Name: a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00
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Os autores gostariam de reconhecer o seguinte suporte à pesquisa: EPSRC [EP/K038648/1] para SJM como PDRA com PSF; Wellcome Trust patrocinou bolsa issf para SJM com PSF no Imperial College London; Bolsa de pesquisa da Royal Society [RGS\R1\191186]; Prêmio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] para SJM na Universidade de Kent; e Global Challenges Research Fund (GCRF) Bolsa de doutorado para KC na Universidade de Kent.

NOTA: Veja a Tabela 1 e a Tabela 2 para receitas para placa de ágar e tampão de lavagem S30A e S30B.
1. Elaboração de soluções e orientação geral
<ol><li>Mantenha todas as soluções, células (pós-crescimento) e extratos celulares no gelo após a preparação, a menos que uma exceção seja declarada.</li>
	<li>Estoques de armazenamento para 1 M Mg-glutamato, 4 M K-glutamato, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/mL de ácido polivinylsulfônico à temperatura a...

Neste manuscrito, um protocolo S. venezuelae TX-TL de alto rendimento foi descrito com etapas detalhadas que são simples de conduzir tanto para usuários experientes quanto para novos usuários de sistemas TX-TL. Vários recursos dos protocolos Streptomyces45 e E. coli TX-TL41 foram removidos para estabelecer um protocolo mínimo, mas de alto rendimento para o S. venezuelae TX-TL5,26.<...

