Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Udarbejdelsen af dette manuskript blev delvist støttet af US Army Research Office (W911NF2010321) og Arizona State University start midler til P.-L.C.

1. Forberedelse af teflonblok
<ol><li>Tilbered teflonblokken fra kemisk resistent PTFE -harpiks (polytetrafluoroethylen). Lav huller på blokken ved hjælp af en generel boremaskine efterfulgt af de dimensioner, der er mærket i figur 1.</li>
</ol>2. Monolayer lipid forberedelse
BEMÆRK: Anslået driftstid: 30- 45 minutter
<ol><li>Lipid lager forberedelse<ol>
<li>Der fremstilles en 0,01 mg/mL lipidbland...

En lipid monolayer er et kraftfuldt værktøj, der letter væksten af store 2D-krystaller til strukturelle undersøgelser af biologiske makromolekyler. For at kunne forberede en intakt lipid monolayer på luft-vand interface, anbefales det kraftigt, at lipider fremstilles frisk på dagen for eksperimentet, fordi oxidering af lipid acyl kæde kan føre til pakning forstyrrelser i monolayer og negativt påvirke den resulterende krystal dannelse. Købte lipider i pulverform skal opløses ved hjælp af en blanding af chlorof...

Elektron diffraktion gennem 2D krystaller eller spiralformede arrays af proteiner kan opnå sub-nanometer opløsninger i gunstige tilfælde1,2,3. Af særlig interesse er rekonstitueret 2D membran protein arrays eller krystaller i deres nær-indfødte miljøer1. Fordi en krystal fungerer som en signalforstærker øge intensiteten af de strukturelle faktorer ved specifikke rumlige frekvenser, elektron krystallografi tillader sondering et mål med en mindre størrelse ved høje opløsninger, såsom små molekyler, end dem for enkelt-partikel cryo-EM. Elektronstrålen kan diffrakteres af en ordnet 2D-vifte af proteiner, hvilket genererer et diffraktionsmønster eller et gitterbillede afhængigt af, hvor billedplanet er optaget pådetektoren 4. De diffracted intensiteter kan derefter udvindes og behandles for at rekonstruere en 2D projektion struktur af krystallen. Elektroner har en større spredning tværsnit end røntgenstråler og dens spredning for det meste følger Rutherford model baseret på Coulomb interaktion mellem elektroner og ladede atomer imolekylet 5. Tykkelserne af 2D-membrankrystaller er normalt mindre end 100 nm, egnet til elektrontransmission uden dynamisk spredning, der forekommer i prøve6. Elektronkrystalgrafiske undersøgelser har vist sig at være et kraftfuldt værktøj til at sondere strukturelle oplysninger i høj opløsning af membranproteiner og lipidproteininteraktioner7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
En lipid monolayer er et enkelt lipidlag bestående af fosfolipider tæt pakket ved en luft-vand interface6, som kan hjælpe 2D array dannelse for opløselige proteiner eller perifere membran proteiner18. Afhængigt af lipidernes massefylde og deres laterale tryk kan lipidmolekylerne danne et ordnet 2D-array på luftvandsgrænsefladen med deres acylkæder udvidet til luften og hydrofile hovedgrupper, der eksponeres i den vandige opløsning1,6,19. Lipid hovedgruppen kan interagere med proteiner via elektrostatisk interaktion eller kan ændres til at give en affinitet tag til at binde et bestemt protein domæne. For eksempel bruges DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) ofte til at danne en lipid monolayer til at binde proteinerne med et poly-histidin tag20,21,22. Også kolera toksin B kan binde en bestemt pentasaccharid af ganglioside GM1 i en lipid monolayer til strukturelle undersøgelser23,24. Ved at forankre proteinerne på lipidhovedgrupperne kan lipidmonomonlayeren hjælpe med dannelsen af 2D-arrays, der er tynde til elektronkrystalgrafiske undersøgelser med høj opløsning. Lipid monolayer teknikken er blevet anvendt i elektronkrystallografi til strukturelle undersøgelser af proteiner, såsom streptavidin2,25, annexin V26, kolera toksin27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA polymerase25,29,30, carboxysome shell proteiner31 og capsid proteiner hiv-132 og Moloney murin leukæmi virus 33. På grund af stabiliteten og den kemiske egenskab af lipid monolayer, forskellige anvendelser for prøve forberedelse er blevet undersøgt for cryo-EM imaging34. Optimering vil dog være nødvendig for protein array dannelse.
Her giver vi omfattende detaljer om den generelle forberedelse af lipidmonomer til kryo-EM-billeddannelse og nogle overvejelser, der kan påvirke kvaliteten af de dannede monolayers.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

Elektronkrystallografi er et kraftfuldt værktøj til strukturbestemmelse med høj opløsning. Makromolekyler såsom opløselige eller membranproteiner kan dyrkes til højt ordnede todimensionelle (2D) krystaller under gunstige forhold. Kvaliteten af de dyrkede 2D-krystaller er afgørende for opløsningen af den endelige genopbygning via 2D-billedbehandling. I årenes løb er lipidmonomer blevet brugt som et støttelag til at fremme 2D-krystallisering af perifere membranproteiner samt opløselige proteiner. Denne metode kan også anvendes på 2D krystallisering af integrerede membranproteiner, men kræver mere omfattende empirisk undersøgelse for at bestemme vaskemiddel og dialyse betingelser for at fremme partitionering til monolayer. En lipid monolayer dannes på luft-vand interface således, at polar lipid hoved grupper forbliver hydreret i den vandige fase og de ikke-polære, acyl kæder, haler partition i luften, bryde overfladespændingen og udfladning vandoverfladen. Hovedgruppernes ladede natur eller karakteristiske kemiske moieties giver affinitet for proteiner i opløsning, der fremmer binding til 2D-arraydannelse. En nydannet monolag med 2D-arrayet kan let overføres til et elektronmikroskop (EM) på et kulstofbelagt kobbergitter, der bruges til at løfte og understøtte det krystallinske array. I dette arbejde beskriver vi en lipid monolayer metode til kryogen elektron mikroskopisk (cryo-EM) billeddannelse.

