Name: a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר בתמיכה המחקרית הבאה: EPSRC [EP/K038648/1] עבור SJM כ- PDRA עם PSF; Wellcome Trust מימנה את מלגת ISSF עבור SJM עם PSF באימפריאל קולג' בלונדון; מענק המחקר של החברה המלכותית [RGS\R1\191186]; פרס Wellcome Trust SEED [217528/Z/Z/19/Z] עבור SJM באוניברסיטת קנט; ומלגת דוקטורט ל-Ph.D. של קרן מחקר האתגרים הגלובליים (GCRF) עבור KC באוניברסיטת קנט.

הערה: ראה טבלה 1 ושולחן 2 למתכונים עבור צלחת מדיום ואגר GYM ומאגרי S30A ו- S30B.
1. הכנת פתרונות והדרכה כללית
<ol><li>שמור את כל הפתרונות, תאים (לאחר צמיחה), ותמציות תאים על קרח לאחר ההכנה, אלא אם כן נאמר חריג.</li>
	<li>מלאי חנות עבור 1 M Mg-גלוטמט, 4 M K-גלוטמט, 40% (w / v) PEG 6000, 1 g / mL ח...

בכתב יד זה תואר פרוטוקול TX-TL של S. ונצואלה בעל תפוקה גבוהה עם צעדים מפורטים שהם פשוטים לניהול עבור משתמשים מנוסים וחדשים של מערכות TX-TL. מספר תכונות מפרוטוקולי Streptomyces45 ו- E. coli TX-TL41 הקיימים הוסרו כדי ליצור פרוטוקול מינימלי אך בעל תפוקה גבוהה עבור S. venezuelae TX-TL5,26.<su...

