניתן לצלם תמונות CT של כלי הדם בגפיים התחתונות ובאברי הבטן באמצעות פרוטוקול צעד. השיטה מאפשרת הערכה מקיפה של כל כלי הדם. בנוסף, ניתן להעריך רק עורקים או באותו זמן, עורקים ורידים.חשוב מאוד למנוע קרישי דם, דלף או דם היטב, ולהימנע בועות אוויר. לפני הניתוח, להזריק 1 יחידה / גרם הפרין ב- PBS לתוך החלל התוך-אפריטוני של העכבר. לאחר 30 דקות, לעשות חתך קו האמצע בעצם החזה של העכבר המתת חסד ולתקן את בית החזה הפתוח עם סיכות.חותכים את אבי העורקים העולה לפני הסרת הלב, ולאחר מכן להסיר את הריאה כדי לחשוף את אבי העורקים היורד. חותכים את אבי העורקים היורד באלכסון כדי לחשוף את חתך הרוחב של כלי השיט. לאחר מכן, הכנס קטטר 22-מד לתוך אבי העורקים היורד תוך הפעלת מאגר vasodilation.הצמד את השורש של הצנתר ולעשות קשר כדי למנוע דליפה עקב הזרימה האחורית. לאחר שנעשה, להתחיל את זלוף עם פתרון vasodilating מחומם בלחץ קבוע בין 13 ל 15 קילופסקל. לאחר שלוש דקות, perfuse פתרון של 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 3 דקות.עצרו את הזלוף, ומלאו את צינור ההרחבה המחובר לצנתר ב-2 מ"ל של מדיום הניגודיות המוכן טרי המדולל ביחס 1:1 כדי לחטט ב-13 עד 15 קילופסקל קבוע. כדי לדמיין עורקים, לבדוק את הציפורן של הפה כדי לאשר כי המדיום הניגוד הגיע לעורק. באותו אופן, בדוק את הווריד התחתון של הסרעפת כדי לאשר את זרימת הדם המלאה של מדיום הניגוד ולדמיין את כל כלי הדם.אם זרימת הדם של מדיום הניגודיות הושלמה, סגור את העצירה התלת-כיוונית והסר את הצינור. לדגור על המדגם לילה ב 4 מעלות צלזיוס. בפרוטוקול זה, כל הכלים בגפיים התחתונות של העכבר היו דמיינו.התוצאות של מודל איסכמיה בגפיים האחוריות אישרו כי עורק הירך הלא קשור פעל במקביל לווריד הירך. כמו כן, ההפרעה בתקשורת הניגודית הקלה על צפייה בעורק הירך הקשור ובהתפתחות כלי שיט נלווים. ניתן היה לראות כמה כלים מלאים במדיום הניגודיות.מצד שני, ההפרעה בתקשורת הניגודית עקב ערבוב של מדיה לא-קונקרטית, או זלוף לא מספיק, הורגשה גם היא. זה היה בלתי אפשרי לראות את העורקים על פני השטח של הגוף על ידי מיקרוסקופי של תצפית סטריאומיקרוסקופית של המדיום הניגודי, אשר עשה את זה קל יותר להעריך פגמים בכלי הדם. חשוב מאוד להימנע מבועות אוויר בעת החדרת הצנתר.מאז איברי הבטן שלהם הם גם רגועים, אפשר להוציא את האיברים ולקחת סריקת CT. באמצעות שיטה זו, הצלחנו לזהות רבע חדש של רוויה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

הערכת אורך של עכבר הינד איבוד מסת העצם לימב לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות רומן, In vivo מתודולוגיה

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

זלוף מדרדר ומילוי בכלי הדם הכליליים עכבר כהכנה מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

דגם השתלות Heterotopic החזירים הינד איבר השתנה לTranslational vascularized Composite Allotransplantation מחקר (VCA)

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

Orthotopic הינד לימב השתלה בבית העכבר

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Cone Beam Intraoperative Computed Tomography-based Image Guidance for Minimally Invasive Transforaminal Interbody Fusion

בול קרן חרוט מחושב ממוחשבת מבוססי טומוגרפיה ממוחשבת עבור הדרכה פולשנית לטרנסג הבינגוף באינטראמזיה

Transforaminal lumbar interbody fusion (TLIF) is commonly used for the treatment of spinal stenosis, degenerative disc disease, and spondylolisthesis. ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

המודל הקליני של איסכמיה הגפיים האחוריות בארנבים סוכרתית

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל במודל נמק הינדלימב מורין

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...