Name: sample preparation for computed tomography-based three-dimensional visualization of murine hind-limb vessels
Uploaded: 2021-10-07T14:30:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels at JoVE.com

हम पशु प्रयोगों में उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए यासुयो किमुरा, मेगुमी नागाहिरो और सैको टोकुनागा को धन्यवाद देते हैं।

सभी प्रक्रियाओं को कुमामोटो विश्वविद्यालय के पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था (अनुमोदन संदर्भ सं। M30-040/A2020-105), जो प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड (प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित 2011) के अनुरूप है।
1. तैयारी
<ol><li>परफ्यूजन उपकरण और वैसोडिलेटर बफर तैयार करें (4 मिलीग्राम / एल पैपवेरिन हाइड्रोक्लोराइड, 4 ग्राम / एल; एडेनोसिन, 1 ग्राम / एल; हेपरिन, फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में 1 यू / एमएल)। नोट: भाटा डिवाइस और vasodilator अभिकर्मकों Weyers et al.5 द्वारा रिपोर्ट किए गए लोगों के रूप में ही कर रहे हैं।</li>
	<li>22 जी कैथेटर, 2 एमएल एक्सटेंशन ट्यूब, और तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक (चित्रा 1 ए) को कनेक्ट करें। नोट: जानवर के आकार के अनुसार गेज को समायोजित करें। वयस्क C57BL /6 चूहों के लिए, 22 G इष्टतम है।</li>
	<li>vasodilator बफर (चित्रा 1A) के साथ दबाव परफ्यूजन उपकरण भरें। नोट: विपरीत माध्यम को भरने में व्यवधान को रोकने के लिए बुलबुले के गठन से बचें।</li>
</ol>2. परफ्यूजन
<ol><li>ऑपरेशन से 30 मिनट पहले इंट्रापेरिटोनियल गुहा में पीबीएस में 1 यू / जी हेपरिन इंजेक्ट करें।</li>
	<li>पूरी तरह से isoflurane के साथ माउस anesthetize और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इसे euthanize.</li>
	<li>विच्छेदन के बाद, उरोस्थि में एक मध्यरेखा चीरा बनाएं और पिन के साथ खुले वक्ष को ठीक करें। नोट: कंट्रास्ट के रिसाव से बचने के लिए, डायाफ्राम को घायल करने से बचें।</li>
	<li>आरोही महाधमनी को काटें और दिल को हटा दें।</li>
	<li>फेफड़े को हटा दें और अवरोही महाधमनी को उजागर करें। नोट: अवरोही महाधमनी को चोट न पहुंचाएं।</li>
	<li>क्रॉस-सेक्शन (चित्रा 1 बी) को उजागर करने के लिए अवरोही महाधमनी को तिरछे काटें। नोट: महाधमनी को छील न करें; कैथेटर सम्मिलन के लिए एक विकर्ण अनुभाग बेहतर है।</li>
	<li>वासोडिलेशन बफर चलाते समय अवरोही महाधमनी में 22 जी कैथेटर डालें। नोट: वासोडिलेशन बफर चलाते समय कैथेटर का सम्मिलन हवा के संदूषण से बचा जाता है।</li>
	<li>कैथेटर की जड़ को पिन करें (चित्रा 1 सी)।</li>
	<li>बैकफ्लो के कारण रिसाव को रोकने के लिए एक गाँठ बनाएं।</li>
	<li>13 और 15 kPa के बीच एक निश्चित दबाव पर 3 मिनट के लिए एक गर्म वासोडिलेटिंग समाधान (papaverine hydrochloride, 4 g / L; एडेनोसिन, 1 g / L; हेपरिन, 1 U / mL) को परफ्यूज करें।</li>
	<li>3 मिनट के लिए (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड का एक समाधान परफ्यूज करें। नोट: निर्धारण की सफलता की पुष्टि पैर के आंदोलन (चित्रा 1 डी) द्वारा की जा सकती है।</li>
	<li>परफ्यूजन से ठीक पहले कंट्रास्ट माध्यम तैयार करें। नोट:: नमूने के अनुसार कमजोर पड़ने की दर को समायोजित करें; वयस्क चूहों के लिए, 1: 1 के अनुपात में दाग और डिलुएंट को मिलाएं।</li>
	<li>परफ्यूजन को रोकें और पतले कंट्रास्ट माध्यम (चित्रा 1 ई) के 2 एमएल के साथ विस्तार ट्यूब को भरें। नोट: रक्त वाहिकाओं को चोट से बचने के लिए इसके विपरीत माध्यम को धीरे-धीरे इंजेक्ट किया जाना चाहिए।</li>
