Name: a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00
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Los autores desean reconocer el siguiente apoyo a la investigación: EPSRC [EP/K038648/1] para SJM como PDRA con PSF; Wellcome Trust patrocinó la beca ISSF para SJM con PSF en el Imperial College de Londres; Beca de investigación de la Royal Society [RGS\R1\191186]; Premio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] para SJM en la Universidad de Kent; y la beca de doctorado del Fondo de Investigación de Desafíos Globales (GCRF) para KC en la Universidad de Kent.

NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Tabla 2 para obtener recetas para el plato medio y agar GYM y los tampones de lavado S30A y S30B.
1. Preparación de soluciones y orientación general
<ol><li>Mantenga todas las soluciones, células (post-crecimiento) y extractos de células en hielo después de la preparación, a menos que se indique una excepción.</li>
	<li>Almacene existencias para 1 M mg-glutamato, 4 M K-glutamato, 40% (p/v) PEG 6000, 1 g/ml de ácido poli...

En este manuscrito, se ha descrito un protocolo S. venezuelae TX-TL de alto rendimiento con pasos detallados que son fáciles de llevar a cabo tanto para usuarios experimentados como nuevos de sistemas TX-TL. Se han eliminado varias características de los protocolos streptomyces45 y E. coli TX-TL41 existentes para establecer un protocolo mínimo, pero de alto rendimiento para S. venezuelae TX-TL5,26.<su...

