Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
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La préparation de ce manuscrit a été partiellement soutenue par le US Army Research Office (W911NF2010321) et les fonds de démarrage de l’Arizona State University à P.-L.C.

1. Préparation des blocs de téflon
<ol><li>Préparez le bloc de téflon à partir de résine PTFE (polytétrafluoroéthylène) résistante aux produits chimiques. Faites des trous sur le bloc à l’aide d’une perceuse générale suivie des dimensions indiquées à la figure 1.</li>
</ol>2. Préparation lipidique monocouche
REMARQUE: Durée de fonctionnement estimée: 30-45 minutes
<ol><li>Préparat...

Une monocouche lipidique est un outil puissant qui facilite la croissance de gros cristaux 2D pour les études structurales de macromolécules biologiques. Pour préparer avec succès une monocouche lipidique intacte à l’interface air-eau, il est fortement recommandé que les lipides soient préparés fraîchement le jour de l’expérience, car l’oxydation de la chaîne lipidique acyle pourrait entraîner une perturbation de l’emballage dans la monocouche et nuire à la formation de cristaux qui en résulte. Les ...

La diffraction d’électrons à travers des cristaux 2D ou des réseaux hélicoïdaux de protéines peut atteindre des résolutions inférieures au nanomètre dans des cas favorables1,2,3. Les réseaux de protéines membranaires 2D reconstitués ou les cristaux dans leur environnement quasi natif sont particulièrement intéressants1. Parce qu’un cristal agit comme un amplificateur de signal améliorant les intensités des facteurs structurels à des fréquences spatiales spécifiques, la cristallographie électronique permet de sonder une cible de taille plus petite à haute résolution, telle que de petites molécules, que celles de cryo-EM à particule unique. Le faisceau d’électrons peut être diffracté par un réseau ordonné de protéines 2D, générant un motif de diffraction ou une image en treillis selon l’endroit où le plan d’image est enregistré sur le détecteur4. Les intensités diffractées peuvent ensuite être extraites et traitées pour reconstruire une structure de projection 2D du cristal. Les électrons ont une plus grande section de diffusion que les rayons X et sa diffusion suit principalement le modèle de Rutherford basé sur l’interaction de Coulomb entre les électrons et les atomes chargés dans la molécule5. Les épaisseurs des cristaux de membrane 2D sont généralement inférieures à 100 nm, adaptées à la transmission d’électrons sans diffusion dynamique se produisant dans l’échantillon6. Les études cristallographiques électroniques se sont révélées être un outil puissant pour sonder l’information structurelle à haute résolution des protéines membranaires et des interactions lipide-protéine7,8,9,10 , 11,12, 13,14,15,16,17.
Une monocouche lipidique est une seule couche lipidique composée de phospholipides densément emballés à une interface air-eau6, qui peut aider à la formation du réseau 2D pour les protéines solubles ou les protéines de la membrane périphérique18. En fonction de la densité des lipides et de leur pression latérale, les molécules lipidiques peuvent former un réseau ordonné 2D sur l’interface air-eau avec leurs chaînes acyl étendues à l’air et aux groupes de tête hydrophiles exposés dans la solution aqueuse1,6,19. Le groupe de tête lipidique peut interagir avec les protéines via une interaction électrostatique ou peut être modifié pour fournir une balise d’affinité pour lier un domaine protéique spécifique. Par exemple, le DOGS-NTA-Ni (acide 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)acide iminodiacétique)succinyl]2-Ni2+) est souvent utilisé pour former une monocouche lipidique pour lier les protéines avec une étiquette poly-histidine20,21,22. En outre, la toxine B du choléra peut lier un pentasaccharide particulier de ganglioside GM1 dans une monocouche lipidique pour les études structurelles23,24. En ancrant les protéines sur les groupes de tête lipidiques, la monocouche lipidique peut aider à la formation des réseaux 2D qui sont minces pour les études cristallographiques électroniques à haute résolution. La technique de la monocouche lipidique a été utilisée en cristallographie électronique pour des études structurales de protéines, telles que la streptavidine2,25, l’annexine V26, la toxine cholérique27, la sous-unité B e. coli gyraseB 28, l’ARN polymérase E. coli 25,29,30, les protéines de la coquille de carboxysomes31 et les protéines de capside du VIH-132 et du virus de la leucémie murine Moloney 33. En raison de la stabilité et des propriétés chimiques de la monocouche lipidique, différentes applications pour la préparation des échantillons ont été explorées pour l’imagerie cryo-EM34. Cependant, une optimisation sera nécessaire pour la formation de réseaux de protéines.
Ici, nous fournissons des détails détaillés sur la préparation générale des monocouches lipidiques pour l’imagerie cryo-EM et quelques considérations qui pourraient affecter la qualité des monocouches formées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

La cristallographie électronique est un outil puissant pour la détermination de structures à haute résolution. Les macromolécules telles que les protéines solubles ou membranaires peuvent être cultivées en cristaux bidimensionnels (2D) hautement ordonnés dans des conditions favorables. La qualité des cristaux 2D cultivés est cruciale pour la résolution de la reconstruction finale via le traitement d’image 2D. Au fil des ans, les monocouches lipidiques ont été utilisées comme couche de soutien pour favoriser la cristallisation 2D des protéines de la membrane périphérique ainsi que des protéines solubles. Cette méthode peut également être appliquée à la cristallisation 2D de protéines membranaires intégrales, mais nécessite une étude empirique plus approfondie pour déterminer les conditions de détergent et de dialyse afin de favoriser le partage avec la monocouche. Une monocouche lipidique se forme à l’interface air-eau de telle sorte que les groupes de tête lipidique polaire restent hydratés dans la phase aqueuse et que les chaînes acyles non polaires se divisent dans l’air, brisant la tension superficielle et aplatissant la surface de l’eau. La nature chargée ou les fractions chimiques distinctives des groupes de tête fournissent une affinité pour les protéines en solution, favorisant la liaison pour la formation de réseaux 2D. Une monocouche nouvellement formée avec le réseau 2D peut être facilement transférée dans un microscope électronique (EM) sur une grille de cuivre recouverte de carbone utilisée pour soulever et soutenir le réseau cristallin. Dans ce travail, nous décrivons une méthodologie monocouche lipidique pour l’imagerie cryogénique au microscope électronique (cryo-EM).