מערכות תרגום תמלול ללא תאים (TX-TL) מספקות פלטפורמת אב-טיפוס אידיאלית לביולוגיה סינתטית ליישום מחזורי תכנון-בנייה-למידה מהירים, מסגרת ההנדסה המושגית לביולוגיה סינתטית1. בנוסף, יש עניין גובר במערכות TX-TL לייצור חלבון רקומביננטי בעל ערך גבוה בסביבה של תגובה פתוחה2, למשל, לשלב חומצות אמינו לא סטנדרטיות בהצמדות נוגדנים-תרופתיות3. באופן ספציפי, TX-TL דורש תמצית תאים, פלסמיד או DNA ליניארי, ופתרון אנרגיה כדי לזרז את סינתזת החלבון בתגובות אצווה או חצי יבשתיות. בעוד Escherichia coli TX-TL היא המערכת הדומיננטית ללא תאים, מספר מערכות TX-TL שאינן מודל המתעוררות משכו תשומת לב עבור יישומים שונים4,5,6,7,8. היתרונות העיקריים של TX-TL כוללים מדרגיות גמישה (ננו-ליטר בקנה מידה ליטר)9,10, רבייה חזקה וזרימות עבודה אוטומטיות8,11,12. בפרט, אוטומציה של TX-TL מאפשרת אפיון מואץ של חלקים גנטיים ואלמנטים רגולטוריים8,12,13.
במונחים של הגדרת תגובה, TX-TL דורש מקורות אנרגיה ראשוניים ומשניים, כמו גם חומצות אמינו, קופקטורים, תוספים, ורצף DNA תבנית. נוקלאוטיד טריפוספטים (NTPs) מספקים את מקור האנרגיה העיקרי להנעת mRNA ראשוני (ATP, GTP, CTP ו- UTP) וסינתזת חלבונים (רק ATP ו- GTP). כדי להגדיל את תשואות TX-TL, NTPs מתחדשים באמצעות קטבוליזם של מקור אנרגיה משני, כגון מלטוז14, מלטודקסטרין15, גלוקוז14, 3-phosphoglycerate (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17, ו L-גלוטמט18. פעילות מטבולית טבועה זו היא מגוונת באופן מפתיע, אך נחקרה בצורה גרועה, במיוחד במערכות TX-TL המתעוררות. לכל מקור אנרגיה יש מאפיינים ויתרונות ברורים במונחים של תשואת ATP, יציבות כימית ועלות, המהווה שיקול חשוב לתגובות TX-TL מוגדלות. עד כה, הפרוטוקולים הנוכחיים עבור E. coli TX-TL הגיעו עד 4.0 מ"ג / מ"ל (~ 157 מיקרומטר) עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק מודל (GFP), באמצעות תערובת של 3-PGA (30 מ"מM), מלטודקסטרין (60 מ"מ) ו D-ריבוז (30 מ"מ) כמקור האנרגיה המשני19.
לאחרונה, יש כבר עניין גובר בחקר מסלולים biosynthetic מטבוליט משני במערכות TX-TL20,21,22. באופן ספציפי, Actinobacteria הם מקור עיקרי של מטבוליטים משניים, כולל אנטיביוטיקה וכימיקלים חקלאיים23,24. הגנום שלהם מועשר במה שמכונה אשכולות גנים ביוסינתטיים (BGCs), המקודדים מסלולים אנזימטיים לביוסינתזה מטבולית משנית. לחקר חלקים גנטיים Actinobacteria ומסלולים biosynthetic, מגוון של מערכות TX-TL מבוססי סטרפטומיצ'ס פותחו לאחרונה5,6,25,26. מערכות TX-TL מיוחדות אלה של סטרפטומיצ'ס עשויות להועיל מהסיבות הבאות: [1] אספקת סביבת קיפול חלבונים מקומית לאנזימים מסטרפטומיצ'ס spp.26; [2] גישה למאגר tRNA אופטימלי לביטוי גנים G+C (%) גבוה; [3] חילוף חומרים ראשוני פעיל, אשר עלול להיחטף לאספקת מבשרים biosynthetic; ו[4] אספקת אנזימים, מבשרי או קופקטורים מחילוף החומרים המשני הקיימים בתמצית התאים המקומיים. לפיכך, ערכת כלים TX-TL TX-TL של S.venezuelae בעלת תפוקה גבוהה הוקמה לאחרונה כדי לרתום את היכולות הייחודיות הללו5.
סטרפטומיצ'ס ונצואלה היא מארחת מתפתחת לביולוגיה סינתטית עם היסטוריה עשירה בביוטכנולוגיה תעשייתית5,27,28,29 וכמערכת מודל לחקר חלוקת תאים ורגולציה גנטית באקטינובקטריה30,31,32. זן הסוג העיקרי, S. venezuelae ATCC 10712, יש גנום גדול יחסית של 8.22 Mb עם 72.5% תוכן G +C (%) (מספר גישה: CP029197), המקודד 7377 רצפי קידוד, 21 rRNAs, 67 tRNAs, ו 30 אשכולות גנים biosynthetic27. בביולוגיה סינתטית, S. venezuelae ATCC 10712 הוא שלדה אטרקטיבית לביטוי ההטרולוגי של מסלולים biosynthetic. שלא כמו רוב כתמי סטרפטומיצ'ס האחרים, הוא מספק מספר יתרונות מרכזיים, כולל זמן הכפלה מהיר (~ 40 דקות), מגוון רחב של כלים גנטיים וניסיוניים5,28, חוסר גושי תפטיר, וספורציה במדיה נוזלית28,33. מספר מחקרים הדגימו גם את השימוש ב- S. ונצואלה לייצור הטרולוגי של מגוון רחב של מטבוליטים משניים, כולל פוליקטידים, פפטידים ריבוזומליים ולא ריבוסומיים34,35,35,36,37,38. תכונות משולבות אלה הופכות את הזן הזה למארח מיקרוביאלי אטרקטיבי לביולוגיה סינתטית ויישומי הנדסה מטבולית. בעוד S. ונצואלה אינה מודל סטרפטומיצ'ס הדומיננטי לביטוי גנים הטרולוגיים, עם התפתחויות נוספות, היא מוכנה לשימוש רחב יותר בתוך גילוי מוצרים טבעיים.
כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט (איור 1) עבור מערכת TX-TL של S. ונצואלה בעלת תפוקה גבוהה, שעודכנה מהפרוטוקול המקורי שפורסם בעבר26. בעבודה זו, פתרון האנרגיה ותנאי התגובה עברו אופטימיזציה כדי להגדיל את תפוקת החלבון עד 260 מיקרוגרם / מ"ל עבור חלבון כתב mScarlet-I בתגובת אצווה של 4 שעות, 10 μL, באמצעות פלסמיד סטנדרטי, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. פלסמיד זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר שיטות שונות של זיהוי ביטוי חלבון. הפרוטוקול גם יעיל, בעוד שמערכת האנרגיה עברה אופטימיזציה כדי להפחית את המורכבות והעלות של הגדרת תגובות ללא תאים מבלי להתפשר על התשואה. יחד עם מערכת TX-TL הממוטבת, פותחה ספרייה של חלקים גנטיים לביטוי גנים לכוונון עדין וכלים פלואורסצנטיים לניטור TX-TL בזמן אמת, ובכך נוצרה פלטפורמה רב-תכליתית לביטוי גנים אב-טיפוס ולמסלולים ביוסינתזיים של מוצרים טבעיים מסטרפטומיצ'ס spp. ו- Actinobacteria הקשורים.
