Name: a reporter based cellular assay for monitoring splicing efficiency
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Mittel an S.S. von den National Institutes of Health (R21CA170786 und R01GM127464) und der American Cancer Society (institutional research grant 74-001-34-IRG) sowie an S.S. und W.M. aus dem Valley Research Partnership Program (P1-4009 und VRP77) unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.

1. Reagenzien und Puffer
HINWEIS: Alle Sterilisationen mit Vakuumfiltern sollten mit einer 0,2 μm Polyethersulfon (PES)-Membran in einer Biosicherheitseinrichtung durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie RNase-freies Wasser vor, indem Sie 1,0 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC) zu 1,0 l deionisiertem Wasser hinzufügen, mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) mischen, zweimal autoklavieren und dann vor Gebrauch zu RT abkühlen.</li>
	<li>Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) v...

<ol>
	<li>Zhuang, Y., Weiner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compensatory+base+change+in+U1+snRNA+suppresses+a+5'+splice+site+mutation.">A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation.</a> Cell. 46 (6), 827-835 (1986).</li><li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mis-splicing+in+disease.">RNA mis-splicing in disease.</a> Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).</li><li>Ward, A. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathobiology+of+splicing.">The pathobiology of splicing.</a> Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).</li><li>Scalet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-causing+variants+of+the+conserved++2T+of+5'+splice+sites+can+be+rescued+by+engineered+U1snRNAs.">Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs.</a> Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).</li><li>Yamazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+modified+U1+small+nuclear+RNA+for+rescue+from+exon+7+skipping+caused+by+5'-splice+site+mutation+of+human+cathepsin+A+gene.">Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene.</a> Gene. 677, 41-48 (2018).</li><li>Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+nuclear+RNA-mediated+modulation+of+splicing+reveals+a+therapeutic+strategy+for+a+TREM2+mutation+and+its+post-transcriptional+regulation.">Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation.</a> Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).</li><li>Balestra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+mutations+impairing+CDKL5+expression+and+activity+can+be+efficiently+rescued+by+U1snRNA-based+therapy.">Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).</li><li>Donadon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-specific+U1+snRNAs+improve+ELP1+exon+20+definition+and+rescue+ELP1+protein+expression+in+a+familial+dysautonomia+mouse+model.">Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).</li><li>Summer, H., Gramer, R., Droge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(Urea+PAGE).">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).</li><li>Dominski, Z., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+splice+sites+in+pre-mRNAs+with+short+internal+exons.">Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons.</a> Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).</li><li>Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+repression+by+polypyrimidine+tract+binding+protein.">Exon repression by polypyrimidine tract binding protein.</a> RNA. 11 (5), 699-716 (2005).</li><li>Le Guedard-Mereuze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+contexts+that+determine+the+pathogenicity+of+base+substitutions+at+position++3+of+donor+splice-sites.">Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites.</a> Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).</li><li>Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-loop+4+of+U1+snRNA+is+essential+for+splicing+and+interacts+with+the+U2+snRNP-specific+SF3A1+protein+during+spliceosome+assembly.">Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly.</a> Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).</li><li>Steitz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).</li><li>Fortes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+expression+of+specific+genes+in+mammalian+cells+with+5'+end-mutated+U1+small+nuclear+RNAs+targeted+to+terminal+exons+of+pre-mRNA.">Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).</li><li>Roca, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+recognition+of+5'+splice+sites+by+noncanonical+base-pairing+to+U1+snRNA+involving+bulged+nucleotides.">Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides.</a> Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).</li><li>Roca, X., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+atypical+5'+splice+sites+by+shifted+base-pairing+to+U1+snRNA.">Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA.</a> Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).</li><li>Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splice-switching+small+molecules:+A+new+therapeutic+approach+to+modulate+gene+expression.">Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression.</a> Methods. 167, 134-142 (2019).</li><li>Hamid, F. M., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+position-specific+regulation+of+alternative+splicing.">A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).</li><li>Martelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+roles+for+human+U1+snRNA+stem-loops+in+pre-mRNA+splicing.">Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-18 (2021).</li></ol>

Der Assay kann für die Spleißanalyse in anderen Zelllinien als HeLa angepasst werden, jedoch müssen Faktoren, die die Transfektionseffizienz beeinflussen, wie Zellkonfluenz und DNA-Menge, möglicherweise optimiert werden. Das Konstruktverhältnis von Reporter zu U1 ist ein weiterer kritischer Parameter, der möglicherweise in Abhängigkeit von den in anderen Zelltypen beobachteten Expressionsniveaus bestimmt werden muss. Die Qualität der extrahierten RNA ist entscheidend für die Spleißanalyse; Daher wird die Verwen...