	<li>13 और 15 kPa के बीच एक निश्चित दबाव पर विपरीत माध्यम perfuse.<ol>
<li>धमनियों की कल्पना करने के लिए, यह पुष्टि करने के लिए टोनेल की जांच करें कि इसके विपरीत माध्यम धमनी तक पहुंच गया है (चित्रा 1 एफ)।</li>
		<li>सभी जहाजों की कल्पना करने के लिए, विपरीत माध्यम के पूर्ण परिसंचरण की पुष्टि करने के लिए डायाफ्राम के अवर वेना कावा की जांच करें। नोट: शुरुआत में, इसके विपरीत vasodilating समाधान शामिल हैं; इसलिए, इसका उचित परिसंचरण आवश्यक है।</li>
	</ol>
</li>
	<li>तीन तरह से stopcock बंद करें और ट्यूब (चित्रा 1 जी) को हटा दें। नोट:: यदि तीन-तरफ़ा stopcock बंद नहीं है, तो कंट्रास्ट पीछे की ओर प्रवाहित होगा।</li>
	<li>4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूना इनक्यूबेट करें।</li>
	<li>त्वचा को हटा दें और इसे 10% फॉर्मेल्डिहाइड समाधान में ठीक करें।</li>
</ol>3. विज़ुअलाइज़ेशन
नोट:: विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल CT स्कैनर के आधार पर भिन्न होते हैं। इस प्रोटोकॉल में माइक्रोफोकस एक्स-रे सीटी स्कैनर का उपयोग किया गया था। प्रत्येक सीटी स्कैनर के अनुसार इमेजिंग विधि को अनुकूलित करना आवश्यक है।
<ol><li>PBS युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में नमूना ठीक करें।</li>
	<li>नमूना ट्यूब को मेज पर रखें।</li>
	<li>50 केवी के वोल्टेज और 600 μA की एक धारा के साथ नमूने को स्कैन करें, 75.2 मिमी की फोकस-टू-सेंटर दूरी सुनिश्चित करें। नोट: इस सेटिंग में 1 voxel का एक आयाम 28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μm था।</li>
	<li>फिजी के साथ अधिग्रहित छवि डेटा लोड करें, जैविक-छवि विश्लेषण के लिए एक ओपन-सोर्स प्लेटफ़ॉर्म।</li>
	<li>गैस्ट्रोकेनेमियस मांसपेशी का उपयोग करके मांसपेशी वोक्सेल मूल्य निर्धारित करें।<ol>
<li>आयत उपकरण का उपयोग करके gastrocnemius मांसपेशी चुनें।</li>
		<li>हिस्टोग्राम से माध्य और मानक विचलन (एसडी) की जाँच करें (विश्लेषण | हिस्टोग्राम)।</li>
		<li>गैस्ट्रोकेनेमियस मांसपेशी के माध्य + 2SD के रूप में मांसपेशी voxel घनत्व को परिभाषित करें।</li>
	</ol>
</li>
	<li>मांसपेशी voxel घनत्व को निचले थ्रेशोल्ड स्तर के रूप में सेट करें (छवि | समायोजित | थ्रेशोल्ड | | सेट करें निचले थ्रेशोल्ड स्तर)। नोट:: संवहनी क्षेत्र और अस्थि क्षेत्र थ्रेशोल्ड सेट करने के बाद binarized डेटा में रहते हैं।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual Review of Medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).</li><li>Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+perfusion+and+filling+of+mouse+coronary+vasculature+as+preparation+for+micro+computed+tomography+imaging.">Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).</li><li>Arima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+collateral+source+characteristics+with+3-dimensional+analysis+using+micro-X-ray+computed+tomography.">Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Fernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+liver+disease.">Angiogenesis in liver disease.</a> Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+pancreatic+cancer:+current+research+status+and+clinical+implications.">Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications.</a> Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).</li></ol>

