Name: a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications at JoVE.com

يود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم البحثي التالي: EPSRC [EP/K038648/1] ل SJM كPSR مع PSF. قامت Wellcome Trust برعاية زمالة ISSF ل SJM مع PSF في إمبريال كوليدج لندن. منحة الجمعية الملكية البحثية [RGS\R1\191186]; جائزة Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] ل SJM في جامعة كينت؛ ومنحة الدكتوراه من صندوق أبحاث التحديات العالمية (GCRF) ل KC في جامعة كينت.

ملاحظة: انظر الجدول 1 والجدول 2 للحصول على وصفات لصفيحة GYM المتوسطة والأجار ومخازن الغسيل S30A و S30B.
1. إعداد الحلول والتوجيه العام
<ol><li>احتفظ بجميع المحاليل والخلايا (ما بعد النمو) ومستخلصات الخلايا على الجليد بعد التحضير ، ما لم يتم ذكر استثناء.</li>
	<li>قم بتخز?...

في هذه المخطوطة، تم وصف بروتوكول S. venezuelae TX-TL عالي الإنتاجية بخطوات مفصلة يسهل إجراؤها لكل من المستخدمين ذوي الخبرة والجدد لأنظمة TX-TL. تمت إزالة العديد من الميزات من بروتوكولات Streptomyces45 و E. coli TX-TL41 الحالية لإنشاء بروتوكول الحد الأدنى ، ولكنه عالي الإنتاجية ل S. ven...

