Name: a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00
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저자는 다음과 같은 연구 지원을 인정하고 싶습니다: PSF와 PDRA로 SJM에 대한 EPSRC [EP/K038648/1]; 웰컴 트러스트는 런던 임페리얼 칼리지에서 PSF와 SJM을 위한 ISSF 펠로우십을 후원했습니다. 왕립 학회 연구 보조금 [RGS\R1\191186]; 웰컴 트러스트 시드 상 [217528/Z/19/Z] 켄트 대학에서 SJM에 대 한; 켄트 대학교에서 KC를 위한 글로벌 챌린지 연구 기금(GCRF) 박사 장학금.

참고: GYM 매체 및 한천 플레이트 및 S30A 및 S30B 세척 버퍼용 레시피는 표 1 및 표 2 를 참조하십시오.
1. 솔루션 준비 및 일반 지침
<ol><li>예외가 명시되지 않는 한 준비 후 모든 솔루션, 세포 (성장 후) 및 세포 추출물을 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>Mg-글루타메이트 1개, M-K-글루타메이트 4M, PEG 6000, 실온1g/mL 폴리비닐술포닉산, -80°C의 기타 모든 주식에 ?...

이 원고에서는 고수익 S. 베네수엘라 TX-TL 프로토콜이 TX-TL 시스템의 숙련된 사용자와 신규 사용자 모두를 위해 간단하게 수행할 수 있는 상세한 단계로 설명되었습니다. 기존 연쇄상 구균45 및 대장균 TX-TL41 프로토콜의 여러 기능이 제거되어 S. 베네수엘라 TX-TL5,26에 대한 최소하면서도 고수율 프로토콜을 확립했습니다.</s...