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

यह रिपोर्ट निचले शरीर में रक्त वाहिकाओं की कल्पना करने के लिए एक परिष्कृत विधि का परिचय देती है। इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम हैं: पहला विपरीत माध्यम के इंजेक्शन से पहले प्रीपरफ्यूजन है। यदि पर्याप्त रक्त नहीं हटाया जाता है, तो इसके विपरीत सिस्टम को नहीं भरेगा। इसके अतिरिक्त, हवा के बुलबुले को शामिल करने से इसके विपरीत को भरने में बाधा आती है; इस प्रकार, सर्किट में हवा को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, क्योंकि इसके विपरीत माध्यम इंजेक्शन के तुरंत बाद ठोस नहीं होता है, इसलिए नमूने को अत्यधिक स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए।
यह विधि रक्त वाहिकाओं और परिसंचरण के बढ़े हुए गठन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है, जैसे कि संपार्श्विक परिसंचरण। इसके विपरीत, एक सीमा के रूप में, संकुचित रक्त वाहिकाओं का मूल्यांकन करना मुश्किल है, क्योंकि स्टेनोसिस और इसके विपरीत माध्यम में कृत्रिम कमी के बीच अंतर करना मुश्किल है। इसके अतिरिक्त, हड्डियों में रक्त वाहिकाओं का मूल्यांकन करना चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि रक्त और हड्डी का अलगाव मुश्किल है।
3 डी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक वैकल्पिक विधि इम्युनोस्टेनिंग है। ऊतक समाशोधन तकनीक का उपयोग करते हुए, 3 डी इमेजिंग 7 के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। Immunostaining लाभप्रद है क्योंकि यह एंटीबॉडी का उपयोग करके विशिष्ट प्रोटीन के दाग की अनुमति देता है। एक हालिया रिपोर्ट इम्युनोस्टेनिंग 8 के आधार पर पूरे शरीर की इमेजिंग को चुनौती देती है; हालांकि, सीटी-आधारित इमेजिंग को किसी भी ऊतक-समाशोधन pretreatment की आवश्यकता नहीं है। 
यह विधि पेट के अंगों सहित डायाफ्राम के नीचे सभी वाहिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है। पेट के अंगों में एंजियोजेनेसिस होमियोस्टैसिस को बनाए रखने और बीमारियों के विकास पर एक मजबूत प्रभाव डालता है9,10। चूंकि इस प्रोटोकॉल को निचले छोर के जहाजों के मूल्यांकन के लिए अनुकूलित किया गया था, इसलिए अंग-विशिष्ट प्राइमिंग किसी भी कारक से जुड़े एंजियोजेनेसिस के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करेगा, जैसे कि सूजन या ट्यूमर।