Os sistemas de tradução de transcrição sem células (TX-TL) fornecem uma plataforma ideal de prototipagem para biologia sintética para implementar ciclos rápidos de projeto-construção-teste-aprender, a estrutura de engenharia conceitual para biologia sintética1. Além disso, há um crescente interesse em sistemas TX-TL para a produção de proteína recombinante de alto valor em um ambiente de reação aberta22, por exemplo, para incorporar aminoácidos não-padrão em conjugados de anticorpos 3. Especificamente, tX-TL requer um extrato celular, DNA plasmídeo ou linear, e uma solução energética para catalisar a síntese proteica em reações em lote ou semicontinuos. Enquanto o Escherichia coli TX-TL é o sistema dominante sem células, vários sistemas TX-TL não-modelo emergentes têm atraído atenção para diferentes aplicações4,5,6,7,8. As principais vantagens do TX-TL incluem escala flexível (nanoliter para escala de litro)9,10, reprodutibilidade forte e fluxos de trabalho automatizados8,11,12. Em particular, a automação do TX-TL permite a caracterização acelerada de partes genéticas e elementos regulatórios8,12,13.
Em termos de configuração de reação, o TX-TL requer fontes de energia primárias e secundárias, bem como aminoácidos, cofatores, aditivos e uma sequência de DNA de modelo. Os triptofatos nucleotídeos (NTPs) fornecem a principal fonte de energia para conduzir mRNA inicial (ATP, GTP, CTP e UTP) e síntese proteica (apenas ATP e GTP). Para aumentar os rendimentos de TX-TL, os NTPs são regenerados através do catabolismo de uma fonte de energia secundária, como maltose14, maltodextrina15, glicose14, 3-fosfogliceto (3-PGA)16, fosfoenolpyruvate17 e L-glutamate18. Esta atividade metabólica inerente é surpreendentemente versátil, mas mal estudada, especialmente em sistemas TX-TL emergentes. Cada fonte de energia tem propriedades e vantagens distintas em termos de rendimento ATP, estabilidade química e custo, o que é uma consideração importante para reações TX-TL dimensionadas. Até agora, os protocolos atuais para E. coli TX-TL atingiram até 4,0 mg/mL (~157 μM) para o modelo de proteína fluorescente verde (GFP), usando uma mistura de 3-PGA (30 mM), maltodextrina (60 mM) e costela D-ose (30 mM) como fonte de energia secundária19.
Recentemente, houve um crescente interesse em estudar vias biossintéticas metabólicas secundárias nos sistemas TX-TL20,21,22. Especificamente, a Actinobacteria é uma das principais fontes de metabólitos secundários, incluindo antibióticos e produtos químicos agrícolas23,24. Seus genomas são enriquecidos com os chamados aglomerados genéticos biossintéticos (BGCs), que codificam caminhos enzimáticos para a biossíntese metabólica secundária. Para o estudo de partes genéticas actinobactérias e vias biossintéticas, uma série de sistemas TX-TL baseados em Estreptomíces foram recentemente desenvolvidos5,6,25,26. Estes sistemas especializados de Estreptomia TX-TL são potencialmente benéficos pelas seguintes razões: [1] provisão de um ambiente de dobramento de proteína nativa para enzimas de Estreptomia spp.26; [2] acesso a um pool de tRNA ideal para alta expressão genética G+C (%) ; [3] metabolismo primário ativo, que potencialmente pode ser sequestrado para o fornecimento de precursores biossintéticos; e [4] provisão de enzimas, precursores ou cofatores do metabolismo secundário presentes no extrato celular nativo. Assim, um kit de ferramentas S.venezuelae TX-TL de alto rendimento foi recentemente estabelecido para aproveitar essas capacidades únicas5.
Streptomyces venezuelae é um emergente hospedeiro para biologia sintética com uma rica história em biotecnologia industrial5,27,28,29 e como um sistema modelo para estudar a divisão celular e regulação genética em Actinobacteria30,31,32. A cepa principal, S. venezuelae ATCC 10712, possui um genoma relativamente grande de 8,22 Mb com 72,5% de teor de G+C (%) (número de adesão: CP029197), que codifica 7377 sequências de codificação, 21 rRNAs, 67 tRNAs e 30 clusters genéticos biossintéticos27. Em biologia sintética, s. venezuelae ATCC 10712 é um chassi atraente para a expressão heteróloga de vias biossintéticas. Ao contrário da maioria das outras manchas de Estreptomia, ela fornece várias vantagens fundamentais, incluindo um tempo de duplicação rápida (~40 min), uma extensa gama de ferramentas genéticas e experimentais5,28, falta de agrupamento micelial e esporulação em mídia líquida28,33. Vários estudos também demonstraram o uso de S. venezuelae para produção heteróloga de uma variedade diversificada de metabólitos secundários, incluindo poliketídeos, peptídeos ribossômicos e nãoribosomais34,35,36,37,38. Essas características combinadas fazem dessa cepa um hospedeiro microbiano atraente para aplicações de biologia sintética e engenharia metabólica. Embora s. venezuelae não seja o modelo dominante de Estreptomia para expressão genética heteróloga, com desenvolvimentos adicionais, ele é preparado para uso mais amplo dentro da descoberta de produtos naturais.
Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado (Figura 1) para um sistema S. venezuelae TX-TL de alto rendimento, que foi atualizado do protocolo original publicado anteriormente26. Neste trabalho, a solução energética e as condições de reação foram otimizadas para aumentar o rendimento da proteína até 260 μg/mL para a proteína repórter mScarlet-I em uma reação em lote de 4h, 10 μL, utilizando um plasmídeo padrão, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Este plasmídeo foi especificamente projetado para permitir vários métodos de detecção de expressão proteica. O protocolo também é simplificado, enquanto o sistema de energia foi otimizado para reduzir a complexidade e o custo de configurar reações livres de células sem comprometer o rendimento. Juntamente com o sistema TX-TL otimizado, uma biblioteca de partes genéticas foi desenvolvida para a expressão genética de ajuste fino e como ferramentas fluorescentes para monitorar tx-tl em tempo real, criando assim uma plataforma versátil para prototipagem de expressão genética e caminhos biossintéticos de produtos naturais de Estreptomyces spp. e Actinobacteria relacionada.
Neste trabalho, o plasmídeo padrão recomendado (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) pode ser usado para estabelecer o fluxo de trabalho S. venezuelae TX-TL em um novo laboratório e está disponível no AddGene (ver Tabela Suplementar S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I oferece ao usuário a flexibilidade para estudar outros quadros de leitura aberta (ORFs). O ORF mScarlet-I é otimizado para a expressão genética S. venezuelae. O promotor SP44 é um forte promotor constitutivo que é altamente ativo tanto em E. coli quanto em Streptomyces spp.39. O plasmídeo tem dois locais de enzima de restrição única (NdeI, BamHI) para permitir a subs clonagem de novos ORFs no quadro com um sistema de etiqueta de aglutinante arsádico de coresceína (FlAsH) do terminal C. Alternativamente, ambas as tags podem ser removidas com a inclusão de um códon stop após a subs clonagem de um novo gene. Com este vetor base, a expressão de alto rendimento de uma gama de proteínas tem sido demonstrada, ou seja, proteínas da via de biossíntese de oxitetracíclina e um síntese de peptídeo não cansarático não característico (NRPS) de Estreptomíces rimosus (Figura 2). Em termos de detecção de mRNA, o plasmídeo padrão pTU1-A-SP44-mScarlet-I contém um aptamer dBroccoli (na região 3'-não traduzida) para detecção com a sonda 3,5-difluoro-4-hydroxibenzylidene imidazolinone (DFHBI). Para maior flexibilidade, um porta-ferramentas de peças MoClo compatíveis com EcoFlex40 também foi disponibilizado no AddGene, incluindo um vetor de visão de visor de estreptomíceos compatível com EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) e uma gama de plasmídeos de variante pTU1-A-SP44 expressando proteína de fluorescência verde superpatosa (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I e β-glucurdasonie (GUS). Em particular, o plasmídeo pSF1C-A é derivado do pAV-gapdh28 e é curado de locais BsaI/BsmBI para montagem moClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP é equivalente ao pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP do EcoFlex40, mas contém funcionalidade adicional para conjugação e integração cromossômica em Estreptomíces spp. usando o sistema de integração phiC3128.
A primeira etapa do protocolo envolve o crescimento do S. venezuelae ATCC 10712 ou uma cepa intimamente relacionada, colheita celular em fase de médio exponencial, etapas de lavagem celular e equilíbrio em buffers S30A e S30B. Esta etapa requer três dias, e o tempo para o crescimento celular pode ser usado para preparar os componentes restantes conforme descrito abaixo. As células colhidas são então líficas por sônica, esclarecidas e submetidas a uma reação de escoado. Nesta fase final de preparação, os extratos celulares podem ser preparados para armazenamento a longo prazo a -80 °C para minimizar a perda de atividade. Para a montagem de reações TX-TL usando este protocolo, é apresentado um Streptomyces Master Mix (SMM), com a opção de um formato de Solução de Energia Mínima (MES) que dá rendimentos comparáveis. Além disso, recomenda-se a estria de uma nova cultura de S. venezuelae ATCC 10712 a partir de um estoque de glicerol de -80 °C em uma placa de ágar gym e incubar a 28 °C por pelo menos 48-72 h até que colônias únicas sejam visíveis. Apenas culturas frescas devem ser usadas para as seguintes etapas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 L UltraYield Flask</td>
			<td>Thomson</td>
			<td>931136-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA (&#62;93%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black/Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10692202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>44722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, &#62;99%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>G32040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI (&#8805;98% - HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>MB1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-363644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Free Acid (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>B2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>494356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70167-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>807491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl sulfate) potassium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS amino acid sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (99%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>94554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>505471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Melford</td>
			<td>Y1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platereader</td>
			<td>BMG</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications

Estreptomias spp. são uma das principais fontes de antibióticos clínicos e produtos químicos industriais. Estreptomyces venezuelae ATCC 10712 é uma cepa de rápido crescimento e um produtor natural de clororamfenicol, jadomicina e espikromicina, o que o torna um candidato atraente como um chassi de biologia sintética de última geração. Portanto, ferramentas genéticas que aceleram o desenvolvimento da S. venezuelae ATCC 10712, bem como outros modelos de Estreptomia spp. são altamente desejáveis para a engenharia e descoberta de produtos naturais. Para isso, um sistema dedicado de isento de células S. venezuelae ATCC 10712 é fornecido neste protocolo para permitir a expressão heteróloga de alto rendimento de genes G+C (%) elevados. Este protocolo é adequado para reações em lote de pequena escala (10-100 μL) em formato de placa de 96 ou 384 poços, enquanto as reações são potencialmente escaláveis. O sistema livre de células é robusto e pode alcançar altos rendimentos (~5-10 μ M) para uma gama de proteínas recombinantes em uma configuração mínima. Este trabalho também incorpora um amplo instrumento de plasmídeo para medição em tempo real de mRNA e síntese proteica, bem como a coloração de fluorescência em gel de proteínas marcadas. Este protocolo também pode ser integrado com fluxos de trabalho de caracterização de expressão genética de alto throughput ou o estudo de vias enzimóricas de genes G+C (%) altos presentes nos genomas de Actinomycetes.