Los sistemas de transcripción-traducción sin células (TX-TL) proporcionan una plataforma de creación de prototipos ideal para la biología sintética para implementar ciclos rápidos de diseño-construcción-prueba-aprendizaje, el marco de ingeniería conceptual para la biología sintética1. Además, existe un creciente interés en los sistemas TX-TL para la producción de proteínas recombinantes de alto valor en un entorno de reacción abierta2, por ejemplo, para incorporar aminoácidos no estándar en conjugados anticuerpo-fármaco3. Específicamente, TX-TL requiere un extracto celular, plásmido o ADN lineal, y una solución energética para catalizar la síntesis de proteínas en reacciones por lotes o semicontinuas. Si bien Escherichia coli TX-TL es el sistema libre de células dominante, una serie de sistemas TX-TL no modelo emergentes han atraído la atención para diferentes aplicaciones4,5,6,7,8. Las ventajas clave de TX-TL incluyen escalabilidad flexible (escala de nanolitro a litro)9,10, una fuerte reproducibilidad y flujos de trabajo automatizados8,11,12. En particular, la automatización de TX-TL permite la caracterización acelerada de partes genéticas y elementos reguladores8,12,13.
En términos de configuración de reacción, TX-TL requiere fuentes de energía primarias y secundarias, así como aminoácidos, cofactores, aditivos y una secuencia de ADN plantilla. Los trifosfatos de nucleótidos (NTP) proporcionan la fuente de energía primaria para impulsar el ARNm inicial (ATP, GTP, CTP y UTP) y la síntesis de proteínas (solo ATP y GTP). Para aumentar los rendimientos de TX-TL, los NTP se regeneran a través del catabolismo de una fuente de energía secundaria, como maltosa14, maltodextrina15, glucosa14, 3-fosfoglicerato (3-PGA)16, fosfoenolpiruvato17 y L-glutamato18. Esta actividad metabólica inherente es sorprendentemente versátil, pero poco estudiada, especialmente en sistemas TX-TL emergentes. Cada fuente de energía tiene propiedades y ventajas distintas en términos de rendimiento de ATP, estabilidad química y costo, lo cual es una consideración importante para las reacciones TX-TL a escala. Hasta el momento, los protocolos actuales para E. coli TX-TL han alcanzado hasta 4,0 mg/mL (~157 μM) para el modelo de proteína verde fluorescente (GFP), utilizando una mezcla de 3-PGA (30 mM), maltodextrina (60 mM) y D-ribosa (30 mM) como fuente de energía secundaria19.
Recientemente, ha habido un creciente interés en el estudio de las vías biosintéticas de metabolitos secundarios en sistemas TX-TL20,21,22. Específicamente, las Actinobacterias son una fuente importante de metabolitos secundarios, incluyendo antibióticos y productos químicos agrícolas23,24. Sus genomas están enriquecidos con los llamados grupos de genes biosintéticos (BGC), que codifican vías enzimáticas para la biosíntesis de metabolitos secundarios. Para el estudio de las partes genéticas de Actinobacterias y las vías biosintéticas, recientemente se ha desarrollado una gama de sistemas TX-TL basados en Streptomyces5,6,25,26. Estos sistemas especializados Streptomyces TX-TL son potencialmente beneficiosos por las siguientes razones: [1] provisión de un entorno de plegamiento de proteínas nativas para enzimas de Streptomyces spp.26; [2] acceso a un grupo óptimo de ARNt para la alta expresión génica de G+C (%) [3] metabolismo primario activo, que potencialmente puede ser secuestrado para el suministro de precursores biosintéticos; y [4] suministro de enzimas, precursores o cofactores del metabolismo secundario presentes en el extracto de células nativas. Por lo tanto, recientemente se ha establecido un kit de herramientas S.venezuelae TX-TL de alto rendimiento para aprovechar estas capacidades únicas5.
Streptomyces venezuelae es un huésped emergente para la biología sintética con una rica historia en biotecnología industrial5,27,28,29 y como sistema modelo para el estudio de la división celular y la regulación genética en Actinobacteria30,31,32. La cepa tipo principal, S. venezuelae ATCC 10712, tiene un genoma relativamente grande de 8,22 Mb con un contenido de G+C del 72,5% (%) (número de acceso: CP029197), que codifica 7377 secuencias codificantes, 21 ARNr, 67 ARNt y 30 grupos de genes biosintéticos27. En biología sintética, S. venezuelae ATCC 10712 es un chasis atractivo para la expresión heteróloga de vías biosintéticas. A diferencia de la mayoría de las otras tinciones de Streptomyces, proporciona varias ventajas clave, incluyendo un rápido tiempo de duplicación (~40 min), una amplia gama de herramientas genéticas y experimentales5,28, falta de aglomeración micelial y esporulación en medios líquidos28,33. Varios estudios también han demostrado el uso de S. venezuelae para la producción heteróloga de una amplia gama de metabolitos secundarios, incluyendo policétidos, péptidos ribosómicos y no ribibosomales34,35,36,37,38. Estas características combinadas hacen de esta cepa un huésped microbiano atractivo para aplicaciones de biología sintética e ingeniería metabólica. Si bien S. venezuelae no es el modelo dominante de Streptomyces para la expresión génica heteróloga, con nuevos desarrollos, está preparado para un uso más amplio dentro del descubrimiento de productos naturales.