Une monocouche lipidique déposée sur la grille EM peut être visualisée au microscope électronique à transmission (TEM) sans coloration. La présence de monocouche peut être reconnue par la différence de contraste par rapport à la zone sans aucun spécimen dans la trajectoire du faisceau. Les zones qui ont une couverture monocouche lipidique ont un contraste local plus faible que celles qui n’ont pas de couverture, car le faisceau d’électrons à travers les trous vides n’a pas de diffusion et montre un éc...

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Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Les monocouches lipidiques sont utilisées comme base pour former des cristaux de protéines bidimensionnelles (2D) pour des études structurelles depuis des décennies. Ils sont stables à l’interface air-eau et peuvent servir de matériau de support mince pour l’imagerie électronique. Nous présentons ici les étapes éprouvées de la préparation des monocouches lipidiques pour les études biologiques.

Préparation d’échantillons à l’aide d’une méthode monocouche lipidique pour les études cristallographiques électroniques

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Au fil des ans, les monocouches lipidiques ont été utilisées comme couche de soutien pour favoriser la cristallisation 2D des protéines de la membrane périphérique, ainsi que des protéines solubles. Cette méthode peut également être appliquée à la cristallisation 2D, comme certaines protéines membranaires intégrales. Mais nécessite une étude empirique plus approfondie pour déterminer les conditions de détergent et de dialyse afin de favoriser la partition à la monocouche lipidique.Une monocouche lipidique se forme à l’interface air-eau, de sorte que les groupes de tête polaire du lipide restent hydratés dans la phase aqueuse. Et les queues d’acyle non polaires de la partition lipidique à l’interface air-eau, qui brise la tension superficielle et aplatit la surface de l’eau. La nature de charge, les fractions chimiques distinctives des groupes de tête lipidique fournissent l’affinité pour les protéines en solution.Promouvoir la liaison, et en principe la formation de matrices 2D. Tous les cristaux 2D formés sur une monocouche lipidique peuvent être facilement transférés au microscope électronique sur une grille EM recouverte de carbone qui est utilisée pour soulever et soutenir le réseau cristallin sur la couche lipidique. Nous avons décrit dans ce manuscrit, une méthodologie monocouche lipidique pour l’imagerie par microscopie électronique cryogénique.Préparation monocouche lipidique. Préparation lipidique, préparer un mélange lipidique de 0,01 mg par ml dans du chloroforme 9:1 volume à volume, méthanol. Utilisation de 8,91 ml de chloroforme et de 0,99 ml de méthanol et de 0,1 ml d’une solution lipidique de 10 mg par ml.Préparation de plaques de téflon. Sonicate une plaque de téflon dans un bain de méthanol pendant cinq minutes. Laver à l’eau chaude pendant 15 minutes, puis rincer à l’eau distillée.Sécher la plaque de téflon dans un desséché pendant 30 minutes et la garder sous vide jusqu’à utilisation. Formation de monocouche lipidique sur réservoir tampon. Le temps de fonctionnement estimé sera d’une heure et demie.Placez un papier filtre de type un dans une boîte de Petri et disposez le bloc de téflon sur le dessus du papier filtre. Remplissez les puits de la plaque de téflon avec 60 microlitres de tampon. Ajoutez soigneusement le mélange liquide sur le dessus de la surface tampon goutte par goutte.Idéalement un microlitre par goutte à l’aide d’une seringue Hamilton. Mouillez le papier filtre avec de l’eau distillée et gardez l’humidité dans la boîte de Pétri. Incuber à température ambiante pendant 60 minutes, le chloroforme doit s’évaporer et une monocouche de lipides à la surface des tampons doit être formée.Application d’une grille EM sur une monocouche lipidique. Temps de fonctionnement estimé une heure et demie. Placez doucement une grille EM revêtue de carbone sans lueur déversant du carbone vers le bas sur la surface de chaque réservoir tampon.Injectez soigneusement des protéines dans le puits d’injection latéral, utilisez les concentrations finales de protéines dans le puits autour d’un micromolaire. Incuber 60 minutes à température ambiante. Injecter doucement environ 20 à 30 microlitres de tampon dans l’aisselle d’injection du site pour élever la grille au-dessus de la surface du bloc de téflon.Cela vous permet de ramasser la grille avec une pince à épiler et de la soulever verticalement de la gouttelette. Résultats représentatifs. Une monocouche lipidique déposée sur une grille EM peut être visualisée au microscope électronique à transmission sans coloration de contraste.La présence de monocouche peut être reconnue par la différence de contraste par rapport à la zone sans spécimen dans ce trajet de faisceau. Les zones qui ont une couverture monocouche lipidique ont un contraste plus faible que celles qui n’ont pas de couverture. Étant donné que le faisceau d’électrons à travers les trous vides n’a pas de diffusion, il montre un éclairage plus lumineux.En conclusion, la méthode de la monocouche lipidique offre la possibilité d’étudier les structures protéiques en raison de sa simplicité. Il peut fournir une approche alternative pour faciliter le processus de cristallisation 2D.

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