Pre-mRNA-Spleißen ist ein wesentlicher Verarbeitungsschritt, der nicht-kodierende Introns entfernt und exakt Ligaten kodiert, die Exons kodieren, um reife mRNA zu bilden. Die Erkennung von Konsenssequenzen an Exon-Intron-Übergängen, die als 5′-Spleißstelle und 3′-Spleißstelle bezeichnet werden, durch Komponenten der Spleißmaschinerie leitet den Spleißprozess ein. Das U1 Small Nuclear Ribonucleoprotein (snRNP) erkennt die 5′-Spleißstelle durch Basenpaarung der U1-snRNA zur prä-mRNA1. Genetisch vererbte Mutationen, die 5′-Spleißstellensequenzen verändern, sind mit vielen Krankheiten assoziiert2,3. Es wird vorhergesagt, dass der Verlust des Basepairings von U1-snRNA mit den mutierten 5'-Spleißstellen ein aberrantes Spleißen verursacht, das die Translation des betroffenen Transkripts beeinträchtigen kann. Ein potenzieller therapeutischer Ansatz zur Korrektur der Spleißdefekte beinhaltet die Unterdrückung von Mutationen durch modifizierte U1-snRNA, die kompensatorische Nukleotidänderungen in ihrer 5'-Region trägt, die mit der 5'-Spleißstelle übereinstimmt. Solche modifizierten U1-snRNAs, auch als exonspezifische U1-snRNAs bezeichnet, haben sich als wirksam bei der Umkehrung von Spleißdefekten erwiesen, was zu einer erhöhten Proteinexpression aus der geretteten mRNA4,5,6,7,8 führt.
Hier beschreiben wir den U1 snRNP-Komplementierungsassay, einen reporterbasierten zellulären Spleißassay, der die Beurteilung der Wirkung von 5′-ss-Mutationen auf das Spleißen eines Exons ermöglicht und auch für die Entwicklung modifizierter U1-snRNAs verwendet werden kann, um die Rettung des Exon-Einschlusses zu ermöglichen. Wir bieten auch Protokolle zur Überwachung der gespleißten Reportertranskripte durch Primer-Erweiterung und RT-PCR und zur Bestimmung der Expression von modifizierten U1-snRNAs durch Primer-Erweiterung und RT-qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-751628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2567-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Bottle Top Filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB12566510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x), no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection medium - Opti-MEM&#8482; I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent - Lipofectamine&#8482; 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#8482; Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2618-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG035C001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion beands - Sephadex&#174; G-25</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2580-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion mini columns</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3032S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>76410 100 UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inactivating reagents - RNaseZAP&#8482;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM ea)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28025013</td>
			<td>used for primer extension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamers (50 &#181;M)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8080127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time PCR mix - SYBR&#8482; Select Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4472903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td>used for cDNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X First-Strand Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (&#8805;99.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td>Review Material Safety Data Sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114405-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene Cyanol FF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP168-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Review Material Safety Data Sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP169-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxodisulphate (APS) &#8805;98%, Pro-Pure, Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M133-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED) &#8805;99%, Ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td>Review Material Safety Data Sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ASG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel Wrap&#8482; Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NGP-125NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel Wrap&#8482; Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NGP-200NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel Wrap&#8482; Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NGP-400NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon&#8482; FLA 7000 Biomolecular Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9610-73 AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reporter based cellular assay for monitoring splicing efficiency

