Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

De voorbereiding van dit manuscript werd gedeeltelijk ondersteund door het US Army Research Office (W911NF2010321) en de start-upfondsen van de Arizona State University aan P.-L.C.

1. Voorbereiding van het teflonblok
<ol><li>Bereid het teflonblok voor uit chemisch resistente PTFE-hars (polytetrafluorethyleen). Maak gaten in het blok met behulp van een algemene boor gevolgd door de afmetingen die zijn gelabeld in figuur 1.</li>
</ol>2. Monolaags lipidepreparaat
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 30- 45 minuten
<ol><li>Lipidenvoorraad voorbereiding<ol>
<li>Bereid een lipidenmengsel ...

Een lipide monolaag is een krachtig hulpmiddel dat de groei van grote 2D-kristallen vergemakkelijkt voor structurele studies van biologische macromoleculen. Om met succes een intacte lipide monolaag op het lucht-water interface te bereiden, wordt het sterk aanbevolen dat de lipiden vers worden bereid op de dag van het experiment, omdat oxidatie van de lipide acylketen kan leiden tot verstoring van de verpakking in de monolaag en de resulterende kristalvorming nadelig kan beïnvloeden. Gekochte lipiden in poedervorm moete...

Elektronendiffractie door 2D-kristallen of spiraalvormige arrays van eiwitten kan sub-nanometerresoluties bereiken in gunstige gevallen1,2,3. Van bijzonder belang zijn gereconstitueerde 2D-membraaneiwitarrays of kristallen in hun near-native omgevingen1. Omdat een kristal fungeert als een signaalversterker die de intensiteit van de structurele factoren bij specifieke ruimtelijke frequenties verbetert, maakt elektronenkristallografie het mogelijk om een doelwit te onderzoeken met een kleinere grootte bij hoge resoluties, zoals kleine moleculen, dan die voor cryo-EM met één deeltje. De elektronenbundel kan worden gediffracteerd door een geordende 2D-array van eiwitten, waardoor een diffractiepatroon of een roosterbeeld wordt gegenereerd, afhankelijk van waar het beeldvlak wordt geregistreerd op de detector4. De diffracted intensiteiten kunnen vervolgens worden geëxtraheerd en verwerkt om een 2D-projectiestructuur van het kristal te reconstrueren. Elektronen hebben een grotere verstrooiingsdoorsnede dan röntgenstralen en de verstrooiing ervan volgt meestal het Rutherford-model op basis van de Coulomb-interactie tussen de elektronen en de geladen atomen in het molecuul5. De diktes van 2D-membraankristallen zijn meestal minder dan 100 nm, geschikt voor elektronenoverdracht zonder dynamische verstrooiing binnen monster6. Van elektronkristallografische studies is aangetoond dat het een krachtig hulpmiddel is om structurele informatie met hoge resolutie van membraaneiwitten en lipide-eiwitinteracties7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17te onderzoeken.
Een lipide monolaag is een enkele lipidelaag die bestaat uit fosfolipiden die dicht opeengepakt zijn op een lucht-waterinterface6, die de vorming van 2D-arrays voor oplosbare eiwitten of perifere membraaneiwitten kan helpen18. Afhankelijk van de dichtheid van de lipiden en hun laterale druk, kunnen de lipidemoleculen een geordende 2D-array vormen op de lucht-waterinterface met hun acylketens uitgebreid naar de lucht en hydrofiele hoofdgroepen blootgesteld in de waterige oplossing1,6,19. De lipidehoofdgroep kan interageren met eiwitten via elektrostatische interactie of kan worden aangepast om een affiniteitstag te bieden om een specifiek eiwitdomein te binden. Bijvoorbeeld, de DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) wordt vaak gebruikt bij het vormen van een lipide monolaag om de eiwitten te binden met een poly-histidine tag20,21,22. Ook kan het choleratoxine B een bepaalde pentasaccharide van ganglioside GM1 binden in een lipide monolaag voor structurele studies23,24. Door de eiwitten op de lipidehoofdgroepen te verankeren, kan de lipide monolaag helpen bij de vorming van de 2D-arrays die dun zijn voor elektronenkristallografische studies met hoge resolutie. De lipide monolayer techniek is gebruikt in de elektronenkristallografie voor structurele studies van eiwitten, zoals streptavidin2,25,annexine V26,cholera toxine27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA polymerase 25,29,30, carboxysome shell proteins31 en de capsid eiwitten van het HIV-132 en Moloney murine leukemie virus 33. Vanwege de stabiliteit en chemische eigenschap van de lipide monolaag, zijn verschillende toepassingen voor monstervoorbereiding onderzocht voor cryo-EM-beeldvorming34. Optimalisatie zal echter nodig zijn voor de vorming van eiwitarrays.
Hier geven we uitgebreide details over de algemene voorbereiding van lipide monolagen voor cryo-EM beeldvorming en enkele overwegingen die de kwaliteit van de gevormde monolagen kunnen beïnvloeden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