세포 없는 전사 번역(TX-TL) 시스템은 합성 생물학을 위한 개념 엔지니어링 프레임워크인 신속한 설계-빌드-테스트 학습 주기를 구현하기 위한 합성 생물학을 위한 이상적인 프로토타이핑 플랫폼을 제공합니다1. 또한, 개방형 반응 환경에서 고부가가치 재조합 단백질 생산을 위한 TX-TL 시스템에 대한 관심이 증가하고 있다2, 예를 들어, 항체-약물 컨쥬게이트에 비표준 아미노산을 통합하는 3. 구체적으로, TX-TL은 세포 추출물, 플라스미드 또는 선형 DNA, 및 단백질 합성을 배치 또는 반연속 반응으로 촉매하는 에너지 용액을 필요로 한다. 대장균 TX-TL이 지배적인 세포 없는 시스템이지만, 다수의 신흥 비모델 TX-TL 시스템은 다양한 응용 분야에서 주목을 받고 있습니다4,5,6,7,8. TX-TL의 주요 장점은 유연한 확장성(나노리터에서 리터 스케일까지)9,10, 강력한 재현성 및 자동화된 워크플로우8,11,12를 포함합니다. 특히 TX-TL의 자동화는 유전적 부품 및 규제 요소의 가속화된 특성화를 허용합니다8,12,13.
반응 설정의 관점에서, TX-TL은 아미노산, 보조 인자, 첨가제 및 템플릿 DNA 서열뿐만 아니라 1 차 및 이차 에너지 원을 모두 필요로한다. 뉴클레오티드 트리포산염(NTP)은 초기 mRNA(ATP, GTP, CTP 및 UTP) 및 단백질 합성(ATP 및 GTP만)을 구동하는 1차 에너지원을 제공한다. TX-TL 수율을 높이기 위해 NTP는 말토세14, 말토덱스트린15, 글루코스14, 3-인지질(3-PGA) 16, 인포에놀피루바테17 및 L-글루타메이트18과 같은 이차 에너지원의 이화성을 통해 재생됩니다. 이 내재된 신진 대사 활동은 의외로 다재다능하지만, 특히 신흥 TX-TL 시스템에서 제대로 연구되지 않았습니다. 각 에너지원은 ATP 수율, 화학 적 안정성 및 비용 면에서 뚜렷한 특성과 장점을 가지고 있으며, 이는 확장 된 TX-TL 반응에 중요한 고려 사항입니다. 지금까지 , 대장균 TX-TL에 대한 현재 프로토콜은 모델 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대한 4.0 mg / mL (~157 μM)까지 도달했으며, 3-PGA (30 mMM), 말토덱스트린 (60 mMM), D-ribose (30mMM)를 이차 에너지원으로 혼합하여 19 9 9 99.
최근에는 TX-TL 시스템에서 이차 대사산물 생합성 경로 연구에 대한 관심이 높아지고 있다20,21,22. 특히, Actinobacteria는 항생제와 농업 화학 물질을 포함하여 이차 대사 산물의 주요 근원입니다23,24. 그들의 게놈은 이차 대사 산물 생합성을 위한 효소 통로를 인코딩하는 소위 생합성 유전자 클러스터 (BGCs)로 풍부합니다. Actinobacteria 유전 적 부분 및 생합성 경로의 연구를 위해, 연쇄상 구균 기지를 둔 TX-TL 시스템의 범위는 최근에 개발되었습니다5,6,25,26. 이러한 전문 연쇄상 구균 TX-TL 시스템은 다음 이유로 잠재적으로 유익하다: [1] 연쇄상 구균 spp.26에서 효소에 대한 네이티브 단백질 접이식 환경의 제공; [2] 높은 G+C(%) 유전자 발현을 위한 최적의 tRNA 풀에 대한 접근; [3] 활성 1 차 물질 대사, 잠재적으로 생합성 선구자의 공급에 대 한 납치 될 수 있는; 및 [4] 네이티브 세포 추출물에 존재하는 이차 대사로부터 효소, 전구체 또는 보조인의 제공. 따라서 최근 이러한 고유한 기능을 활용하기 위해 고수성 S.베네수엘라 TX-TL 툴킷이 설립되었습니다.
연쇄상 구균 베네수엘라는 산업 생명 공학의 풍부한 역사를 가진 합성 생물학을위한 신흥 호스트입니다5,27,28,29 및 Actinobacteria30,31,32에서 세포 분열 및 유전 규제를 연구하기위한 모델 시스템으로. 주요 형 균주, S. 베네수엘라 ATCC 10712, 72.5 % G + C 함량 (%) (가입 번호 : CP029197)와 8.22 Mb의 상대적으로 큰 게놈을 가지고, 이는 7377 코딩 서열, 21 rRNA, 67 TRNA, 30 바이오 합성 유전자 클러스터를 인코딩277. 합성 생물학에서, S. 베네수엘라 ATCC 10712생합성 경로의 이종 발현에 대한 매력적인 섀시입니다. 대부분의 다른 연쇄상 구균 얼룩과는 달리, 그것은 몇 가지 주요 장점을 제공합니다, 빠른 두 배로 시간 (~40 분), 유전 및 실험 도구의 광범위한 범위5,28, 균사 응집의 부족, 액체 media28,33에서 포자. 몇몇 연구 결과는 또한 폴리케티드, 리보소말 및 비리보소말 펩타이드34,35,36,37,38을 포함하여 이차 대사 산물의 다양한 배열의 이종생산을 위한 S. 베네수엘라의 사용을 입증했습니다. 이러한 결합된 특징은 이 균주가 합성 생물학 및 신진 대사 공학 응용을 위한 매력적인 미생물 호스트로 만듭니다. S. 베네수엘라는 이종 유전자 발현에 대한 지배적 인 연쇄상 구균 모델은 아니지만, 추가 개발과 함께 천연 제품 발견 내에서 더 넓은 사용을 위해 준비됩니다.
이 원고는 이전에 게시된 원래 프로토콜26에서 업데이트된 고수율 S. 베네수엘라 TX-TL 시스템에 대한 자세한 프로토콜(그림 1)을 제공합니다. 이 작품에서 에너지 용액 및 반응 조건은 표준 플라스미드, pTU1-A-SP44-mScarlet-I를 사용하여 4시간, 10 μL 배치 반응에서 mScarlet-I 리포터 단백질에 대해 최대 260 μg/mL 의 단백질 수율을 증가시키기 위해 최적화되었다. 이 플라스미드는 단백질 발현을 검출하는 다양한 방법을 가능하게 하기 위해 특별히 고안되었습니다. 또한 프로토콜은 간소화되고 에너지 시스템은 수율을 손상시키지 않으면서 세포 없는 반응을 설정하는 복잡성과 비용을 줄이기 위해 최적화되었습니다. 최적화된 TX-TL 시스템과 함께, 유전자 발현을 미세 조정하고 TX-TL을 실시간으로 모니터링하기 위한 형광 도구로 유전 부품 라이브러리가 개발되어 연쇄상 구균 스PP및 관련 액티노박테리아로부터 유전자 발현 및 천연 생성 물 합성 경로를 프로토타이핑할 수 있는 다목적 플랫폼을 조성하고 있습니다.