توفر أنظمة النسخ والترجمة الخالية من الخلايا (TX-TL) منصة نموذجية مثالية للبيولوجيا التركيبية لتنفيذ دورات التصميم والبناء والاختبار والتعلم السريعة، وهي الإطار الهندسي المفاهيمي للبيولوجيا التركيبية1. وبالإضافة إلى ذلك، هناك اهتمام متزايد بأنظمة TX-TL لإنتاج البروتين المؤتلف عالي القيمة في بيئة التفاعل المفتوح2، على سبيل المثال، لدمج الأحماض الأمينية غير القياسية في مترافقات الأجسام المضادة والأدوية3. على وجه التحديد ، يتطلب TX-TL مستخلصا خلويا أو بلازميد أو حمض نووي خطي ، ومحلول طاقة لتحفيز تخليق البروتين على دفعة واحدة أو تفاعلات شبه مستمرة. في حين أن الإشريكية القولونية TX-TL هي النظام المهيمن الخالي من الخلايا ، فقد جذب عدد من أنظمة TX-TL الناشئة غير النموذجية الانتباه إلى تطبيقات مختلفة4,5,6,7,8. تشمل المزايا الرئيسية ل TX-TL قابلية التوسع المرنة (مقياس نانولتر إلى لتر) 9,10 ، وقابلية إعادة إنتاج قوية ، وسير عمل تلقائي8,11,12. وعلى وجه الخصوص، تسمح أتمتة TX-TL بالتوصيف المتسارع للأجزاء الوراثية والعناصر التنظيمية8،12،13.
من حيث إعداد التفاعل ، يتطلب TX-TL مصادر طاقة أولية وثانوية ، بالإضافة إلى الأحماض الأمينية والعوامل المساعدة والمواد المضافة وتسلسل الحمض النووي النموذجي. توفر ثلاثي فوسفات النيوكليوتيدات (NTPs) مصدر الطاقة الأساسي لدفع الحمض النووي الريبي المرسال الأولي (ATP و GTP و CTP و UTP) وتخليق البروتين (ATP و GTP فقط). لزيادة غلة TX-TL ، يتم تجديد NTPs من خلال هدم مصدر طاقة ثانوي ، مثل maltose14 و maltodextrin15 و glucose14 و 3-phosphoglycerate (3-PGA)16 و phosphoenolpyruvate17 و L-glutamate18. هذا النشاط الأيضي المتأصل متعدد الاستخدامات بشكل مدهش ، ولكنه لم يدرس بشكل جيد ، خاصة في أنظمة TX-TL الناشئة. لكل مصدر طاقة خصائص ومزايا متميزة من حيث إنتاجية ATP والاستقرار الكيميائي والتكلفة ، وهو اعتبار مهم لتفاعلات TX-TL الموسعة. وحتى الآن، وصلت البروتوكولات الحالية للإشريكية القولونية TX-TL إلى 4.0 ملغم/مل (~ 157 ميكرومتر) لنموذج بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)، باستخدام مزيج من 3-PGA (30 ملليمتر)، والمالتوديكسترين (60 ملليمتر)، والريبوز D (30 ملليمتر) كمصدر ثانوي للطاقة19.
في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد بدراسة مسارات التخليق الحيوي للمستقلب الثانوي في أنظمة TX-TL20،21،22. على وجه التحديد ، تعد الأكتينوباكتيريا مصدرا رئيسيا للمستقلبات الثانوية ، بما في ذلك المضادات الحيوية والمواد الكيميائية الزراعية23,24. يتم إثراء جينوماتها بما يسمى مجموعات الجينات الاصطناعية الحيوية (BGCs) ، والتي تشفر المسارات الأنزيمية للتخليق الحيوي المستقلب الثانوي. لدراسة الأجزاء الوراثية للبكتيريا الأكتينوباكتيريا ومسارات التخليق الحيوي ، تم مؤخرا تطوير مجموعة من أنظمة TX-TL القائمة على العقديات 5،6،25،26. من المحتمل أن تكون أنظمة Streptomyces TX-TL المتخصصة هذه مفيدة للأسباب التالية: [1] توفير بيئة قابلة للطي للبروتين الأصلي للإنزيمات من Streptomyces spp.26 ؛ [2] الوصول إلى تجمع tRNA الأمثل للتعبير الجيني G + C (٪) العالي ؛ [3] الأيض الأولي النشط، الذي يحتمل اختطافه لتوريد سلائف التخليق الأحيائي؛ و [4] توفير الإنزيمات أو السلائف أو العوامل المساعدة من التمثيل الغذائي الثانوي الموجود في مستخلص الخلايا الأصلي. ومن ثم، فقد تم مؤخرا إنشاء مجموعة أدوات S.venezuelae TX-TL عالية الإنتاجية لتسخير هذه القدرات الفريدة5.
Streptomyces venezuelae هو مضيف ناشئ للبيولوجيا التركيبية مع تاريخ غني في التكنولوجيا الحيوية الصناعية5،27،28،29 وكنظام نموذجي لدراسة انقسام الخلايا والتنظيم الجيني في Actinobacteria30،31،32. تحتوي سلالة النوع الرئيسي ، S. venezuelae ATCC 10712 ، على جينوم كبير نسبيا يبلغ 8.22 ميجا بايت مع محتوى G + C بنسبة 72.5٪ (٪) (رقم الانضمام: CP029197) ، والذي يشفر تسلسل ترميز 7377 ، و 21 rRNAs ، و 67 tRNAs ، و 30 مجموعة جينية اصطناعية حيوية27. في البيولوجيا التركيبية ، S. venezuelae ATCC 10712 هو هيكل جذاب للتعبير غير المتجانس عن مسارات التخليق الحيوي. على عكس معظم بقع العقديات الأخرى ، فإنه يوفر العديد من المزايا الرئيسية ، بما في ذلك وقت المضاعفة السريع (~ 40 دقيقة) ، ومجموعة واسعة من الأدوات الوراثية والتجريبية5,28 ، ونقص التكتل الفطري ، والجراثيم في الوسائط السائلة28,33. وقد أظهرت العديد من الدراسات أيضا استخدام S. venezuelae للإنتاج غير المتجانس لمجموعة متنوعة من المستقلبات الثانوية ، بما في ذلك polyketides والببتيدات الريبوسومية وغير الريبوسومية 34،35،36،37،38. هذه الميزات مجتمعة تجعل هذه السلالة مضيف ميكروبي جذاب للبيولوجيا التركيبية وتطبيقات الهندسة الأيضية. في حين أن S. venezuelae ليس نموذج Streptomyces المهيمن للتعبير الجيني غير المتجانس ، مع مزيد من التطورات ، إلا أنه مستعد للاستخدام على نطاق أوسع في اكتشاف المنتجات الطبيعية.
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا (الشكل 1) لنظام S. venezuelae TX-TL عالي الإنتاجية، والذي تم تحديثه من البروتوكول الأصلي المنشور سابقا26. في هذا العمل ، تم تحسين محلول الطاقة وظروف التفاعل لزيادة إنتاجية البروتين حتى 260 ميكروغرام / مل لبروتين مراسل mScarlet-I في تفاعل دفعة 4 ساعات ، 10 ميكرولتر ، باستخدام بلازميد قياسي ، pTU1-A-SP44-mScarlet-I. تم تصميم هذا البلازميد خصيصا لتمكين طرق مختلفة للكشف عن تعبير البروتين. كما تم تبسيط البروتوكول ، في حين تم تحسين نظام الطاقة لتقليل تعقيد وتكلفة إعداد تفاعلات خالية من الخلايا دون المساس بالعائد. جنبا إلى جنب مع نظام TX-TL الأمثل ، تم تطوير مكتبة من الأجزاء الوراثية لضبط التعبير الجيني الدقيق وكأدوات فلورسنت لمراقبة TX-TL في الوقت الفعلي ، وبالتالي إنشاء منصة متعددة الاستخدامات للنماذج الأولية للتعبير الجيني ومسارات التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية من Streptomyces spp. و Actinobacteria ذات الصلة.