En lipid monolayer deponeret på EM nettet kan visualiseres under en transmission elektron mikroskop (TEM) uden farvning. Monolagstilstedeværelsen kan genkendes af kontrastforskellen fra området uden nogen prøve i strålestien. Områder, der har lipid monolayer dækning har lavere lokal kontrast end dem uden dækning, da elektronstrålen gennem de tomme huller ikke har nogen spredning og viser en lysere belysning (Figur 3).
For at screene betingelserne for 2D m...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Lipid monolayers er blevet brugt som et fundament for at danne to-dimensionelle (2D) protein krystaller til strukturelle undersøgelser i årtier. De er stabile ved luft-vand interface og kan tjene som en tynd støtte materiale til elektron imaging. Her præsenterer vi de dokumenterede trin til forberedelse af lipidmonomer til biologiske undersøgelser.

Prøvepræparat ved hjælp af en Lipid Monolayer-metode til elektronkrygrafiske studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

I årenes løb er lipidmonomer blevet brugt som et støttelag til at fremme 2D krystallisering af perifere membranproteiner samt opløselige proteiner. Denne metode kan også anvendes til 2D krystallisering, som nogle integrerede membran proteiner. Men kræver mere omfattende empirisk undersøgelse for at bestemme vaskemiddel og dialyse betingelser for at fremme partitionering til lipid monolayer.En lipid monolayer dannes på luftvand interface, således at polar hoved grupper af lipid forbliver hydreret i den vandige fase. Og de ikke-polære acylhaler af lipidpartitionen til luftvandsgrænsefladen, som bryder overfladespændingen og flader vandoverfladen. Opladningskarakteren lipidhovedgruppernes karakteristiske kemiske moieties giver affiniteten for proteiner i opløsning.Fremme bindende, og i princippet 2D array dannelse. Enhver 2D krystaller dannet på en lipid monolayer kan let overføres til elektron mikroskop på et kulstofbelagt EM gitter, der bruges til at løfte og støtte krystallinske array på lipid lag. Vi beskrev i dette manuskript, en lipid monolayer metode til kryogen elektronmikroskopi billeddannelse.Lipid monolayer forberedelse. Lipid lager forberedelse, forberede en 0,01 mg pr ml lipid blanding i 9:1 volumen til volumen chloroform, methanol. Ved anvendelse af 8,91 ml kloroform og 0,99 ml methanol og 0,1 mls 10 mg pr. ml lipidopløsning.Teflon plade forberedelse. Sonikere en Teflon plade i et methanol bad i fem minutter. Vask med varmt vand i 15 minutter og skyl derefter med destilleret vand.Teflonpladen tørres i en udtørret i 30 minutter, og hold den under vakuum, indtil den er i brug. Dannelse af lipid monolayer på buffer reservoir. Den anslåede driftstid vil være halvanden time.Placer en type et filterpapir i en petriskål, og arranger teflonblokken oven på filterpapiret. Fyld brøndene på Teflon-pladen med 60 mikroliter buffer. Tilsæt forsigtigt flydende blanding oven på bufferoverfladen dråbe for dråbe.Ideelt set en mikroliter pr. dråbe ved hjælp af en Hamilton-sprøjte. Våd filterpapiret med destilleret vand og hold fugtigheden i petriskålen. Inkubere ved stuetemperatur i 60 minutter, kloroformen skal fordampe, og der skal dannes en monolag lipid på buffernes overflade.Anvendelse af et EM-gitter på en lipidmonomer. Anslået driftstid halvanden time. Placer forsigtigt et kulbelagt EM-gitter uden glød, der afleder kulstofsiden ned på overfladen af hvert bufferbeholder.Injicer forsigtigt proteiner i sideinjektionen godt, brug endelige proteinkoncentrationer i brønden omkring en mikromolar. Inkuber 60 minutter ved stuetemperatur. Indsprøjt forsigtigt ca. 20 til 30 mikroliter buffer i injektionsporten på stedet for at hæve gitteret over teflonblokkens overflade.Dette giver dig mulighed for at afhente gitteret med et par pincet og løfte det lodret fra dråben. Repræsentative resultater. En lipid monolayer deponeret på en EM gitter kan visualiseres under transmission elektron mikroskop uden kontrast farvning.Monolagstilstedeværelsen kan genkendes ved kontrastforskellen fra området uden nogen prøve i den pågældende strålesti. Områder, der har lipid monolayer dækning har lavere kontrast end dem uden dækning. Da elektronstrålen gennem de tomme huller ikke har nogen spredning, viser den en lysere belysning.Afslutningsvis giver lipid monolayer-metoden mulighed for at studere proteinstrukturer på grund af dets enkelhed. Det kan give en alternativ tilgang til at lette processen med 2D krystallisering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En forberedelse til plasmaprøve til massespektrometri ved hjælp af en automatiseret arbejdsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse til Proteomics Facility Indsendelse og efterfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening på Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Forberedelse af prøvestøttefilm i transmissionselektronmikroskopi ved hjælp af en støtteflådsblok

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-scale Multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): Retningslinjer for prøveforberedelse og normalisering

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...