Este manuscrito presenta un protocolo detallado (Figura 1) para un sistema S. venezuelae TX-TL de alto rendimiento, que ha sido actualizado a partir del protocolo original publicado anteriormente26. En este trabajo, la solución energética y las condiciones de reacción se han optimizado para aumentar el rendimiento proteico hasta 260 μg/mL para la proteína reportera mScarlet-I en una reacción por lotes de 4 h, 10 μL, utilizando un plásmido estándar, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Este plásmido ha sido diseñado específicamente para permitir varios métodos de detección de la expresión de proteínas. El protocolo también se simplifica, mientras que el sistema de energía se ha optimizado para reducir la complejidad y el costo de configurar reacciones sin células sin comprometer el rendimiento. Junto con el sistema TX-TL optimizado, se ha desarrollado una biblioteca de partes genéticas para ajustar la expresión génica y como herramientas fluorescentes para monitorear TX-TL en tiempo real, creando así una plataforma versátil para la creación de prototipos de expresión génica y vías biosintéticas de productos naturales de Streptomyces spp. y Actinobacterias relacionadas.
En este trabajo, el plásmido estándar recomendado (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) se puede utilizar para establecer el flujo de trabajo de S. venezuelae TX-TL en un nuevo laboratorio y está disponible en AddGene (ver Tabla suplementaria S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I proporciona al usuario la flexibilidad de estudiar otros marcos de lectura abierta (ORF). El ORF mScarlet-I está optimizado para la expresión génica de S. venezuelae. El promotor SP44 es un fuerte promotor constitutivo que es altamente activo tanto en E. coli como en Streptomyces spp.39. El plásmido tiene dos sitios únicos de enzimas de restricción (NdeI, BamHI) para permitir la subclonación de nuevos ORF en el marco con un sistema conjunto de etiqueta FLAG-terminal C y horquilla arsenical de fluoresceína (FlAsH). Alternativamente, ambas etiquetas se pueden eliminar con la inclusión de un codón de parada después de la subclonación de un nuevo gen. Con este vector base, se ha demostrado la expresión de alto rendimiento de una gama de proteínas, a saber, proteínas de la vía de biosíntesis de oxitetraciclina y una péptido sintetasa no ribossomal no caracterizada (NRPS) de Streptomyces rimosus (Figura 2). En términos de detección de ARNm, el plásmido estándar pTU1-A-SP44-mScarlet-I contiene un aptámero dBroccoli (en la región 3'-no traducida) para la detección con la sonda 3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolinona (DFHBI). Para una mayor flexibilidad, también se ha puesto a disposición en AddGene un conjunto de herramientas de piezas MoClo compatibles con EcoFlex40, incluido un vector lanzadera Streptomyces compatible con EcoFlex (pSF1C-A-RFP /pSF2C-A-RFP) y una gama de plásmidos variantes de pTU1-A-SP44 que expresan proteína de fluorescencia verde supercarpeta (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I y β-glucuronidasa (GUS). En particular, el plásmido pSF1C-A se deriva de pAV-gapdh28 y se cura de los sitios BsaI / BsmBI para el ensamblaje de MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP es equivalente a pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP de EcoFlex40, pero contiene funcionalidad adicional para la conjugación y la integración cromosómica en Streptomyces spp. utilizando el sistema de integrasa phiC3128.
La primera etapa del protocolo implica el crecimiento de la S. venezuelae ATCC 10712 o una cepa estrechamente relacionada, la cosecha celular en la fase exponencial media, los pasos de lavado celular y el equilibrio en los tampones S30A y S30B. Esta etapa requiere tres días, y el tiempo para el crecimiento celular se puede utilizar para preparar los componentes restantes como se describe a continuación. Las células cosechadas se lisan por sonicación, se clarifican y se someten a una reacción de escorrentía. En esta etapa final de preparación, los extractos celulares se pueden preparar para el almacenamiento a largo plazo a -80 ° C para minimizar la pérdida de actividad. Para el ensamblaje de reacciones TX-TL utilizando este protocolo, se presenta un Streptomyces Master Mix (SMM), con la opción de un formato de Solución de Energía Mínima (MES) que da rendimientos comparables. Además, se recomienda rayar un cultivo fresco de S. venezuelae ATCC 10712 a partir de un caldo de glicerol de -80 °C en un plato de agar GYM e incubar a 28 °C durante al menos 48-72 h hasta que se vean colonias individuales. Solo se deben usar cultivos frescos para los siguientes pasos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 L UltraYield Flask</td>
			<td>Thomson</td>
			<td>931136-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA (&#62;93%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black/Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10692202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>44722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, &#62;99%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>G32040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI (&#8805;98% - HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>MB1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-363644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Free Acid (contact supplier for purity)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>B2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (&#62;98%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (98%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>494356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70167-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>807491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl sulfate) potassium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS amino acid sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (99%)</td>
			<td>Fluorochem</td>
			<td>94554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>505471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Melford</td>
			<td>Y1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platereader</td>
			<td>BMG</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications

Streptomyces spp. son una fuente importante de antibióticos clínicos y productos químicos industriales. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 es una cepa de rápido crecimiento y un productor natural de cloranfenicol, jadomicina y pikromicina, lo que la convierte en un candidato atractivo como chasis de biología sintética de próxima generación. Por lo tanto, las herramientas genéticas que aceleran el desarrollo de S. venezuelae ATCC 10712, así como otros modelos de Streptomyces spp., son altamente deseables para la ingeniería y el descubrimiento de productos naturales. Con este fin, se proporciona un sistema dedicado S . venezuelae ATCC 10712 libre de células en este protocolo para permitir la expresión heteróloga de alto rendimiento de genes de alto G + C (%). Este protocolo es adecuado para reacciones por lotes a pequeña escala (10-100 μL) en formato de placa de 96 o 384 pocillos, mientras que las reacciones son potencialmente escalables. El sistema libre de células es robusto y puede lograr altos rendimientos (~ 5-10 μ M) para una gama de proteínas recombinantes en una configuración mínima. Este trabajo también incorpora un amplio conjunto de herramientas de plásmidos para la medición en tiempo real de la síntesis de ARNm y proteínas, así como la tinción de fluorescencia en gel de proteínas marcadas. Este protocolo también se puede integrar con flujos de trabajo de caracterización de expresión génica de alto rendimiento o el estudio de vías enzimáticas de genes de alto G + C (%) presentes en genomas de Actinomycetes.