Este protocolo detalhado é fornecido como um exemplo para ajudar o usuário a estabelecer um sistema TX-TL de Estreptomíces baseado na cepa do modelo S. venezuelae ATCC 10712 (Figura 1). O usuário pode procurar estudar outras cepas de Estreptomia; no entanto, os estágios de crescimento/colheita de outras cepas com tempos de duplicação mais longos ou preferências distintas de crescimento precisarão ser otimizados sob medida para alcançar resultados de pico....

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A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Este protocolo detalha um método aprimorado para sintetizar altos rendimentos de proteínas recombinantes a partir de um sistema de tradução de transcrição livre de células (TX-TL) livre de células .

Um kit de ferramentas de transcrição de transcrição de estreptomíceos de alto rendimento para biologia sintética e aplicações de produtos naturais

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Nosso protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para estreptomíceos venezuelanos de transcrição livre de células. Nosso sistema aproveita as enzimas metabólicas e caminhos deste organismo não-modelo. As principais vantagens são a expressão heteróloga de genes com alto teor de GC, a provisão de um ambiente favorável de encaminhamento de proteínas e um sistema aberto para ajuste fino de vias biossintéticas.Nosso método abrirá novas oportunidades para estudar Estreptomia e bactérias GC relacionadas. Permite estudar enzimas e expressão genética nessas bactérias. Esta técnica foi desenvolvida para facilitar a implementação por novos usuários.O único passo que requer experiência prévia ou familiarização é a sônicação para produzir extratos brutos altamente ativos. Para começar a colher as células pré-cultivadas no terceiro dia, dilui a cultura da noite para o dia na proporção de um a 10 com um meio gineticamente fresco para a densidade óptica ou medição de OD em 600 nanômetros. Se o OD da cultura em 600 nanômetros for inferior a 0,3, aumente a velocidade de agitação para 250 a 300 rotações por minuto e cresça até que um OD atinja 0,3.Cresça por mais de duas horas adicionais. Se o OD for maior que 0,3, transfira as culturas para recipientes de centrifugação e esfrie rapidamente no gelo molhado por 30 minutos. Enquanto espera que a cultura celular esfrie, prepare quatro mililitros de dithiothreitol de molar fresco, S30A e S30B e mantenha-os no gelo.Depois de pesar um tubo vazio de centrífuga de 50 mililitros, pré-esfrie a menos 20 graus Celsius. Adicione dois mililitros de um dithiothreitol molar a um litro de tampão S30A no gelo e misture bem. Centrifugar as células a 6.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.Depois de descartar o supernacido em um movimento rápido, adicione 250 mililitros de tampão S30A e resuspenque as células sacudindo as garrafas de centrifugação vigorosamente até que as células sejam dispersas homogêneamente. Em seguida, centrifugar as células novamente por seis minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasciente e repita a adição do tampão S30A, seguido de centrifugação como demonstrado.Em seguida, adicione dois mililitros de um DTT molar a um litro de tampão S30B no gelo e misture bem. Adicione 250 mililitros de tampão S30B às células e repita a centrifugação. Resuspengue a pelota celular em 10 mililitros de tampão S30B e transfira a suspensão celular para o tubo de centrífuga pré-refrigerado pré-refrigerado de 50 mililitros.Se necessário, transfira as células residuais com um adicional de cinco a 10 mililitros de tampão S30B e encha o tubo para 50 mililitros de volume com S30B. Centrifugar as células por 10 minutos. Descarte o supernatante e repita a centrifugação em configurações anteriores, como demonstrado.Depois de descartar o supernascer, aspire o supernatante S30B restante com uma pipeta de 100 a 200 microliter e pese a pelota celular molhada. Para cada grama de células molhadas, adicione 0,9 mililitros de tampão S30B. Resuspend as células usando uma pipeta Pasteur ou vórtice.Centrifugar brevemente por cerca de 10 segundos até 500 G para sedimentar as células. Abaixe a ponta do sonicador na suspensão celular até que a ponta esteja cerca de um centímetro abaixo da superfície líquida. Insira diferentes parâmetros nas configurações do sonicator.Defina a frequência para 20 kilohertz, amplitude para 65% de pulso ligado e desligado para 10 segundos, e tempo total de sônicação para um minuto. Inicie a sonicação e mova o tubo para cima ou para baixo e para os lados durante os dois primeiros ciclos de descanso para garantir que as células sejam uniformemente sônicas. Se as células não estiverem totalmentelisedas, inverta o tubo duas a três vezes e repita a sônica para um ou dois ciclos adicionais de 10 segundos com mistura frequente até que as células sejam totalmente interrompidas.Centrifugar as células lisadas para remover os detritos celulares, em seguida, transferir o supernatante para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro como uma alíquota mililitro. Para a reação de escoamento dos extratos celulares, incubar a célula que contém o extrato celular a 30 graus Celsius por 60 minutos em um bloco de calor ou na incubadora sem um agitador. Para a reação de tradução de transcrição, descongele a solução SMM ou MES do extrato celular e o DNA plasmídeo no gelo.Pré-arrefecar uma placa de 384-bem a menos 20 graus Celsius. Configure a reação de tradução de transcrição no gelo onde 25% do volume é DNA plasmídeo, 33,33% é extrato celular e 41,67% é solução SMM. Bata suavemente a mistura por cerca de cinco segundos em uma configuração de baixa velocidade para garantir que a solução seja homogênea, evitando espuma ou formação de bolhas.Transfira três alíquotas de 10 microliters em três poços de uma placa de 384 poços como um triplicado técnico sem introduzir bolhas de ar. Depois de selar a placa com uma tampa transparente, gire a placa a 400 vezes G por cinco segundos e incubar a reação a 28 graus Celsius, seja em uma incubadora ou em um leitor de placas sem tremer. A transcrição-tradução livre de células de Estreptomíces venezuelae foi otimizada para expressão de alto rendimento de proteínas fluorescentes do plasmídeo padrão pTU1-A-SP44, bem como enzimas biossintéticas detectadas por eletroforese de gel.A expressão do plasmídeo padrão pTU1-A-SP44-mScarlet-I foi medida utilizando vários métodos. As medidas de fluorescência em tempo real do mRNA usando o aptamer dBroccoli RNA, proteína mScarlet-I imatura usando o sistema de etiquetas FlAsH e proteína mScarlet-I madura foram realizadas. A coloração de fluorescência em gel de mScarlet-I usando tag FLAsH foi conduzida além da coloração Azul Coomassie da proteína total livre de células.Após esse procedimento, ensaios de atividade podem ser realizados para estudar enzimas e caminhos que são desafiadores usando métodos padrão. Também se estende para a biossíntese ampliada e expressão genética de alto rendimento. Estamos desenvolvendo essa técnica para estudar enzimas metabólicas de bactérias GC altas.Mostramos o potencial do nosso sistema para estudar a biossíntese ampliada em reações livres de células.

Research

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Bioengineering

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