रक्त वाहिकाएं पेड़ जैसी संरचनाओं के साथ जटिल नेटवर्क हैं। एंजियोजेनेसिस और नए संवहनी गठन अंग होमोस्टैसिस 1 के रखरखाव में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। एंजियोजेनेसिस को इस्केमिक और घातक रोगों के उपचार के लिए विनियमित किया जाता है2। इसलिए एंजियोजेनेसिस के अंतर्निहित तंत्र को समझना आवश्यक है। मुरीन हिंद-अंग वाहिकाओं को अक्सर संवहनी अनुसंधान के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है3; इलियाक या ऊरु धमनी का ipsilateral बंधाव एक ज्ञात हिंद-अंग ischemia मॉडल शारीरिक और पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस में एंजियोजेनेसिस और संवहनी remodeling का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है4. हालांकि, एंजियोजेनेसिस का मूल्यांकन मुख्य रूप से अनुभाग धुंधला द्वारा किया जाता है, और 3 डी संवहनी आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के तरीके विशेष रूप से सीमित हैं।
अनुभाग धुंधला के साथ तुलना में, सीटी 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन सक्षम बनाता है। हाल ही में, Weyers et al. ने सीटी इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक परिष्कृत प्रोटोकॉल की सूचना दी, जिससे मुरीन वयस्क कोरोनरी परिसंचरण प्रणाली 5 के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम किया जा सके। हमने निचले छोर रक्त वाहिकाओं के सीटी इमेजिंग के लिए उपयुक्त नमूना तैयारी विधि बनाने के लिए उनकी विधि को संशोधित किया। यहां, अवरोही महाधमनी के माध्यम से एक विकिरण-अपारदर्शी राल इंजेक्ट किया जाता है, और निचले छोरों में जहाजों को डाई से भर दिया जाता है। डाई इंजेक्शन के समय को समायोजित करके, धमनी-विशिष्ट भरने भी संभव है, और नमूने किसी भी माइक्रो-एक्स-रे गणना टोमोग्राफी डिवाइस के साथ प्राप्त किए जा सकते हैं। यह विपरीत विधि डायाफ्राम के नीचे और पेट के अंगों और निचले छोरों में मुरीन रक्त वाहिकाओं के 3 डी मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी तकनीक प्रदान करती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin Solution</td>
			<td>Fujifilm-Wako</td>
			<td>068-03841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline (-) (PBS)</td>
			<td>Fujifilm-Wako</td>
			<td>163-25265</td>
			<td>Prepare 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G catheter (22 G S5 x 1&#34; V(F))</td>
			<td>MEDIKIT</td>
			<td>HP2140</td>
			<td>Only catheter is used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2325R</td>
			<td>Use as a pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Fujifilm-Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Suture with needle</td>
			<td>Alfresa Pharma Corporation</td>
			<td>ER1205SB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9251-5G</td>
			<td>For vasodilating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No.11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TOP</td>
			<td>X2-FL50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>No.11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium 5,000 units/5 mL</td>
			<td>Mochida Co. Ltd.</td>
			<td>224122458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fujifilm-Wako</td>
			<td>099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil Injection Compounds</td>
			<td>Flow Tech Inc.</td>
			<td>MV-117</td>
			<td>Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papaverine hydrochloride</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>164-18002</td>
			<td>For vasodilating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Anesthetizer</td>
			<td>Muromachi Kikai Co. Ltd.</td>
			<td>MK-A100ecoW-ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors - Angled to Side</td>
			<td>FST</td>
			<td>No.15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>No.14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-way cock</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>TS-TR1K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>SAMCO SCIENTIFIC</td>
			<td>SM262-1S</td>
			<td>Use for mixing contrast medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray CT scanner</td>
			<td>Toshiba IT &#38; Control Systems Corporation</td>
			<td>TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for computed tomography-based three-dimensional visualization of murine hind-limb vessels