이 작품에서 권장표준 플라스미드(pTU1-A-SP44-mScarlet-I)는 새로운 실험실에서 S. 베네수엘라 TX-TL 워크플로우를 설정하는 데 사용할 수 있으며 AddGene에서 사용할 수 있습니다(보충 표 S1 참조). pTU1-A-SP44-mScarlet-I는 사용자에게 다른 개방형 읽기 프레임(ORF)을 학습할 수 있는 유연성을 제공합니다. mScarlet-I ORF는 S. 베네수엘라 유전자 발현에 최적화되어 있습니다. SP44 프로모터는 대장균과 연쇄상 구균 spp.39 모두에서 매우 활동적인 강력한 구성 프로모터입니다. 플라스미드에는 두 개의 독특한 제한 효소 사이트(NdeI, BamHI)가 있어 새로운 ORFs의 서브 클론링을 조인트 C 단말 플래그 태그와 플루오레세인 아르소네시 형 헤어핀(FlAsH) 바인더 태그 시스템으로 프레임 내의 서브 클론링을 허용합니다. 대안적으로, 두 태그는 새로운 유전자를 서브 복제 한 후 정지 코돈의 포함으로 제거 될 수있다. 이러한 염기 벡터를 통해, 다양한 단백질의 고수율 발현이 입증되었으며, 즉 옥시테트라사이클린 생합성 경로로부터의 단백질과 연쇄상구균리모서스로부터의 비리보소말 펩타이드 합성술(NRPS)이 입증되었다(도 2). mRNA 검출측면에서, pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드에는 3,5-디플루오로-4-하이드록시벤졸리덴 imidazolinone(DFHBI) 프로브를 검출하기 위한 dBroccoli aptamer(3'-untranslated region)가 포함되어 있습니다. 유연성을 높이기 위해 AddGene에서 EcoFlex40 호환 MoClo 부품의 도구 집합도 제공되었습니다. 에코플렉스 호환 연쇄상 구균 셔틀 벡터(pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) 및 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I, 및 β-글루큐론(GUS)을 발현하는 다양한 pTU1-A-SP44 변형 플라스미드를 포함한다. 특히, pSF1C-A 플라스미드는 pAV-gapdh28로부터 유래되고 MoClo 어셈블리를 위한 BsaI/BsmBI 부위의 경화된다. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP는 EcoFlex40의 pTU1-A-RFP/pTU2-RfP와 동일하지만 연쇄상 구균 스프의 융합 및 염색체 통합을 위한 추가 기능이 포함되어 있습니다. phiC31 integrase 시스템을 사용하28.
프로토콜의 첫 번째 단계는 S. 베네수엘라 ATCC 10712 또는 밀접하게 관련된 균주의 성장, 중간 지수 상에서 세포 수확, 세포 세척 단계 및 S30A 및 S30B 버퍼의 평형을 포함한다. 이 단계는 3 일이 필요하고, 세포 성장을위한 시간은 아래에 설명 된 바와 같이 나머지 구성 요소를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 수확된 세포는 초음파 처리에 의해 용해되고, 명확히 하고, 런오프 반응을 겪습니다. 준비의 이 마지막 단계에서, 세포 추출물은 활동의 손실을 최소화하기 위해 -80 °C에서 장기 저장을 위해 준비될 수 있다. 이 프로토콜을 사용하여 TX-TL 반응의 어셈블리를 위해 유사한 수율을 제공하는 최소한의 에너지 솔루션 형식(MES)의 옵션으로 연쇄상 골 수 마스터 믹스(SMM)가 제공됩니다. 또한, -80°C 글리세롤 스톡으로부터 S. 베네수엘라 ATCC 10712의 신선한 배양을 체육관 한천판에 적시고, 단일 식민지가 보일 때까지 최소 48-72h이상 28°C에서 배양하는 것이 좋습니다. 다음 단계에는 신선한 문화만 사용해야 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 L UltraYield Flask</td>
			<td>Thomson</td>
			<td>931136-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA (&#62;93%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black/Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10692202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>44722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, &#62;99%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>G32040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI (&#8805;98% - HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>MB1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-363644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Free Acid (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>B2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>494356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70167-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>807491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl sulfate) potassium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS amino acid sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (99%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>94554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>505471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Melford</td>
			<td>Y1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platereader</td>
			<td>BMG</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications

연쇄상 구균 spp. 임상 항생제와 산업 화학 물질의 주요 소스. 연쇄상 구균 베네수엘라 ATCC 10712는 빠르게 성장하는 균주와 클로람페니콜, 자도마이신 및 피크로마이신의 천연 생산업체로 차세대 합성 생물학 섀시로서 매력적인 후보로 만듭니다. 따라서 S. 베네수엘라 ATCC 10712의 개발을 가속화하는 유전 적 도구뿐만 아니라 다른 연쇄상 구균 spp. 모델은 천연 제품 엔지니어링 및 발견에 매우 바람직합니다. 이를 위해, 전담 S. 베네수엘라 ATCC 10712 세포 없는 시스템은 높은 G+C(%) 유전자의 고수율 이종 발현을 가능하게 하기 위하여 이 프로토콜에 제공됩니다. 이 프로토콜은 96-well 또는 384웰 플레이트 형식으로 소규모(10-100 μL) 배치 반응에 적합하며 반응은 잠재적으로 확장 가능합니다. 세포 없는 시스템은 견고하며 최소한의 설정으로 다양한 재조합 단백질에 대해 높은 수율(~5-10 μ M)을 달성할 수 있습니다. 이 작품은 또한 mRNA와 단백질 합성의 실시간 측정을 위한 광범위한 플라스미드 툴셋뿐만 아니라 태그가 지정된 단백질의 인겔 형광 염색을 통합합니다. 이 프로토콜은 또한 액티노미세테스 게놈에 존재하는 높은 G+C(%) 유전자에서 효소 통로의 높은 처리량 유전자 발현 특성화 워크플로우 또는 연구와 통합될 수 있습니다.