Während der Genexpression beinhaltet der entscheidende Schritt des Pre-mRNA-Spleißens die genaue Erkennung von Spleißstellen und die effiziente Montage von spleißosomalen Komplexen, um Exons zu verbinden und Introns vor dem zytoplasmatischen Export der reifen mRNA zu entfernen. Die Spleißeffizienz kann durch das Vorhandensein von Mutationen an Spleißstellen, den Einfluss transaktiver Spleißfaktoren oder die Aktivität von Therapeutika verändert werden. Hier beschreiben wir das Protokoll für einen zellulären Assay, der zur Überwachung der Spleißeffizienz eines bestimmten Exons angewendet werden kann. Der Assay verwendet einen anpassungsfähigen Plasmid-kodierten 3-Exon/2-Intron-Minigen-Reporter, der in Säugetierzellen durch transiente Transfektion exprimiert werden kann. Nach der Transfektion wird die gesamte zelluläre RNA isoliert, und die Effizienz des Exon-Spleißens in der Reporter-mRNA wird entweder durch Primer-Extension oder semi-quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) bestimmt. Wir beschreiben, wie die Auswirkungen von krankheitsassoziierten 5'-Spleißstellenmutationen bestimmt werden können, indem sie in den Reporter eingeführt werden; und wie die Unterdrückung dieser Mutationen durch Co-Transfektion mit einem U1-Konstrukt für kleine kernare RNA (snRNA) erreicht werden kann, das kompensatorische Mutationen in seiner 5'-Region trägt, die mit den 5'-Spleißstellen an Exon-Intron-Verbindungen in prä-mRNAs übereinstimmt. Somit kann der Reporter für das Design therapeutischer U1-Partikel verwendet werden, um die Erkennung von mutierten 5'-Spleißstellen zu verbessern. Das Einfügen von cis-wirkenden regulatorischen Stellen, wie Spleißverstärker- oder Schalldämpfersequenzen, in den Reporter kann auch verwendet werden, um die Rolle von U1 snRNP in der Regulierung zu untersuchen, die durch einen bestimmten alternativen Spleißfaktor vermittelt wird. Schließlich können Reporter-exprimierende Zellen mit kleinen Molekülen inkubiert werden, um die Wirkung potenzieller Therapeutika auf konstitutives prä-mRNA-Spleißen oder auf Exons mit mutierten 5'-Spleißstellen zu bestimmen. Insgesamt kann der Reporter-Assay angewendet werden, um die Spleißeffizienz unter einer Vielzahl von Bedingungen zu überwachen, um grundlegende Spleißmechanismen und Spleiß-assoziierte Krankheiten zu untersuchen.

Der Spleißreporter Dup51, ein Drei-Exon-Zwei-Intron-Minigen, wurde aus dem menschlichen β-Globin-Gen abgeleitet und zuvor beschrieben (Abbildung 1A)11,12 . Wir schufen einen mutierten Reporter, Dup51p, durch die Einführung von Usher-Syndrom-assoziierten 5'-Spleißstellenmutationen, die im Exon 3 des Protocadherin 15 (PCDH15) Gens13 auftreten. Die 5'-Spleißstellensequenz an der Exon-2-Intron-2-Verb...

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A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

