Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

تم دعم إعداد هذه المخطوطة جزئيا من قبل مكتب أبحاث الجيش الأمريكي (W911NF2010321) وصناديق بدء تشغيل جامعة ولاية أريزونا إلى P.-L.C.

1. تفلون كتلة إعداد
<ol><li>إعداد كتلة تفلون من مقاومة للمواد الكيميائية PTFE (البوليتيترافلوروإيثيلين) الراتنج. قم بعمل ثقوب على الكتلة باستخدام حفر عام متبوعا بالأبعاد المسماة في الشكل 1.</li>
</ol>2. إعداد الدهون أحادية الطبقة
ملاحظة: ...

طبقة أحادية الدهون هي أداة قوية تسهل نمو بلورات كبيرة 2D للدراسات الهيكلية للجزيئات الكبيرة البيولوجية. لإعداد طبقة أحادية الدهون سليمة بنجاح في واجهة الهواء والماء، فمن المستحسن بشدة أن يتم إعداد الدهون طازجة في يوم التجربة، لأن أكسدة سلسلة أسيل الدهون يمكن أن يؤدي إلى اضطراب التعبئة في ...

يمكن أن يحقق الحيود الإلكتروني من خلال بلورات 2D أو صفائف حلية من البروتينات دقة دون نانومتر في الحالات المواتية1و2و3. من أهمية خاصة هي إعادة تشكيلها صفائف البروتين غشاء 2D أو بلورات في بيئاتها شبه الأصلية1. ولأن الكريستال يعمل كمضخم إشارة يعزز شدة العوامل الهيكلية على ترددات مكانية محددة، فإن علم البلورات الإلكترونية يسمح بالتحقيق في هدف بحجم أصغر بدقات عالية، مثل الجزيئات الصغيرة، من تلك الخاصة بالتبريد-EM أحادي الجسيمات. يمكن أن ينتشر شعاع الإلكترون من خلال مجموعة بروتينات 2D مرتبة ، مما يولد نمطا للانعراج أو صورة شعرية اعتمادا على مكان تسجيل مستوى الصورة على الكاشف4. ويمكن بعد ذلك استخراج الكثافات المنتشرة ومعالجتها لإعادة بناء هيكل إسقاط 2D من الكريستال. الإلكترونات لديها أكبر تشتت المقطع العرضي من الأشعة السينية وتشتتها يتبع في الغالب نموذج رذرفورد على أساس التفاعل كولومب بين الإلكترونات والذرات المشحونة في جزيء5. سمك بلورات الغشاء ثنائي الأبعاد عادة ما تكون أقل من 100 نانومتر، ومناسبة لانتقال الإلكترون دون التشتت الديناميكي الذي يحدث داخل العينة6. وقد ثبت أن الدراسات البلورية الإلكترونية أداة قوية للتحقيق في المعلومات الهيكلية عالية الدقة من بروتينات الأغشية والتفاعلات البروتين الدهني7،8،9،10،11،12،13،14،15،16،17.
و monolayer الدهون هي طبقة واحدة من الدهون تتكون من فوسفوليبيدات معبأة بكثافة في واجهة الهواء والماء6، والتي يمكن أن تساعد في تشكيل صفيف 2D للبروتينات القابلة للذوبان أو بروتينات الغشاء المحيطي18. اعتمادا على كثافة الدهون وضغطها الجانبي ، يمكن أن تشكل جزيئات الدهون صفيفا ثنائي الأبعاد مرتبا على واجهة الهواء والماء مع سلاسل أسيل الممتدة إلى الهواء ومجموعات الرأس الهيدروفيلية المكشوفة في المحلول المائي1و6و19. يمكن أن تتفاعل المجموعة الرأسية الدهنية مع البروتينات عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي أو يمكن تعديلها لتوفير علامة تقارب لربط مجال بروتين معين. على سبيل المثال، وDINGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni 2+) غالبا ما يستخدم في تشكيل أحادي الطبقة الدهنية لربط البروتينات مع علامة البولي هيستيدين20،21،22. أيضا ، يمكن للسموم الكوليرا B ربط pentasaccharide معينة من gm1 ganglioside في monolayer الدهون للدراسات الهيكلية23،24. من خلال ترسيخ البروتينات على مجموعات الرأس الدهنية ، يمكن أن تساعد الطبقة الأحادية الدهنية في تكوين الصفائف 2D الرقيقة للدراسات البلورية الإلكترونية عالية الدقة. وقد استخدمت تقنية monolayer الدهون في علم البلورات الإلكترونية للدراسات الهيكلية للبروتينات، مثل streptavidin2،25، annexin V26، الكوليرا السم27، E. coli gyrase B subunit28، E. coli RNA polymerase25،29،30، carboxysome قذيفة البروتينات31 والبروتينات capsid من فيروس نقص المناعة البشرية -1 32 ومولوني مورين فيروس سرطان الدم 33.نظرا للاستقرار والخصائص الكيميائية للدهون monolayer، وقد تم استكشاف تطبيقات مختلفة لإعداد عينة للتصوير cryo-EM34. ومع ذلك، سوف تكون هناك حاجة إلى التحسين لتشكيل صفيف البروتين.
هنا، ونحن نقدم تفاصيل مستفيضة عن الإعداد العام من monolayers الدهون للتصوير cryo-EM وبعض الاعتبارات التي يمكن أن تؤثر على نوعية monolayers شكلت.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