בעבודה זו, הפלסמיד הסטנדרטי המומלץ (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) יכול לשמש להקמת זרימת העבודה של S. venezuelae TX-TL במעבדה חדשה והוא זמין ב- AddGene (ראה טבלה משלימה S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I מספק למשתמש את הגמישות ללמוד מסגרות קריאה פתוחות אחרות (ORFs). mScarlet-I ORF ממוטב קודון לביטוי הגנים של S. venezuelae. מקדם SP44 הוא מקדם מכונן חזק כי הוא פעיל מאוד הן E. coli ו Streptomyces spp.39. הפלסמיד כולל שני אתרי אנזימי הגבלה ייחודיים (NdeI, BamHI) כדי לאפשר שיבוט משנה של ORFs חדשים במסגרת עם תג דגל מסוף C משותף ומערכת תג סיכות ראש ארסנית פלואורסצ'ין (FlAsH). לחלופין, ניתן להסיר את שני התגים עם הכללת קודון עצירה לאחר שיבוט משנה של גן חדש. עם וקטור הבסיס הזה, הוכח הביטוי בעל התפוקה הגבוהה של מגוון חלבונים, כלומר חלבונים ממסלול הביוסינתזה האוקסיטקסטילציקלין וסינתטאז פפטיד לא אופייני (NRPS) מסטרפטומיצ'ס רימוזוסוס (איור 2). במונחים של זיהוי mRNA, pTU1-A-SP44-mScarlet-I פלסמיד סטנדרטי מכיל aptamer dBroccoli (באזור 3'-untranslated) לגילוי עם 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinonee (DFHBI) בדיקה. לקבלת גמישות מוגברת, ערכת כלים של חלקי MoClo תואמי EcoFlex40 הפכה לזמינה גם ב- AddGene, כולל וקטור שאטל סטרפטומיצ'ס תואם EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) ומגוון פלסמידים וריאנט pTU1-A-SP44 המבטאים חלבון פלואורסצנטיות ירוק סופר-תיקייתי (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I ו- β-glucuronidase (GUS). בפרט, pSF1C-A plasmid נגזר pAV-gapdh28 והוא נרפא של אתרי BsaI / BsmBI להרכבה MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP שווה ערך ל-pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP מ-EcoFlex40, אך מכיל פונקציונליות נוספת להטיה ואינטגרציה כרומוזומלית בסטרפטומיצ'ים spp. באמצעות מערכת integrase phiC3128.
השלב הראשון של הפרוטוקול כרוך בצמיחה של S. ונצואלה ATCC 10712 או זן קרוב, קציר תאים בשלב אמצע מעריכי, שלבי שטיפת תאים, ושיווי משקל במאגרי S30A ו- S30B. שלב זה דורש שלושה ימים, ואת הזמן לצמיחת התא יכול לשמש כדי להכין את הרכיבים הנותרים כמתואר להלן. התאים שנקטפו הם אז lysed על ידי sonication, הובהר, ולעבור תגובה בורחת. בשלב זה של הכנה, תמציות התא יכול להיות מוכן לאחסון לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F) כדי למזער את אובדן הפעילות. עבור הרכבה של תגובות TX-TL באמצעות פרוטוקול זה, Streptomyces מאסטר Mix (SMM) מוצג, עם אפשרות של תבנית פתרון אנרגיה מינימלית (MES) המעניקה תשואות דומות. כמו כן, מומלץ פס תרבות טרייה של S. ונצואלה ATCC 10712 ממלאי גליצרול -80 °C (80 °F) על צלחת אגר חדר כושר ודגור ב 28 °C (68 °F) לפחות 48-72 שעות עד מושבות בודדות גלויים. יש להשתמש רק בתרבויות טריות עבור השלבים הבאים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 L UltraYield Flask</td>
			<td>Thomson</td>
			<td>931136-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA (&#62;93%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black/Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10692202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>44722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, &#62;99%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>G32040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI (&#8805;98% - HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>MB1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-363644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Free Acid (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>B2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>494356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70167-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>807491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl sulfate) potassium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS amino acid sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (99%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>94554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>505471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Melford</td>
			<td>Y1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platereader</td>
			<td>BMG</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications

סטרפטומיצ'ים spp. הם מקור עיקרי של אנטיביוטיקה קלינית וכימיקלים תעשייתיים. סטרפטומיצ'ס ונצואלה ATCC 10712 הוא זן הגדל במהירות ויצרן טבעי של כלורמפניקול, ג'דומיניצין ופיקרומיצין, מה שהופך אותו למועמד אטרקטיבי כשלדה ביולוגית סינתטית מהדור הבא. לכן, כלים גנטיים המאיצים את הפיתוח של S. ונצואלה ATCC 10712, כמו גם מודלים אחרים של סטרפטומיצ'ס spp. , רצויים מאוד להנדסת מוצר טבעי וגילוי. לשם כך, מערכת ייעודית S. venezuelae ATCC 10712 ללא תאים מסופקת בפרוטוקול זה כדי לאפשר ביטוי הטרולוגי בעל תפוקה גבוהה של גנים G+C גבוהים (%) פרוטוקול זה מתאים לתגובות אצווה בקנה מידה קטן (10-100 μL) בתבנית צלחת 96-well או 384-well, בעוד התגובות עשויות להיות מדרגיות. המערכת נטולת התאים חזקה ויכולה להשיג תשואות גבוהות (~5-10 μ M) עבור מגוון חלבונים רקומביננטיים במערך מינימלי. עבודה זו משלבת גם ערכת כלים פלסמידית רחבה למדידה בזמן אמת של mRNA וסינתזת חלבונים, כמו גם כתמי פלואורסצנטיות בג'ל של חלבונים מתויגים. פרוטוקול זה יכול להיות משולב גם עם זרימות עבודה אפיון ביטוי גנים תפוקה גבוהה או המחקר של מסלולי אנזים מ G + C גבוה (%) גנים נוכחים בגנום Actinomycetes.