Dieses Protokoll beschreibt einen Minigene-Reporter-Assay zur Überwachung der Auswirkungen von 5'-Spleißstellenmutationen auf das Spleißen und entwickelt Suppressor U1 snRNA zur Rettung der mutationsinduzierten Spleißhemmung. Die Reporter- und Suppressor-U1-snRNA-Konstrukte werden in HeLa-Zellen exprimiert, und das Spleißen wird durch Primer-Extension oder RT-PCR analysiert.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Dieses Protokoll beschreibt einen zellulären Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz unter Verwendung eines anpassungsfähigen Management-Reporters. Dieser Reporter-Assay kann verwendet werden, um die Auswirkungen von krankheitsassoziierten Mutationen in den Exxon- oder Spleißstellen zu untersuchen und eine Therapie, insbesondere ein Partikel, zu entwickeln, um die Erkennung von mutierten bis fünf Punkt-Spleißstellen zu verbessern. Die Passage in Hela-Zellen saugt das verbrauchte Medium ab und inkubiert die Zellen mit drei Millilitern von 0,2 5% Auslösungen in einem Millimolaren EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten.Nach der Inkubation an sieben Milliliter frischem DMEM wird die Zellsuspension in ein 10-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Zellen. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter frischem DMEM und platten Sie die Zellen auf einer neuen Gewebekulturschale bei 20% Konfluenz für vorübergehende Transsfektionen.Zählen Sie die Hela-Zellen mit einem sauberen Hämozytometer-Objektträger und bereiten Sie eine Suspension mit einer Dichte von 2,5 mal 10 bis zur fünften Zelle pro Milliliter vor, säen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag saugen Sie das verbrauchte Medium ab und geben Sie 800 Mikroliter frisches DMEM mit Serum auf die Platte. Bereiten Sie die Transfektionsmischungen vor und wirbeln Sie sie für 15 Sekunden.Dann zentrifugieren Sie die Mischungen und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach der Inkubation alle 200 Mikroliter der Transfektionsmischung in eine Vertiefung der 12 Well Hela Zellplatte geben, um ein Endvolumen von einem Milliliter pro Vertiefung zu erreichen, und die Platte bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden inkubieren. Die vorbereiteten Markierungsreaktionen sind inkubierend.Resuspend die 25 Kilo Dalton Molekulargewicht Cutoff Size Ausschlussperlen durch sanftes Wirbeln für 10 Sekunden. Als nächstes werden 600 Mikroliter der resuspendierten Perlen in eine Einweg-Minisäule gegeben, in ein 1,5-Milliliter-Auffangrohr gelegt und der Perlenbestand auf vier Grad Celsius zurückgeführt. Zentrifugieren Sie die Säule und verwerfen Sie den Durchfluss durch sie hindurch.Dann waschen Sie die Perlen zweimal, indem Sie 300 Mikroliter RNA-freies Wasser in die Säule geben. Nach der zweiten Wäsche die Minisäule in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und die Kinase-Reaktionsmischung in die Säule geben. Zentrifugieren Sie die Säule und sammeln Sie den Durchfluss, der die P32-markierten Oligonukleotide enthält.Fügen Sie zwei Mikrogramm RNA, die aus den Helizellen extrahiert wurde, in 200 Mikroliter Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und fügen Sie RNA-freies Wasser hinzu, um das Volumen auf 6,55 Mikroliter zu erhöhen. Als nächstes fügen Sie 0,9 Mikroliter hinzu, einen Master-Mix zu jedem PCR-Röhrchen, das die RNA-Proben enthält, und inkubieren Sie die Röhrchen zuerst bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten und dann eine Minute auf Eis. Als nächstes bei 2,55 Mikrolitern, einem Master-Mix zwei, zu jedem Röhrchen, das die RNA enthält, und Master-Mix eins, und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten.Nach der Inkubation werden die Röhrchen in einen Thermocycler gegeben und zuerst bei 50 Grad Celsius für 60 Minuten und dann bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation werden jeder Probe 10 Mikroliter 2X Formamid-RNA-Beladungsfarbstoff hinzugefügt und die Fragmente nach UIA-Seite getrennt. Percy DNA-Synthese.Fügen Sie zwei Mikrogramm RNA, die aus den transezierten Hela-Zellen extrahiert wurden, in 200 Mikroliter Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und fügen Sie RNAs freies Wasser hinzu, um das Volumen auf niedrige 11 Mikroliter aufzufüllen. Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter hinzu, mischen Sie einen zu jeder Probe und inkubieren Sie zuerst bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten, dann auf Eis für eine Minute. Als nächstes fügen Sie sieben Mikroliter hinzu, mischen Sie zwei zu jeder Tube und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten, gefolgt von einer Inkubation bei 50 Grad Celsius für 60 Minuten und 70 Grad Celsius für 15 Minuten.Als nächstes verdünnen Sie für die PCR die C-DNA-Reaktion, um eine Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter zu erhalten, und übertragen Sie einen Mikroliter jeder CDNA-Probe auf neue PCR-Röhrchen. Fügen Sie 10,5 Mikroliter der Mastermischung zu jedem Röhrchen hinzu, das CDNA enthält, und führen Sie die PCR durch. Verwendung eines Thermocyclers Nach Abschluss der PCR.Fügen Sie jedem Röhrchen 12,5 Mikroliter 2X Formamid-DNA-Beladungsfarbstoff hinzu. Erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius und führen Sie eine UIA-Seite durch. Pipettieren Sie fünf Mikroliter verdünnter CDNA in einzelne Vertiefungen einer 96-Well qpcr-Platte dreifach.Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter Echtzeit-PCR-Mischung zu jeder Vertiefung hinzu, versiegeln Sie die Platten mit einem optischen Film und zentrifugieren Sie, um die Reaktionen am Boden der Wells zu sammeln, und führen Sie dann die qpcr durch, während Sie die Schwellenwert-Quantifizierungszykluswerte des Zielamplikons sammeln. Bevor Sie die Marker und Proben laden, spülen Sie die Bohrlöcher mit FSME-Puffer aus, um den abgesetzten Harnstoff zu entfernen. Laden Sie dann 10 Mikroliter jeder Probe pro Vertiefung und lassen Sie das Gel zwei bis drei Stunden lang mit 300 bis 500 Volt laufen, oder bis das Xylol den Boden erreicht.Nach der Elektrophorese die Glasplatten aus dem Elektrophoreseapparat entfernen und die beiden Platten vorsichtig trennen, so dass das Gel flach auf beiden Glasoberflächen liegt, dann das Gel auf ein Filterpapier übertragen und mit einer Plastikfolie abdecken, wobei das Gel mit einem Geltrockner 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius vakuumgetrocknet wird. Legen Sie dann das getrocknete Gel in eine Phosphor-Bildgebungskassette für die Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Wenn er in Hela-Zellen exprimiert wird, drückt der Schneidereporter dup 51 minnijean das reife Transkript in voller Länge aus, in dem Exxon two effizient gespleißt wird. Die fünf Prime-Spleißstellenmutationen und dup 51 P reduzieren die Exxon-Zwei-Einschließung von 95 auf 30%, was zur Bildung eines kürzeren Transkripts führt.Die Co-Expression von dup 51 P mit U15A SNRNA rettet Exxon zwei Spleißungen und stellt die Bildung des Transkripts in voller Länge wieder her. Im Gegensatz dazu hat die Co-Expression mit wilden U1- oder U15G-Varianten nicht den gleichen Effekt auf das dup 51P-Spleißen. Der Nachweis von U15A-Variantentranskripten verwendet primär das U1-Sieben- bis 26-Oligon-Nukleotid, das 20 Nukleotide lang ist, und Basenpaare in der Nähe des Adenins an der fünften Position der U1-SNRNA.In Gegenwart von DATP allein ermöglicht U1 sieben bis 26 die Integration von zwei bis drei Nukleotiden für die endogene Wildtyp-U1-SNRNA, was zu einem 22 oder 23 Nukleotid langen Produkt führt. Für U15A- und U15G-Varianten endet die Erweiterung nach Zugabe eines einzelnen Adenosins, das ein 21-Nukleotidprodukt erzeugt. Nach Der Normalisierung auf U2-SNRNA-Expression wurden transfizierte U1-Wildtyp-Varianten U1 5g und U15A drei- bis fünffach über der endogenen SNRNA exprimiert.Die Qualität der extrahierten RNA ist entscheidend für die Spleißanalyse. Daher wird die Verwendung von RNA-freiem Wasser und die Dekontamination von Diensten mit RNAs-Inaktivierungsmitteln dringend empfohlen. Das hier beschriebene Berichtssystem kann angewendet werden, um die Rolle von U1 SN-RNAs bei Spleißvorschriften für die Umkehrung der Wirkung von Flash-Preis-Spleißmutationen für das Gen-Silencing unter Verwendung modifizierter U1SN-RNAs zu untersuchen.