रक्त वाहिकाएं पेड़ जैसी संरचनाओं के साथ जटिल नेटवर्क हैं, और संवहनी नेटवर्क परिसंचरण को बनाए रखने और अंग समारोह को बनाए रखने दोनों के लिए आवश्यक हैं। इसलिए रक्त वाहिका गठन के तंत्र को स्पष्ट करना विकास प्रक्रियाओं और रोग संबंधी तंत्र को स्पष्ट करने के लिए बेहद उपयोगी है। मुरीन हिंद-अंग वाहिकाओं को अक्सर शारीरिक और पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। मूल्यांकन मुख्य रूप से ऊतक वर्गों का उपयोग करके दो-आयामी विधि के माध्यम से किया जाता है। हालांकि, त्रि-आयामी (3 डी) संवहनी आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के तरीके विशेष रूप से सीमित हैं। यह पेपर गणना टोमोग्राफी (सीटी) का उपयोग करके मुरीन हिंद-अंगों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक विधि का परिचय देता है। विकिरण-अपारदर्शी राल को अवरोही महाधमनी के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है, और पूरे जहाजों को डाई से भर दिया जाता है। डाई इंजेक्शन के समय को समायोजित करके, धमनी-विशिष्ट भरने भी संभव है, और नमूने किसी भी माइक्रो-एक्स-रे सीटी डिवाइस के साथ प्राप्त किए जा सकते हैं। यह विपरीत विधि निचले छोरों में मुरीन रक्त वाहिकाओं के 3 डी मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी तकनीक प्रदान करती है। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग डायाफ्राम के नीचे सभी रक्त वाहिकाओं की कल्पना करने और पेट के अंगों में रक्त वाहिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

निचले छोरों में सभी जहाजों को कल्पना की जा सकती है यदि यह प्रोटोकॉल सही ढंग से किया जाता है (चित्रा 2 ए)। एक हिंद-अंग ischemia मॉडल में, गैर-ligated ऊरु धमनी ऊरु शिरा (चित्रा 2 बी) के समानांतर चलता है, और एक ligated ऊरु धमनी विपरीत मीडिया (चित्रा 2 सी) के व्यवधान से पुष्टि की जा सकती है। परिणामों ने संपार्श्विक जहाजों के विकास का खुलासा किया (चित्रा 2 डी)। संपार्श्विक परिसंचरण लिगेटेड धमनी के समीपस्थ धमनियों और निचले पैर के क्षेत्र में धमनी के बीच और ऊरु धमनी के वेंट्रल और पृष्ठीय पक्षों पर बनता है। अवर ग्लूटल धमनी-श्रोणि के पृष्ठीय पक्ष पर शुरू होती है और जांघ के पार्श्व पक्ष पर चल रही है- इस्केमिक पक्ष पर मजबूती से फैलती है।