이 상세한 프로토콜은 사용자가 S. 베네수엘라 ATCC 10712 모델 스트레인(그림 1)에 기초하여 연쇄상 구균 TX-TL 시스템을 설정하는 데 도움이 되는 예로 제공됩니다. 사용자는 다른 연쇄상 구균 균주를 연구하려고 할 수 있습니다; 그러나, 더 긴 두 배 또는 뚜렷한 성장 환경 설정을 가진 다른 균주의 성장/수확 단계피크 결과를 달성 하기 위해 사용자 정의 최?...

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A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

이 프로토콜은 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사 변환(TX-TL) 시스템에서 재조합 단백질의 높은 수율을 합성하는 향상된 방법을 자세히 설명합니다.

합성 생물학 및 천연 제품 응용 을 위한 고수성 연쇄상 구형 전사 -번역 도구 키트

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

당사의 프로토콜은 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사 번역을 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다. 우리의 시스템은 이 비모형 유기체에서 신진 대사 효소 그리고 통로를 이용합니다. 주요 장점은 높은 GC 함량을 가진 유전자의 이종 발현, 유리한 단백질 전달 환경의 제공 및 생합성 통로의 미세 조정을 위한 개방시스템입니다.우리의 방법은 연쇄상 구균 및 관련 높은 GC 박테리아를 공부에 새로운 기회를 열 것입니다. 그것은 이 박테리아에 있는 효소 그리고 유전자 발현을 공부할 수 있습니다. 이 기술은 새로운 사용자가 쉽게 구현할 수 있기 위해 개발되었습니다.사전 경험이나 친숙함을 필요로 하는 유일한 단계는 고활성 원유 추출물을 생산하는 초음파 처리입니다. 3일째에 배양전전을 시작하기 위해, 600나노미터에서 광학 밀도 또는 OD 측정을 위한 신선한 GYN 배지로 1대10의 비율로 야간 배양을 희석한다. 600 나노미터에서 배양의 OD가 0.3 미만인 경우, 흔들림 속도를 분당 250 내지 300회전으로 증가시키고 OD가 0.3에 도달할 때까지 성장한다.2시간 이상 더 이상 성장하지 않습니다. OD가 0.3보다 큰 경우 배양기를 원심분리 용기로 옮기고 젖은 얼음에서 30분 동안 빠르게 식힙니다. 세포 배양이 식기를 기다리는 동안, 신선한 1개의 어금니 디티오트레이톨, S30A 및 S30B 버퍼의 4밀리리터를 준비하고 얼음위에 보관하십시오.빈 50 밀리리터 원심분리기 튜브의 무게를 측정한 후 영하 20도에서 미리 식힙니다. 1개의 어금니 디티오트레이톨 2밀리리터를 얼음에 S30A 버퍼 1리터에 넣고 잘 섞습니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 6, 000배 G의 세포를 원심분리합니다.빠른 움직임으로 상체를 폐기한 후, S30A 버퍼 250밀리리터를 추가하고 세포 덩어리가 균질하게 분산될 때까지 원심 분리 병을 격렬하게 흔들어 세포를 재장판한다. 그런 다음 세포를 6 분 동안 다시 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 폐기하고 S30A 버퍼의 추가를 반복한 다음 원심 분리가 입증된 대로 진행됩니다.다음으로, 얼음에 S30B 버퍼 1리터에 1개의 어금니 DTT의 밀리리터 2밀리리터를 넣고 잘 섞습니다. 세포에 S30B 버퍼 250 밀리리터를 추가하고 원심 분리를 반복합니다. S30B 버퍼의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 전무게 가성비 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 세포 현탁액을 전달한다.필요한 경우 잔류 세포를 S30B 버퍼의 5~10밀리리터로 옮기고 튜브를 S30B로 50밀리리터 부피로 채웁니다. 세포를 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 설명한 대로 이전 설정에서 원심 분리를 반복합니다.상체를 폐기한 후, 나머지 S30B 슈퍼팔레트를 100~200 마이크로리터 파이펫으로 흡인시키고 젖은 셀 펠릿의 무게를 측정한다. 젖은 셀 1그램당 S30B 버퍼 0.9 밀리리터를 추가합니다. 파스퇴르 파이펫 또는 소용돌이를 사용하여 세포를 다시 중단합니다.