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Research

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JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and biochemically verified was opsin, the apoprotein of the photoreceptor rhodopsin. Rhodopsin is a G protein-coupled receptor localized in rod photoreceptor disc membranes of the retina where it is responsible for the perception of light. Rhodopsin&#39;s scramblase activity does not depend on its ligand 11-cis-retinal, i.e., the apoprotein opsin is also active as a scramblase. Although constitutive and regulated phospholipid scrambling play an important role in cell physiology, only a few phospholipid scramblases have been identified so far besides opsin. Here we describe a fluorescence-based assay of opsin&#39;s scramblase activity. Opsin is reconstituted into large unilamellar liposomes composed of phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and a trace quantity of fluorescent NBD-labeled PC (1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine). Scramblase activity is determined by measuring the extent to which NBD-PC molecules located in the inner leaflet of the vesicle are able to access the outer leaflet where their fluorescence is chemically eliminated by a reducing agent that cannot cross the membrane. The methods we describe have general applicability and can be used to identify and characterize scramblase activities of other membrane proteins.

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Forschung

Biochemie

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.

This protocol presents a method to evaluate the proteolytic activity of an intrinsically low-activity, single turnover protease in a cellular context. Specifically, this method is applied to evaluate the proteolytic activity of PCSK9, a key driver of lipid metabolism whose proteolytic activity is required for its ultimate hypercholesterolemic function.

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, this assay was used to analyze intrinsic levels of MeCP2 in mouse brain tissue and the uptake of TAT-MeCP2 in human dermal fibroblasts. The MeCP2-ECLIA produces highly accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error. In summary, we developed a quantitative method for the evaluation of MeCP2 protein variants that can be utilized in high-throughput screens.

The electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) is a novel approach for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants, which produces highly quantitative, accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error over a wide working range. Here, the protocol for the MeCP2-ECLIA in a 96-well format is described.

Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. Thiols are especially important for illuminating the redox status of cells via their reduced dithiol and oxidized disulfide ratios. Engineered cysteine-containing fluorescent proteins open a new era for redox-sensitive biosensors. One of them, redox-sensitive green fluorescent protein (roGFP), can easily be introduced into cells with adenoviral transduction, allowing the redox status of subcellular compartments to be evaluated without disrupting cellular processes. Reduced cysteines and oxidized cystines of roGFP have excitation maxima at 488 nm and 405 nm, respectively, with emission at 525 nm. Assessing the ratios of these reduced and oxidized forms allows the convenient calculation of redox balance within the cell. In this method article, immortalized human triple-negative breast cancer cells (MDA-MB-231) were used to assess redox status within the living cell. The protocol steps include MDA-MB-231 cell line transduction with adenovirus to express cytosolic roGFP, treatment with H2O2, and assessment of cysteine and cystine ratio with both flow cytometry and fluorescence microscopy.

This protocol describes the assessment of subcellular compartment-specific redox status within the cell. A redox-sensitive fluorescent probe allows convenient ratiometric analysis in intact cells.

Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of galectin-3 into the splicing pathway is addressed in this paper. Sedimentation of HeLa cell nuclear extracts on 12%-32% glycerol gradients yields fractions enriched in an endogenous ~10S particle that contains galectin-3 and U1 snRNP. We now describe a protocol to deplete nuclear extracts of U1 snRNP with concomitant loss of splicing activity. Splicing activity in the U1-depleted extract can be reconstituted by the galectin-3 - U1 snRNP particle trapped on agarose beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies. The results indicate that the galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternary complex is a functional E complex leading to intermediates and products of the splicing reaction and that galectin-3 enters the splicing pathway through its association with U1 snRNP. The scheme of using complexes affinity- or immuno-selected on beads to reconstitute splicing activity in extracts depleted of a specific splicing factor may be generally applicable to other systems.

This article describes the experimental procedures for (a) depletion of U1 snRNP from nuclear extracts, with concomitant loss of splicing activity; and (b) reconstitution of splicing activity in the U1-depleted extract by galectin-3 - U1 snRNP particles bound to beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies.

Komplementierung der Spleißaktivität durch einen Galectin-3 - U1 snRNP Komplex auf Perlen

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest advantage of NMR-based fragment screening is its ability not only to detect binders over 7-8 orders of magnitude of affinity but also to monitor purity and chemical quality of the fragments and thus to produce high quality hits and minimal false positives or false negatives. A prerequisite within the FBS is to perform initial and periodic quality control of the fragment library, determining solubility and chemical integrity of the fragments in relevant buffers, and establishing multiple libraries to cover diverse scaffolds to accommodate various macromolecule target classes (proteins/RNA/DNA). Further, an extensive NMR-based screening protocol optimization with respect to sample quantities, speed of acquisition and analysis at the level of biological construct/fragment-space, in condition-space (buffer, additives, ions, pH, and temperature) and in ligand-space (ligand analogues, ligand concentration) is required. At least in academia, these screening efforts have so far been undertaken manually in a very limited fashion, leading to limited availability of screening infrastructure not only in the drug development process but also in the context of chemical probe development. In order to meet the requirements economically, advanced workflows are presented. They take advantage of the latest state-of-the-art advanced hardware, with which the liquid sample collection can be filled in a temperature-controlled fashion into the NMR-tubes in an automated manner. 1H/19F NMR ligand-based spectra are then collected at a given temperature. High-throughput sample changer (HT sample changer) can handle more than 500 samples in temperature-controlled blocks. This together with advanced software tools speeds up data acquisition and analysis. Further, application of screening routines on protein and RNA samples are described to make aware of the established protocols for a broad user base in biomacromolecular research.

Fragment-based screening by NMR is a robust method to rapidly identify small molecule binders to biomacromolecules (DNA, RNA, or proteins). Protocols describing automation-based sample preparation, NMR experiments &#38; acquisition conditions, and analysis workflows are presented. The technique allows for optimal exploitation of both 1H and 19F NMR-active nuclei for detection.

NMR-basiertes Fragment-Screening mit minimaler Probe, aber maximalem Automatisierungsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.