कंट्रास्ट से भरे जहाजों को कंट्रास्ट माध्यम (चित्रा 2 ई) से भरा जाता है; इसके विपरीत में व्यवधान noncontrast मीडिया (जैसे, रक्त, vasodilator बफर, या बुलबुले) या इसके विपरीत (चित्रा 2F) के अपर्याप्त परफ्यूजन के मिश्रण को इंगित करता है। वासोडिलेशन और फिक्सेशन अच्छी तरह से काम नहीं करेगा यदि रक्त वाहिकाएं सिकुड़ गई हैं। यद्यपि सीटी इमेजिंग केवल विपरीत माध्यम की कल्पना कर सकती है, लेकिन शरीर की सतह पर धमनियों को मैक्रोस्कोपिक या स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक अवलोकन (चित्रा 2 जी) द्वारा देखना संभव है। इस प्रकार, इसके विपरीत माध्यम (चित्रा 2 एच) का उपयोग करके दोषों का आकलन करना आसान है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63009/63009fig01.jpg"> चित्र 1: प्रक्रिया की रूपरेखा। (A) दबाव परफ्यूजन उपकरण और 22 G कैथेटर एक 2 mL एक्सटेंशन ट्यूब और तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक के माध्यम से जुड़ा हुआ है। (बी) आरोही महाधमनी को क्रॉस-सेक्शन (पीला तीर) को उजागर करने के लिए तिरछे रूप से काटा जाता है। (सी) कैथेटर को दो पिन (पीले तीर) का उपयोग करके तय किया गया था। (d) स्थिर निचले अंग निर्धारण (पीले तीर) पर विस्तारित होते हैं। (ई) तीन तरह से स्टॉपकॉक के माध्यम से इसके विपरीत का इंजेक्शन। इंजेक्शन की दिशा एक पीले तीर द्वारा इंगित की जाती है। (च) हिंद-अंग नाखून विपरीत (पीला तीर) से भरा होता है। (जी) स्टॉपकॉक को बंद कर दिया जाता है और परफ्यूजन उपकरण से हटा दिया जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63009/63009fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63009/63009fig02.jpg"> चित्रा 2: जहाजों की छवियां। (ए) हिंद-अंग हड्डियों और वाहिकाओं की पूरी छवि। (बी) ऊरु धमनी (लाल तीर) और शिरा (नीला तीर)। (C) लिगेटेड ऊरु धमनी (पीला तीर)। परिधि बाधा (पीली बिंदीदार रेखा) से बाधित होती है। (डी) लिगेटेड साइड (पीले तीर) में संपार्श्विक वाहिकाएं। पीली बिंदीदार रेखा बाधित ऊरु धमनी का प्रतिनिधित्व करती है। (ई) सेफेनस धमनी (लाल तीर) और शिरा (नीला तीर) का एक अच्छी तरह से भरा हुआ नमूना। (च) अपर्याप्त परफ्यूजन सेफेनस वाहिकाओं (पीली बिंदीदार रेखा) के व्यवधान की ओर जाता है। (छ) एक प्रतिनिधि नमूने का स्टीरियोमाइक्रोबियल अवलोकन। दाएँ ऊरु धमनी (पीला तीर) विपरीत माध्यम से भरा हुआ है। (ज) एक असफल नमूने का स्टीरियोमाइक्रोस्कोप अवलोकन। दाहिने ऊरु धमनी (पीला तीर) में विपरीत माध्यम का अभाव होता है। स्केल बार = 1 मिमी (बी-एफ), 2 मिमी (जी, एच), 10 मिमी (ए)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63009/63009fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