Elektronenkristallografie is een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van structuren met hoge resolutie. Macromoleculen zoals oplosbare of membraaneiwitten kunnen onder gunstige omstandigheden worden gekweekt tot zeer geordende tweedimensionale (2D) kristallen. De kwaliteit van de gekweekte 2D kristallen is cruciaal voor de resolutie van de uiteindelijke reconstructie via 2D beeldverwerking. In de loop der jaren zijn lipide monolagen gebruikt als een ondersteunende laag om de 2D-kristallisatie van perifere membraaneiwitten en oplosbare eiwitten te bevorderen. Deze methode kan ook worden toegepast op 2D-kristallisatie van integrale membraaneiwitten, maar vereist uitgebreider empirisch onderzoek om detergent- en dialyseomstandigheden te bepalen om partitionering naar de monolaag te bevorderen. Een lipide monolaag vormt zich op het lucht-water interface zodanig dat de polaire lipidekopgroepen gehydrateerd blijven in de waterige fase en de niet-polaire, acylketens, staarten zich in de lucht afscheiden, waardoor de oppervlaktespanning wordt verbroken en het wateroppervlak wordt afgevlakt. De geladen aard of onderscheidende chemische eigenschappen van de kopgroepen bieden affiniteit voor eiwitten in oplossing, waardoor binding voor 2D-arrayvorming wordt bevorderd. Een nieuw gevormde monolaag met de 2D-array kan gemakkelijk worden overgedragen in een elektronenmicroscoop (EM) op een met koolstof gecoat koperen raster dat wordt gebruikt om de kristallijne array op te tillen en te ondersteunen. In dit werk beschrijven we een lipide monolaag methodologie voor cryogene elektronen microscopische (cryo-EM) beeldvorming.

Een lipide monolaag afgezet op het EM-raster kan worden gevisualiseerd onder een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) zonder kleuring. De monolaagaanwezigheid is te herkennen aan het contrastverschil met het gebied zonder enig monster in het bundelpad. Gebieden met lipide monolaagdekking hebben een lager lokaal contrast dan die zonder dekking, omdat de elektronenbundel door de lege gaten geen verstrooiing heeft en een helderdere verlichting vertoont(figuur 3).
O...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

In de loop der jaren zijn lipide monolagen gebruikt als een ondersteunende laag om de 2D-kristallisatie van perifere membraaneiwitten en oplosbare eiwitten te bevorderen. Deze methode kan ook worden toegepast op 2D-kristallisatie, zoals sommige integrale membraaneiwitten. Maar vereist uitgebreider empirisch onderzoek om detergent- en dialyseomstandigheden te bepalen om de verdeling van de lipidemonolaag te bevorderen.Een lipide monolaag vormt zich op het luchtwaterinterface, zodat de polaire kopgroepen van het lipide gehydrateerd blijven in de waterige fase. En de niet-polaire acylstaarten van de lipideverdeling naar de luchtwaterinterface, die de oppervlaktespanning breekt en het wateroppervlak afvlakt. De lading aard de onderscheidende chemische moieties van de lipide kop groepen zorgen voor de affiniteit voor eiwitten in oplossing.Het bevorderen van binding, en in principe 2D array vorming. Alle 2D-kristallen gevormd op een lipide monolaag kunnen gemakkelijk worden overgebracht naar de elektronenmicroscoop op een met koolstof gecoat EM-raster dat wordt gebruikt om de kristallijne array op de lipidelaag op te tillen en te ondersteunen. We beschreven in dit manuscript een lipide monolaag methodologie voor cryogene elektronenmicroscopie beeldvorming.Lipide monolaag voorbereiding. Lipidenbouillonpreparaat, bereid een lipidenmengsel van 0,01 mg per ml in 9:1 volume tot volume chloroform, methanol. Met 8,91 ml chloroform en 0,99 ml methanol en 0,1 ml een lipide-oplossing van 10 mg per ml.Teflon plaat voorbereiding. Soniceer een teflonplaat in een methanolbad gedurende vijf minuten. Was 15 minuten met heet water en spoel vervolgens af met gedestilleerd water.Droog de teflonplaat 30 minuten in een uitgedroogde laag en houd deze tot gebruik onder vacuüm. Vorming van lipide monolaag op bufferreservoir. De geschatte bedrijfstijd zal anderhalf uur zijn.Leg een type één filterpapier in een petrischaaltje en schik het teflonblok bovenop het filtreerpapier. Vul de putjes van de teflonplaat met 60 microliter buffer. Voeg voorzichtig druppels voor druppel een vloeibaar mengsel toe aan het bufferoppervlak.Idealiter één microliter per druppel met behulp van een Hamilton-spuit. Maak het filtreerpapier nat met gedestilleerd water en bewaar de vochtigheid in de petrischaal. Incubateer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten, de chloroform moet verdampen en een monolaag van lipide op het oppervlak van de buffers moet worden gevormd.Toepassing van een EM-raster op een lipide monolaag. Geschatte bedrijfstijd anderhalf uur. Plaats voorzichtig een met koolstof gecoat EM-rooster zonder gloed die de koolstofzijde naar beneden op het oppervlak van elk bufferreservoir ontlaaft.Injecteer voorzichtig eiwitten in de zijinjectieput, gebruik de uiteindelijke eiwitconcentraties in de put rond één micromolair. Incubeer 60 minuten bij kamertemperatuur. Injecteer voorzichtig ongeveer 20 tot 30 microliter buffer in de injectiepoort van de plaats om het rooster boven het oppervlak van het teflonblok te verhogen.Hiermee kun je met een pincet het rooster oppakken en verticaal van de druppel tillen. Representatieve resultaten. Een lipide monolaag afgezet op een EM-raster kan worden gevisualiseerd onder de transmissie-elektronenmicroscoop zonder contrastkleuring.De monolaagaanwezigheid is te herkennen aan het contrastverschil met het gebied zonder enig monster in dat straalpad. Gebieden met lipide monolaagdekking hebben een lager contrast dan gebieden zonder dekking. Omdat de elektronenbundel door de lege gaten geen verstrooiing heeft, vertoont deze een helderdere verlichting.Kortom, de lipide monolayer-methode biedt een mogelijkheid voor het bestuderen van eiwitstructuren vanwege zijn eenvoud. Het kan een alternatieve benadering bieden om het proces van 2D-kristallisatie te vergemakkelijken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow en tools voor kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Voorbereiding van sample support films in transmissie elektronenmicroscopie met behulp van een support floatation block

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Grootschalige multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): richtlijnen voor monstervoorbereiding en normalisatie

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...