Este protocolo detallado se proporciona como ejemplo para ayudar al usuario a establecer un sistema Streptomyces TX-TL basado en la cepa modelo S. venezuelae ATCC 10712 (Figura 1). El usuario puede tratar de estudiar otras cepas de Streptomyces; sin embargo, las etapas de crecimiento / cosecha de otras cepas con tiempos de duplicación más largos o preferencias de crecimiento distintas deberán optimizarse a medida para lograr resultados máximos. Para el resultad...

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A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Este protocolo detalla un método mejorado para sintetizar altos rendimientos de proteínas recombinantes a partir de un sistema de transcripción-traducción libre de células (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .

Un kit de herramientas de transcripción y traducción de Streptomyces de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Nuestro protocolo proporciona un flujo de trabajo simplificado para Streptomyces venezuelae transcripción-traducción libre de células. Nuestro sistema aprovecha las enzimas metabólicas y las vías de este organismo no modelo. Las principales ventajas son la expresión heteróloga de genes con alto contenido de GC, la provisión de un entorno favorable de reenvío de proteínas y un sistema abierto para el ajuste fino de las vías biosintéticas.Nuestro método abrirá nuevas oportunidades para estudiar Streptomyces y las bacterias relacionadas con el alto GC. Permite estudiar las enzimas y la expresión génica en estas bacterias. Esta técnica ha sido desarrollada para facilitar su implementación por parte de los nuevos usuarios.El único paso que requiere experiencia previa o familiarización es la sonicación para producir extractos crudos altamente activos. Para comenzar a cosechar las células precultivadas al tercer día, diluya el cultivo durante la noche en la proporción de uno a 10 con un medio GINEC nuevo para la densidad óptica o la medición de OD a 600 nanómetros. Si el OD del cultivo a 600 nanómetros es inferior a 0,3, aumente la velocidad de agitación a 250 a 300 rotaciones por minuto y crezca hasta que un OD alcance 0,3.Crecer por no más de dos horas adicionales. Si la OD es mayor que 0,3, transfiera los cultivos a recipientes de centrifugación y enfríe rápidamente sobre hielo húmedo durante 30 minutos. Mientras espera que el cultivo celular se enfríe, prepare cuatro mililitros de ditiotrereitol molar fresco, tampones S30A y S30B y manténgalos en hielo.Después de pesar un tubo de centrífuga vacío de 50 mililitros, enfríelo previamente a menos 20 grados centígrados. Agregue dos mililitros de un ditiotreitol molar a un litro de tampón S30A en hielo y mezcle bien. Centrifugar las células a 6.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Después de desechar el sobrenadante en un movimiento rápido, agregue 250 mililitros de tampón S30A y vuelva a suspender las células agitando las botellas de centrifugación vigorosamente hasta que los grupos celulares se dispersen homogéneamente. Luego centrifugue las células nuevamente durante seis minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y repita la adición del tampón S30A, seguido de la centrifugación como se ha demostrado.A continuación, agregue dos mililitros de TDT molar a un litro de tampón S30B en hielo y mezcle bien. Agregue 250 mililitros de tampón S30B a las celdas y repita la centrifugación. Resuspender el pellet de celda en 10 mililitros de tampón S30B y transferir la suspensión de la celda al tubo de centrífuga de 50 mililitros pre-pesado pre-enfriado.Si es necesario, transfiera las celdas residuales con un volumen adicional de cinco a 10 mililitros de tampón S30B y llene el tubo a un volumen de 50 mililitros con S30B. Centrifugar las células durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y repita la centrifugación en los ajustes anteriores como se ha demostrado.Después de desechar el sobrenadante, aspire el sobrenadante S30B restante con una pipeta de 100 a 200 microlitros y pese el pellet de celda húmeda. Por cada gramo de células húmedas, agregue 0.9 mililitros de tampón S30B. Resuspend las células usando una pipeta Pasteur o un vórtice.Centrifugar brevemente durante unos 10 segundos hasta 500 G para sedimentar las células. Baje la punta del sonicador en la suspensión celular hasta que la punta esté aproximadamente un centímetro por debajo de la superficie líquida. Introduzca diferentes parámetros en la configuración del sonicador.Ajuste la frecuencia a 20 kilohercios, la amplitud al 65% del tiempo de encendido y apagado del pulso a 10 segundos y el tiempo total de sonicación a un minuto. Comience la sonicación y mueva el tubo hacia arriba o hacia abajo y hacia los lados durante los dos primeros ciclos de reposo para asegurarse de que las células estén sonicadas uniformemente. Si las células no están completamente lisadas, invierta el tubo dos o tres veces y repita la sonicación durante uno o dos ciclos adicionales de 10 segundos con una mezcla frecuente hasta que las células se interrumpan por completo.Centrifugue las células lisadas para eliminar los restos celulares, luego transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros como una alícuota de mililitros. Para la reacción de escorrentía de los extractos celulares, incube la célula que contiene el extracto celular a 30 grados Celsius durante 60 minutos en un bloque de calor o en la incubadora sin un agitador. Para la reacción de transcripción-traducción, descongele el extracto celular SMM o la solución MES y el ADN plásmido en hielo.Pre-enfriar una placa de 384 pocillos a menos 20 grados centígrados. Configure la reacción de transcripción-traducción en el hielo donde el 25% del volumen es ADN plásmido, el 33,33% es extracto celular y el 41,67% es solución SMM. Vórtice suavemente la mezcla durante unos cinco segundos a una velocidad de ajuste a baja velocidad para asegurarse de que la solución sea homogénea y evite la formación de espuma o burbujas.Transfiera tres alícuotas de 10 microlitros a tres pozos de una placa de 384 pocillos como triplicado técnico sin introducir burbujas de aire. Después de sellar la placa con una cubierta transparente, gire la placa a 400 veces G durante cinco segundos e incube la reacción a 28 grados centígrados, ya sea en una incubadora o en un lector de placas sin agitar. Streptomyces venezuelae transcripción-traducción libre de células se optimizó para la expresión de alto rendimiento de proteínas fluorescentes del plásmido estándar pTU1-A-SP44, así como enzimas biosintéticas detectadas por electroforesis en gel.La expresión del plásmido estándar pTU1-A-SP44-mScarlet-I se midió utilizando varios métodos. Se llevaron a cabo las mediciones de fluorescencia en tiempo real del ARNm utilizando el aptámero de ARN dBroccoli, la proteína mScarlet-I inmadura utilizando el sistema de etiquetas FlAsH y la proteína mScarlet-I madura. La tinción de fluorescencia en gel de mScarlet-I utilizando la etiqueta FlAsH se realizó además de la tinción de Coomassie Blue de la proteína libre celular total.Después de este procedimiento, se pueden realizar ensayos de actividad para estudiar enzimas y vías que son desafiantes utilizando métodos estándar. También se extiende hacia la biosíntesis ampliada y la expresión génica de alto rendimiento. Estamos desarrollando esta técnica para estudiar las enzimas metabólicas de las bacterias de alto GC.Hemos demostrado el potencial de nuestro sistema para estudiar la biosíntesis ampliada en reacciones libres de células.

Research

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