원심분리기는 세포를 퇴적시키기 위해 최대 500G까지 약 10초 동안 간략하게 한다. 팁이 액체 표면 아래 약 1센티미터가 될 때까지 초음파 처리기 팁을 셀 서스펜션으로 낮춥춥시다. 초음파 처리기 설정에서 다른 매개 변수를 입력합니다.주파수를 20킬로헤르츠로 설정하고, 진폭은 65%펄스온및 오프 시간 에서 10초로, 총 초음파 처리 시간을 1분으로 설정합니다. 초음파 처리를 시작하고 세포가 균등하게 초음파 처리되도록 처음 두 휴식 주기 동안 튜브를 위 또는 아래로 옆으로 이동합니다. 세포가 완전히 제거되지 않으면 튜브를 2~3회 반전시키고 세포가 완전히 중단될 때까지 빈번한 혼합을 통해 1~2초 주기의 초음파 처리를 반복한다.세포 잔해를 제거하기 위해 리시드 세포를 원심 분리한 다음 1밀리리터 알리쿼트로 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상피체를 전달합니다. 세포 추출물의 유출 반응의 경우, 셀 추출물을 함유하는 세포를 30°C에서 60분간 열 블록 또는 셰이커 없이 인큐베이터에 배양한다. 전사-번역 반응의 경우, 세포 추출물 SMM 또는 MES 용액및 얼음에 플라스미드 DNA를 해동한다.영하 20도에서 384웰 플레이트를 미리 식힙니다. 부피의 25%가 플라스미드 DNA인 얼음상에 전사-번역 반응을 설정하면, 33.33%는 세포 추출물이고 41.67%는 SMM 용액이다. 발포 또는 거품 형성을 피하면서 용액이 균일하다는 것을 보장하기 위해 저속 설정에서 약 5 초 동안 혼합물을 부드럽게 소용돌이시킵니다.기포를 도입하지 않고 기술 삼중 판으로 10 마이크로 리터의 세 개의 알리쿼트3 개소로 전송합니다. 투명 커버로 플레이트를 밀봉한 후 5초 동안 400회 G로 플레이트를 회전시키고 인큐베이터 또는 플레이트 판독기에서 28도의 반응에 복유합니다. 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사-번역은 pTU1-A-SP44 표준 플라스미드로부터형 광등 단백질의 고수율 발현뿐만 아니라 겔 전기포에 의해 검출된 생합성 효소에 최적화되었다.pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드의 발현은 여러 가지 방법을 사용하여 측정되었다. dBroccoli RNA aptamer를 이용한 mRNA의 실시간 형광 측정, FlAsH 태그 시스템을 이용한 미성숙 mScarlet-I 단백질, 성숙한 mScarlet-I 단백질이 수행되었다. FlAsH 태그를 사용하여 mScarlet-I의 인겔 형광 염색은 총 세포 없는 단백질의 쿠마시 블루 염색에 더하여 수행되었다.이 절차에 따라, 활동 법은 표준 방법을 사용하여 도전적인 효소와 경로를 연구하기 위하여 수행될 수 있습니다. 그것은 또한 확대 된 생합성 및 높은 처리량 유전자 발현으로 확장. 우리는 높은 GC 박테리아에서 신진 대사 효소를 연구하기 위해이 기술을 개발하고 있습니다.우리는 세포 없는 반응에 있는 생합성을 확장한 연구하는 우리의 시스템의 잠재력을 보여주었습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

수성 환경에서 탄화수소 전환을 사용하는 툴킷

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

연구

생체공학

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

살아있는 세포를 엔지니어하는 합성 생물학을 사용하여 해당 프로그램 자료와 인터페이스

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 Bioinspired 나노 수산화 인회석의 빠른 혼합 준비

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

나노 입자와 그들의 항균 활동 및 세포 독성 속성의 평가 수정 다중 벽 탄소 나노튜브의 합성

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

세포 및 약물 전달 응용 을 위한 주사용 수급 분자 고분자 고분자 나노 입자 하이드로겔

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording

오픈 소스 툴킷: 신경 기록을 위한 벤치탑 탄소 섬유 마이크로전디 어레이

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This ...