في هذا العمل، يمكن استخدام البلازميد القياسي الموصى به (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) لإنشاء سير عمل S. venezuelae TX-TL في مختبر جديد وهو متاح على AddGene (انظر الجدول التكميلي S1). يوفر pTU1-A-SP44-mScarlet-I للمستخدم المرونة اللازمة لدراسة إطارات القراءة المفتوحة الأخرى (ORFs). تم تحسين mScarlet-I ORF من الكودون للتعبير الجيني S. venezuelae. مروج SP44 هو مروج تأسيسي قوي نشط للغاية في كل من الإشريكية القولونية والستربتومايسيس spp.39. يحتوي البلازميد على موقعين فريدين لإنزيم التقييد (NdeI ، BamHI) للسماح بالاستنساخ الفرعي ل ORFs الجديدة في الإطار مع علامة FLAG-TERMINAL مشتركة ونظام علامة رابط الفلوريسين الزرنيخي (FlAsH). بدلا من ذلك ، يمكن إزالة كلتا العلامتين بإدراج كودون توقف بعد استنساخ جين جديد. مع هذا المتجه الأساسي ، تم إثبات التعبير عالي الغلة لمجموعة من البروتينات ، وهي البروتينات من مسار التخليق الحيوي لأوكسي تتراسيكلين ومركب الببتيد غير الريبوسومي غير المميز (NRPS) من العقدية ريموسوس (الشكل 2). من حيث الكشف عن الحمض النووي الريبوزي المرسال ، يحتوي البلازميد القياسي pTU1-A-SP44-mScarlet-I على أبتامر dBroccoli (في المنطقة 3'-untranslated) للكشف باستخدام مسبار 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI). لزيادة المرونة، تم أيضا توفير مجموعة أدوات من أجزاء MoClo المتوافقة مع EcoFlex40 على AddGene، بما في ذلك متجه مكوك العقديات المتوافق مع EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) ومجموعة من البلازميدات المتغيرة pTU1-A-SP44 التي تعبر عن بروتين الفلور الأخضر الفائق (sfGFP) و mScarlet-I و mVenus-I و β-glucuronidase (GUS). على وجه الخصوص ، يشتق بلازميد pSF1C-A من pAV-gapdh28 ويتم علاجه من مواقع BsaI / BsmBI لتجميع MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP يعادل pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP من EcoFlex40 ولكنه يحتوي على وظائف إضافية للاقتران وتكامل الكروموسومات في العقديات spp. باستخدام نظام phiC31 integrase28.
تتضمن المرحلة الأولى من البروتوكول نمو S. venezuelae ATCC 10712 أو سلالة وثيقة الصلة ، وحصاد الخلايا في المرحلة الأسية المتوسطة ، وخطوات غسل الخلايا ، والتوازن في المخازن المؤقتة S30A و S30B. تتطلب هذه المرحلة ثلاثة أيام ، ويمكن استخدام وقت نمو الخلايا لإعداد المكونات المتبقية كما هو موضح أدناه. ثم يتم تحليل الخلايا المحصودة عن طريق الصوتنة ، وتوضيحها ، وتخضع لتفاعل الجريان السطحي. في هذه المرحلة النهائية من التحضير ، يمكن تحضير مستخلصات الخلايا للتخزين على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية لتقليل فقدان النشاط. لتجميع تفاعلات TX-TL باستخدام هذا البروتوكول ، يتم تقديم Streptomyces Master Mix (SMM) ، مع خيار تنسيق الحد الأدنى من حلول الطاقة (MES) الذي يعطي عوائد مماثلة. علاوة على ذلك ، يوصى بربط ثقافة جديدة من S. venezuelae ATCC 10712 من مخزون الجلسرين -80 درجة مئوية على صفيحة أجار GYM واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة على الأقل حتى تكون المستعمرات المفردة مرئية. يجب استخدام الثقافات الطازجة فقط للخطوات التالية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 L UltraYield Flask</td>
			<td>Thomson</td>
			<td>931136-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA (&#62;93%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black/Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10692202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>44722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, &#62;99%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>G32040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI (&#8805;98% - HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>MB1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-363644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Free Acid (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>B2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>494356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70167-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>807491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl sulfate) potassium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS amino acid sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (99%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>94554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>505471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Melford</td>
			<td>Y1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platereader</td>
			<td>BMG</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications

العقديات spp. هي مصدر رئيسي للمضادات الحيوية السريرية والمواد الكيميائية الصناعية. العقديات الفنزويلية ATCC 10712 هي سلالة سريعة النمو ومنتج طبيعي للكلورامفينيكول والجادوميسين والبيكروميسين ، مما يجعلها مرشحا جذابا كهيكل بيولوجي تركيبي من الجيل التالي. لذلك ، فإن الأدوات الوراثية التي تسرع تطوير S. venezuelae ATCC 10712 ، بالإضافة إلى نماذج Streptomyces spp. الأخرى ، مرغوبة للغاية لهندسة المنتجات الطبيعية واكتشافها. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم توفير نظام S . venezuelae ATCC 10712 الخالي من الخلايا في هذا البروتوكول لتمكين التعبير غير المتجانس عالي الإنتاجية لجينات G + C العالية (٪). هذا البروتوكول مناسب لتفاعلات الدفعات الصغيرة (10-100 ميكرولتر) إما في شكل لوحة 96 بئر أو 384 بئر ، في حين أن التفاعلات قابلة للتطوير. النظام الخالي من الخلايا قوي ويمكنه تحقيق غلة عالية (~ 5-10 μ M) لمجموعة من البروتينات المؤتلفة في الحد الأدنى من الإعداد. يتضمن هذا العمل أيضا مجموعة أدوات بلازميد واسعة للقياس في الوقت الفعلي للحمض النووي الريبوزي المرسال وتخليق البروتين ، بالإضافة إلى تلطيخ التألق في الجل للبروتينات الموسومة. يمكن أيضا دمج هذا البروتوكول مع سير عمل توصيف التعبير الجيني عالي الإنتاجية أو دراسة مسارات الإنزيم من جينات G + C العالية (٪) الموجودة في جينومات الأكتينوميسيت.