علم البلورات الإلكترونية هو أداة قوية لتحديد هيكل عالية الدقة. يمكن زراعة الجزيئات الكبيرة مثل البروتينات القابلة للذوبان أو الأغشية إلى بلورات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) مرتبة للغاية في ظل ظروف مواتية. نوعية بلورات 2D نمت أمر بالغ الأهمية لقرار إعادة الإعمار النهائي عن طريق معالجة الصور 2D. على مر السنين، استخدمت monolayers الدهون كطبقة داعمة لتعزيز بلورة 2D من بروتينات الغشاء المحيطي، فضلا عن البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على بلورة ثنائية الأبعاد لبروتينات الأغشية المتكاملة ولكنها تتطلب إجراء تحقيق تجريبي أكثر شمولا لتحديد المنظفات وظروف غسيل الكلى لتعزيز التقسيم إلى طبقة أحادية. تتشكل طبقة أحادية الدهون في واجهة الهواء والماء بحيث تظل مجموعات رأس الدهون القطبية رطبة في المرحلة المائية وتقسم سلاسل acyl غير القطبية والذيول إلى الهواء ، مما يكسر التوتر السطحي ويسطح سطح الماء. توفر الطبيعة المشحونة أو moieties الكيميائية المميزة للمجموعات الرأسية تقاربا للبروتينات في المحلول ، مما يعزز الربط لتشكيل الصفيف 2D. يمكن نقل طبقة أحادية تم تشكيلها حديثا مع الصفيف ثنائي الأبعاد بسهولة إلى المجهر الإلكتروني (EM) على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون تستخدم لرفع ودعم الصفيف البلوري. في هذا العمل، ونحن نصف منهجية أحادية الطبقة الدهون للتصوير المجهري الإلكتروني المبردة (cryo-EM).

يمكن تصور طبقة أحادية الدهون المودعة على شبكة EM تحت المجهر الإلكتروني ناقل الحركة (TEM) دون تلطيخ. يمكن التعرف على وجود أحادي الطبقة من خلال الفرق التباين من المنطقة دون أي عينة في مسار شعاع. المناطق التي لديها تغطية أحادية الطبقة الدهنية لديها تباين محلي أقل من تلك التي لا تغطيها ، لأن شعاع ?...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

وقد استخدمت monolayers الدهون كأساس لتشكيل بلورات البروتين ثنائي الأبعاد (2D) للدراسات الهيكلية لعقود. فهي مستقرة في واجهة الهواء والماء ويمكن أن تكون بمثابة مادة داعمة رقيقة للتصوير الإلكتروني. هنا نقدم الخطوات المثبتة على إعداد monolayers الدهون للدراسات البيولوجية.