यहां, हम माइक्रो-एक्स-रे गणना टोमोग्राफी का उपयोग करके मुरीन हिंद-अंग वाहिकाओं के लिए एक विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण विधि का वर्णन करते हैं।

मूरीन हिंद-अंग जहाजों के परिकलित टोमोग्राफी-आधारित तीन आयामी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए नमूना तैयारी

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...

चरण प्रोटोकॉल का उपयोग करके निचले अंगों और पेट के अंगों में रक्त वाहिकाओं की सीटी छवियों को लेना संभव है। विधि पूरे रक्त वाहिकाओं के मूल्यांकन को व्यापक रूप से सक्षम बनाती है। इसके अलावा, केवल धमनियों या एक ही समय में, धमनियों और नसों का मूल्यांकन करना संभव है।रक्त के थक्कों, लीक या रक्त को अच्छी तरह से रोकने और हवा के बुलबुले से बचने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है। ऑपरेशन से पहले, माउस के इंट्रापेरिटोनियल गुहा में पीबीएस में 1 इकाई / ग्राम हेपरिन इंजेक्ट करें। 30 मिनट के बाद, euthanized माउस के उरोस्थि में एक मध्य रेखा चीरा बनाने के लिए और पिन के साथ खुले वक्ष को ठीक करें।दिल को हटाने से पहले आरोही महाधमनी को काट लें, और फिर अवरोही महाधमनी को उजागर करने के लिए फेफड़ों को हटा दें। पोत के क्रॉस-सेक्शन को प्रकट करने के लिए अवरोही महाधमनी को तिरछे रूप से काटें। अगला, वासोडिलेशन बफर चलाते समय अवरोही महाधमनी में एक 22-गेज कैथेटर डालें।कैथेटर की जड़ को पिन करें और बैकफ्लो के कारण रिसाव को रोकने के लिए एक गाँठ बनाएं। एक बार हो जाने के बाद, 13 से 15 किलोग्राम के बीच एक निश्चित दबाव पर एक गर्म वासोडिलेटिंग समाधान के साथ परफ्यूजन शुरू करें। तीन मिनट के बाद, 3 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड का एक समाधान परफ्यूज करें।परफ्यूजन को रोकें, और कैथेटर से जुड़े विस्तार ट्यूब को ताजा-तैयार कंट्रास्ट माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ भरें, जो 13 से 15 किलोग्राम के बीच एक निश्चित पर परफ्यूज करने के लिए 1: 1 के अनुपात में पतला हो जाता है। धमनियों की कल्पना करने के लिए, यह पुष्टि करने के लिए मुंह के टोनेल की जांच करें कि इसके विपरीत माध्यम धमनी तक पहुंच गया है। इसी तरह, विपरीत माध्यम के पूर्ण परिसंचरण की पुष्टि करने के लिए डायाफ्राम के अवर वेना कावा की जांच करें और सभी जहाजों की कल्पना करें।यदि कंट्रास्ट माध्यम का परिसंचरण पूरा हो गया है, तो तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक को बंद करें और ट्यूब को हटा दें। नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। इस प्रोटोकॉल में, माउस के निचले छोरों में सभी जहाजों की कल्पना की गई थी।एक हिंद-अंग ischemia मॉडल के परिणामों ने पुष्टि की कि गैर-लिगेटेड ऊरु धमनी ऊरु शिरा के समानांतर चल रही थी। इसके अलावा, इसके विपरीत मीडिया में रुकावट ने एक लिगेटेड ऊरु धमनी और संपार्श्विक वाहिकाओं के विकास को देखना आसान बना दिया। इसके विपरीत माध्यम से भरे कुछ जहाजों को देखा जा सकता है।दूसरी ओर, गैर-कॉन्ट्रास्ट मीडिया, या अपर्याप्त परफ्यूजन के मिश्रण के कारण विपरीत मीडिया में व्यवधान भी देखा गया था। इसके विपरीत माध्यम के स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक अवलोकन के माइक्रोस्कोपिक द्वारा शरीर की सतह पर धमनियों को देखना असंभव था, जिससे वास्कुलचर में दोषों का आकलन करना आसान हो गया। कैथेटर डालते समय हवा के बुलबुले से बचना बहुत महत्वपूर्ण है।चूंकि उनके पेट के अंगों को भी आराम मिलता है, इसलिए अंगों से बाहर निकालना और सीटी स्कैन करना संभव है। इस विधि का उपयोग करके, हम संतृप्ति की एक नई तिमाही की पहचान करने में सक्षम थे।

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

माउस स्पाइनल कॉर्ड उपन्यास का उपयोग चोट के बाद हिंद अंग अस्थि हानि के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन Vivo में पद्धति,

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

प्रतिगामी और सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी इमेजिंग के लिए तैयारी के रूप में परफ्यूज़न माउस कोरोनरी vasculature का भरना

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Translational vascularized कम्पोजिट किसी प्राणी से ऊतक लेकर उसी जाति के प्राणी में प्रतिरोपित करना (वीसीए) अनुसंधान के लिए एक संशोधित Heterotopic स्वाइन पिछले अंग प्रत्यारोपण मॉडल

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

ट्यूमर स्ट्रोमल इंटरेक्शन के लिए तीन आयामी सह संस्कृति मॉडल

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर उपगोल आक्रमण परख

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

माउस में Orthotopic हिंद अंग प्रत्यारोपण

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं के तीन आयामी Alginate मनका संस्कृति

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Cone Beam Intraoperative Computed Tomography-based Image Guidance for Minimally Invasive Transforaminal Interbody Fusion

न्यूनतम इनवेसिव Transforaminal इंटरबॉडी फ्यूजन के लिए कोन बीम इंट्राऑपरेटिव कम्प्यूटेड टॉमोग्राफी-आधारित छवि मार्गदर्शन

Transforaminal lumbar interbody fusion (TLIF) is commonly used for the treatment of spinal stenosis, degenerative disc disease, and spondylolisthesis. ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

पूर्व नैदानिक मॉडल पश्च अंग के Ischemia मधुमेह खरगोशों में

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

एक Murine Hindlimb Gangrene मॉडल में Footpad वास्कुलचर के उच्च संकल्प तीन आयामी इमेजिंग

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...