يتم توفير هذا البروتوكول التفصيلي كمثال لمساعدة المستخدم على إنشاء نظام Streptomyces TX-TL استنادا إلى سلالة نموذج S. venezuelae ATCC 10712 (الشكل 1). قد يسعى المستخدم إلى دراسة سلالات العقديات الأخرى. ومع ذلك ، فإن مراحل النمو / الحصاد للسلالات الأخرى ذات أوقات المضاعفة الأطول ...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications at JoVE.com

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

يفصل هذا البروتوكول طريقة محسنة لتوليف غلة عالية من البروتينات المؤتلفة من نظام ترجمة النسخ الخالي من الخلايا العقدية الفنزويلية (TX-TL).

مجموعة أدوات النسخ والترجمة العقدية عالية الإنتاجية للبيولوجيا التركيبية وتطبيقات المنتجات الطبيعية

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

يوفر بروتوكولنا سير عمل مبسطا لترجمة النسخ الخالية من الخلايا Streptomyces venezuelae. يسخر نظامنا الإنزيمات والمسارات الأيضية من هذا الكائن غير النموذجي. المزايا الرئيسية هي التعبير غير المتجانس للجينات ذات المحتوى العالي من GC ، وتوفير بيئة مواتية لإعادة توجيه البروتين ، ونظام مفتوح لضبط مسارات التخليق الحيوي.ستفتح طريقتنا فرصا جديدة لدراسة العقديات والبكتيريا عالية GC ذات الصلة. يسمح بدراسة الإنزيمات والتعبير الجيني في هذه البكتيريا. تم تطوير هذه التقنية لسهولة التنفيذ من قبل المستخدمين الجدد.الخطوة الوحيدة التي تتطلب خبرة أو معرفة سابقة هي الصوتنة لإنتاج مستخلصات خام نشطة للغاية. لبدء حصاد الخلايا المستزرعة مسبقا في اليوم الثالث ، قم بتخفيف الثقافة بين عشية وضحاها بنسبة واحد إلى 10 مع وسط GYN طازج للكثافة البصرية أو قياس OD عند 600 نانومتر. إذا كان OD للثقافة عند 600 نانومتر أقل من 0.3 ، فقم بزيادة سرعة الاهتزاز إلى 250 إلى 300 دورة في الدقيقة وتنمو حتى يصل OD إلى 0.3.تنمو لمدة لا تزيد عن ساعتين إضافيتين. إذا كان OD أكبر من 0.3 ، فقم بنقل الثقافات إلى حاويات الطرد المركزي وتبرد بسرعة على الجليد الرطب لمدة 30 دقيقة. أثناء انتظار أن تبرد مزرعة الخلايا ، قم بإعداد أربعة ملليلترات من ديثيوثريتول مولي واحد طازج ، S30A و S30B المخازن المؤقتة واحتفظ بها على الجليد.بعد وزن أنبوب طرد مركزي فارغ سعة 50 ملليلتر ، قم بتبريده مسبقا عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أضف مليلترين من ديثيوثريتول مولي واحد إلى لتر واحد من المخزن المؤقت S30A على الثلج واخلطه جيدا. جهاز طرد مركزي للخلايا عند 6000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.بعد التخلص من المادة الفائقة في حركة سريعة ، أضف 250 ملليلتر من المخزن المؤقت S30A وأعد تعليق الخلايا عن طريق هز زجاجات الطرد المركزي بقوة حتى يتم تشتيت كتل الخلايا بشكل متجانس. ثم قم بطرد الخلايا مرة أخرى لمدة ست دقائق. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الفائقة وكرر إضافة المخزن المؤقت S30A ، متبوعا بالطرد المركزي كما هو موضح.بعد ذلك ، أضف ملليلترين من DTT مولي واحد إلى لتر واحد من المخزن المؤقت S30B على الثلج واخلطه جيدا. أضف 250 ملليلتر من المخزن المؤقت S30B إلى الخلايا وكرر الطرد المركزي. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت S30B وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر المبرد مسبقا.إذا لزم الأمر ، انقل الخلايا المتبقية مع خمسة إلى 10 ملليلترات إضافية من المخزن المؤقت S30B واملأ الأنبوب إلى حجم 50 ملليلتر باستخدام S30B. جهاز طرد مركزي للخلايا لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الفائقة وكرر الطرد المركزي في الإعدادات السابقة كما هو موضح.بعد التخلص من المادة الفائقة ، قم بشفط المادة الفائقة S30B المتبقية باستخدام ماصة 100 إلى 200 ميكرولتر وقم بوزن حبيبات الخلايا الرطبة. لكل غرام واحد من الخلايا الرطبة، أضف 0.9 ملليلتر من المخزن المؤقت S30B. أعد تعليق الخلايا باستخدام إما ماصة باستور أو دوامة.جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 10 ثوان حتى 500 غرام لترسيب الخلايا. اخفض طرف الصوتة في تعليق الخلية حتى يصبح الطرف حوالي سنتيمتر واحد تحت سطح السائل. أدخل معلمات مختلفة في إعدادات الصوتة.