إعداد العينة باستخدام طريقة أحادية الطبقة الدهون للدراسات البلورية الإلكترون

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

على مر السنين، وقد استخدمت Monolayers الدهون كطبقة داعمة لتعزيز بلورة 2D من بروتينات الغشاء المحيطي، فضلا عن البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تبلور 2D، وبعض البروتينات غشاء لا يتجزأ. ولكن يتطلب إجراء تحقيق تجريبي أكثر شمولا لتحديد المنظفات وظروف غسيل الكلى لتعزيز التقسيم إلى طبقة أحادية الدهون.تتشكل طبقة أحادية الدهون في واجهة ماء الهواء ، بحيث تظل مجموعات الرأس القطبية للدهون رطبة في المرحلة المائية. وذيول أسيل غير القطبية من القسم الدهون إلى واجهة مياه الهواء، الذي يكسر التوتر السطحي وتسطيح سطح الماء. تهمة طبيعة moieties الكيميائية المميزة للمجموعات رئيس الدهون توفير تقارب للبروتينات في الحل.تعزيز الربط، وفي تكوين الصفيف 2D المبدأ. يمكن نقل أي بلورات ثنائية الأبعاد تتشكل على طبقة أحادية الدهون بسهولة إلى المجهر الإلكتروني على شبكة EM مغلفة بالكربون تستخدم لرفع ودعم الصفيف البلوري على طبقة الدهون. وصفنا في هذه المخطوطة، منهجية أحادية الطبقة للدهون لتصوير المجهر الإلكتروني المبرد.إعداد أحادي الطبقة الدهون. إعداد مخزون الدهون، وإعداد 0.01 ملغ لكل مل خليط الدهون في حجم 9:1 لحجم الكلوروفورم، الميثانول. باستخدام 8.91 مل من الكلوروفورم و 0.99 مل من الميثانول و 0.1 مل من محلول 10 ملغ لكل مل من الدهون.إعداد لوحة تفلون. سونيكاتي لوحة تفلون في حمام الميثانول لمدة خمس دقائق. يغسل بالماء الساخن لمدة 15 دقيقة ثم يشطف بالماء المقطر.جفف صفيحة تفلون في مجفف لمدة 30 دقيقة وأبقها تحت الفراغ حتى الاستخدام. تشكيل أحادي الطبقة الدهون على خزان العازلة. وقت التشغيل المقدر سيكون ساعة ونصف.ضع ورقة تصفية من نوع واحد في طبق بيتري وقم بترتيب كتلة تفلون أعلى ورقة التصفية. ملء الآبار من لوحة تفلون مع 60 ميكرولتر من العازلة. إضافة بعناية خليط السائل على رأس سطح العازلة قطرة قطرة.من الناحية المثالية واحد ميكرولتر لكل قطرة باستخدام حقنة هاملتون. بلل ورق الفلتر بالماء المقطر و حافظ على الرطوبة في طبق بيتري. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة، يجب أن يتبخر الكلوروفورم وينبغي تشكيل طبقة أحادية من الدهون على سطح المخازن المؤقتة.تطبيق شبكة EM على طبقة أحادية الدهون. وقت التشغيل المقدر ساعة ونصف. ضع بلطف شبكة EM المغلفة بالكربون دون توهج تفريغ جانب الكربون لأسفل على سطح كل خزان عازل.حقن البروتينات بعناية في حقن الجانب جيدا، واستخدام تركيزات البروتين النهائي في البئر حول ميكرومولار واحد. احتضان 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حقن بلطف ما يقرب من 20 إلى 30 ميكرولتر من العازلة في منفذ الحقن الموقع لرفع الشبكة فوق سطح كتلة تفلون.هذا يسمح لك لالتقاط الشبكة مع زوج من الملاقط ورفعه عموديا قبالة القطيرات. النتائج التمثيلية. يمكن تصور طبقة أحادية الدهون المودعة على شبكة EM تحت المجهر الإلكتروني الإرسال دون تلطيخ التباين.يمكن التعرف على وجود أحادي الطبقة ، من خلال الفرق التباين من المنطقة دون أي عينة في مسار الحزمة هذا. المناطق التي لديها تغطية أحادية الطبقة الدهنية لديها تباين أقل من تلك التي لا تغطيها. منذ شعاع الإلكترون من خلال الثقوب الفارغة لا يوجد لديه التشتت فإنه يظهر إضاءة أكثر إشراقا.في الختام، طريقة أحادية الطبقة الدهنية يوفر فرصة لدراسة هياكل البروتين بسبب بساطته. وقد يوفر نهجا بديلا لتسهيل عملية التبلور 2D.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

سير العمل وأدوات لفحص الأجزاء البلورية في هيلمهولتز-زينتروم برلين

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

إعداد عينات من أفلام الدعم في المجهر الإلكترون الإرسال باستخدام كتلة دعم التعويم

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

دراسات الارتباط واسعة النطاق متعددة الأوميكس على نطاق الجينوم (Mo-GWAS): مبادئ توجيهية لإعداد العينات وتطبيعها

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...