פרוטוקול מפורט זה מסופק כדוגמה כדי לסייע למשתמש להקים מערכת Streptomyces TX-TL המבוססת על זן הדגם ATCC 10712 של S. ונצואלה (איור 1). המשתמש עשוי לבקש לחקור זנים אחרים סטרפטומיצ'ס; עם זאת, שלבי הצמיחה/קציר של זנים אחרים עם זמני הכפלה ארוכים יותר או העדפות צמיחה ברורות יצטרכו ל...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications at JoVE.com

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

פרוטוקול זה מפרט שיטה משופרת לסינתזה של תשואות גבוהות של חלבונים רקומביננטיים ממערכת תרגום שעתוק ללא תאים (TX-TL) של סטרפטומיצ'ס ונצואלה .

ערכת כלים לתרגום תמלול סטרפטומיצ'ס בתפוקה גבוהה לביולוגיה סינתטית ויישומי מוצרים טבעיים

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

הפרוטוקול שלנו מספק זרימת עבודה פשוטה יותר עבור סטרפטומיצ'ס ונצואלה - תרגום תמלול ללא תאים. המערכת שלנו רותמת את האנזימים והמסלולים המטבוליים מהאורגניזם הלא-מודלי הזה. היתרונות העיקריים הם הביטוי ההטרולוגי של גנים עם תוכן GC גבוה, מתן סביבת העברת חלבונים נוחה, ומערכת פתוחה לכוונון עדין של מסלולים biosynthetic.השיטה שלנו תפתח הזדמנויות חדשות לחקר סטרפטומיצ'ים וחיידקי GC גבוהים הקשורים. זה מאפשר לחקור אנזימים וביטוי גנים בחיידקים אלה. טכניקה זו פותחה כדי להקל על היישום על ידי משתמשים חדשים.הצעד היחיד שדורש ניסיון קודם או היכרות הוא sonication לייצר תמציות גולמיות פעילות מאוד. כדי להתחיל לקצור את התאים בתרבית מראש ביום השלישי, לדלל את תרבית הלילה ביחס של אחד ל -10 עם מדיום GYN טרי עבור צפיפות אופטית או מדידת OD ב 600 ננומטר. אם OD של התרבות ב 600 ננומטר הוא פחות מ 0.3, להגדיל את מהירות הרעידות ל 250 עד 300 סיבובים לדקה ולגדול עד OD מגיע 0.3.לגדול במשך לא יותר משעתיים נוספות. אם OD גדול מ-0.3, העבירו את התרביות למיכלי צנטריפוגה והתקררו במהירות על קרח רטוב למשך 30 דקות. בזמן ההמתנה לתרבות התאים להתקרר, להכין ארבעה מיליליטרים של טרי אחד טוחן dithiothreitol, S30A ו S30B חוצצים ולשמור אותם על קרח.לאחר שקילה צינור צנטריפוגה ריק 50 מיליליטר, מראש לצנן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. מוסיפים שני מיליליטרים של dithiothreitol טוחן אחד לליטר אחד של חיץ S30A על קרח ומערבבים היטב. צנטריפוגה התאים ב 6, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת supernatant בתנועה מהירה, להוסיף 250 מיליליטר של חיץ S30A ו resuspened התאים על ידי ניעור בקבוקי צנטריפוגציה במרץ עד גושי התא מפוזרים הומוגנית. ואז צנטריפוגה התאים שוב במשך שש דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולחזור על התוספת של מאגר S30A, ואחריו צנטריפוגה כפי שהוכח.לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטר של DTT טוחן אחד לליטר אחד של חיץ S30B על קרח ומערבבים היטב. הוסף 250 מיליליטר של מאגר S30B לתאים וחזור על צנטריפוגה. Resuspend את גלולה התא ב 10 מיליליטר של מאגר S30B ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ששוקלל מראש מראש.במידת הצורך, להעביר את התאים השיוריים עם חמישה עד 10 מיליליטר נוספים של מאגר S30B ולמלא את הצינור לנפח 50 מיליליטר עם S30B. צנטריפוגה התאים במשך 10 דקות. השלך את supernatant ולחזור על צנטריפוגה בהגדרות קודמות כפי שהודגם.לאחר השלכת supernatant, לשאוף את S30B supernatant הנותרים עם פיפטה 100 עד 200 microliter ולשקול את גלולה התא הרטוב. עבור כל גרם אחד של תאים רטובים, להוסיף 0.9 מיליליטר של מאגר S30B. הגדילו מחדש את התאים באמצעות פיפטת פסטר או מערבולת.