اضبط التردد على 20 كيلوهرتز ، والسعة إلى 65٪ من وقت النبض وإيقافه إلى 10 ثوان ، وإجمالي وقت الصوتنة إلى دقيقة واحدة. ابدأ الصوتنة وحرك الأنبوب لأعلى أو لأسفل وجانبيا خلال أول دورتين للراحة لضمان صوتنة الخلايا بالتساوي. إذا لم يتم تحلل الخلايا بالكامل ، فقم بقلب الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات وكرر الصوتنة لدورة أو دورتين إضافيتين مدتهما 10 ثوان مع الخلط المتكرر حتى تتعطل الخلايا بالكامل.قم بطرد مركزي للخلايا المحللة لإزالة حطام الخلية ، ثم انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر كأليكوت ملليلتر واحد. بالنسبة لتفاعل الجريان السطحي لمستخلصات الخلية ، قم باحتضان الخلية التي تحتوي على مستخلص الخلية عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على كتلة حرارية أو في الحاضنة بدون شاكر. بالنسبة لتفاعل النسخ والترجمة ، قم بإذابة محلول SMM أو MES المستخرج الخلوي والحمض النووي البلازميد على الجليد.قم بتبريد صفيحة 384 بئرا عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإعداد تفاعل النسخ والترجمة على الجليد حيث يكون 25٪ من الحجم هو الحمض النووي البلازميد ، و 33.33٪ هو مستخلص الخلية و 41.67٪ هو محلول SMM. قم بتدوير الخليط بلطف لمدة خمس ثوان تقريبا عند إعداد سرعة منخفضة لضمان تجانس المحلول مع تجنب الرغوة أو تكوين الفقاعات.انقل ثلاثة أليكوتات من 10 ميكرولترات إلى ثلاثة آبار من صفيحة 384 بئرا كثلاثي تقني دون إدخال فقاعات الهواء. بعد إغلاق اللوحة بغطاء شفاف ، قم بتدوير اللوحة عند 400 مرة G لمدة خمس ثوان واحتضان التفاعل عند 28 درجة مئوية إما في حاضنة أو قارئ لوحة دون اهتزاز. تم تحسين ترجمة النسخ الخالية من الخلايا العقدية الفنزويلية للتعبير عالي الإنتاجية عن البروتينات الفلورية من البلازميد القياسي pTU1-A-SP44 ، بالإضافة إلى إنزيمات التخليق الحيوي التي تم اكتشافها بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي.تم قياس تعبير البلازميد القياسي pTU1-A-SP44-mScarlet-I باستخدام عدة طرق. تم إجراء قياسات التألق في الوقت الفعلي ل mRNA باستخدام dBroccoli RNA aptamer ، وبروتين mScarlet-I غير الناضج باستخدام نظام علامة FlAsH ، وبروتين mScarlet-I الناضج. تم إجراء تلطيخ التألق في الجل ل mScarlet-I باستخدام علامة FlAsH بالإضافة إلى تلطيخ Coomassie Blue للبروتين الكلي الخالي من الخلايا.بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء اختبارات النشاط لدراسة الإنزيمات والمسارات التي تمثل تحديا باستخدام الطرق القياسية. كما يمتد نحو التخليق الحيوي الموسع والتعبير الجيني عالي الإنتاجية. نحن نعمل على تطوير هذه التقنية لدراسة الإنزيمات الأيضية من البكتيريا عالية GC.لقد أظهرنا قدرة نظامنا على دراسة التخليق الحيوي الموسع في التفاعلات الخالية من الخلايا.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

مجموعة أدوات لتمكين تحويل المواد الهيدروكربونية في البيئات المائية

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A منصة رواية تمتد للتطبيقات في الخلايا والأنسجة Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

باستخدام البيولوجيا الاصطناعية إلى المهندس الخلايا الحية تتفاعل مع المواد القابلة للبرمجة

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

تحضير مزيج سريع من Bioinspired النانو هيدروكسيباتيت للتطبيقات الطبية الحيوية

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

توليف للأنابيب النانوية الكربونية متعددة الجدران تعديل مع جسيمات فضة نانوية وتقييم الخصائص السامة للخلايا والأنشطة المضادة للبكتيريا

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

صياغة وتميز الجسيمات النانوية الدهنية لتسليم الجينات باستخدام منصة خلط Microfluidic

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

حقن فوق الجزيئية البوليمر نانوجسيمات هيدروجيلس لتطبيقات توصيل الخلايا والمخدرات

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording

مجموعة أدوات مفتوحة المصدر: مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة من ألياف الكربون على الطاولة للتسجيل العصبي

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This ...