צנטריפוגה לזמן קצר במשך כ 10 שניות עד 500 G כדי לשקם את התאים. מנמיכים את קצה sonicator לתוך ההשעיה התא עד הקצה הוא כ סנטימטר אחד מתחת לפני השטח הנוזלי. קלט פרמטרים שונים בהגדרות sonicator.הגדר את התדירות ל-20 קילוהרץ, משרעת ל-65% דופק בזמן לסירוגין ל-10 שניות, וזמן sonication כולל לדקה אחת. התחל sonication ולהזיז את הצינור למעלה או למטה לצדדים במהלך שני מחזורי המנוחה הראשונים כדי להבטיח את התאים הם sonicated באופן שווה. אם התאים אינם lysed מלא, להפוך את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים ולחזור על sonication עבור מחזור נוסף אחד או שניים 10 שניות עם ערבוב תכוף עד התאים הם שיבשו לחלוטין.צנטריפוגה התאים lysed כדי להסיר את פסולת התא, ולאחר מכן להעביר את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge כמו aliquot מיליליטר אחד. לתגובת נגר של תמציות התא, לדגור על התא המכיל את תמצית התא ב 30 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות על בלוק חום או באינקובטור ללא שייקר. לתגובת תרגום שעתוק, להפשיר את תמצית התא SMM או תמיסת MES ו- DNA plasmid על קרח.לפני לצנן צלחת 384-well ב מינוס 20 מעלות צלזיוס. הגדר את תגובת תרגום שעתוק על הקרח שבו 25% מהנפח הוא DNA פלסמיד, 33.33% הוא תמצית תאים ו 41.67% הוא פתרון SMM. מערבבים בעדינות את התערובת במשך כחמש שניות בסביבה במהירות נמוכה כדי להבטיח את הפתרון הוא הומוגני תוך הימנעות קצף או היווצרות בועות.העבר שלושה aliquots של 10 microliters לשלוש בארות של צלחת 384 באר כמו משולש טכני מבלי להציג בועות אוויר. לאחר איטום הצלחת עם כיסוי שקוף, לסובב את הצלחת ב 400 פעמים G במשך חמש שניות ולדגור את התגובה ב 28 מעלות צלזיוס או באינקובטור או קורא צלחת בלי לרעוד. תרגום שעתוק ללא תאים של סטרפטומיצ'ס ונצואלה עבר אופטימיזציה לביטוי תפוקה גבוהה של חלבונים פלואורסצנטיים מהפלסמיד הסטנדרטי pTU1-A-SP44, כמו גם אנזימים ביוסינתזה שזוהו על ידי אלקטרופורזה ג'ל.הביטוי של pTU1-A-SP44-mScarlet-I פלסמיד סטנדרטי נמדד באמצעות מספר שיטות. מדידות הפלואורסצנטיות בזמן אמת של mRNA באמצעות aptamer dBroccoli RNA, חלבון mScarlet-I לא בוגר באמצעות מערכת תג FlAsH, וחלבון mScarlet-I בוגר בוצעו. כתמי הפלואורסצנטיות בג'ל של mScarlet-I באמצעות תג FlAsH נערכו בנוסף להכתמת Coomassie Blue של סך החלבון ללא תאים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות פעילות לחקר אנזימים ומסלולים מאתגרים בשיטות סטנדרטיות. זה גם משתרע לקראת ביוסינתזה מוגדלת וביטוי גנים תפוקה גבוהה. אנו מפתחים טכניקה זו כדי לחקור אנזימים מטבוליים מחיידקי GC גבוהים.הראינו את הפוטנציאל של המערכת שלנו לחקור ביוסינטזה מוגדלת בתגובות ללא תאים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

Toolkit כדי לאפשר גיור פחמימן בסביבות מימיות

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

הכנה מהירה מיקס של Bioinspired ננומטריים Hydroxyapatite עבור יישומים ביו-רפואיים

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

סינתזה של צינורות פחמן עם קירות רב שופרת סילבר חלקיקים והערכה של פעילות אנטיבקטריאליות שלהם ומאפיינים ציטוטוקסיות

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording

ערכת כלים בקוד פתוח: מערך מיקרו-אלקטרוניקה של סיבי פחמן עבור הקלטת עצבים

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This ...