Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
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Die Vorbereitung dieses Manuskripts wurde teilweise vom US Army Research Office (W911NF2010321) und den Startfonds der Arizona State University für P.-L.C unterstützt.

1. Teflonblock-Zubereitung
<ol><li>Bereiten Sie den Teflonblock aus chemikalienbeständigem PTFE-Harz (Polytetrafluorethylen) vor. Machen Sie Löcher auf dem Block mit einem allgemeinen Bohrer, gefolgt von den in Abbildung 1beschrifteten Abmessungen.</li>
</ol>2. Monolayer-Lipidpräparation
HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 30- 45 Minuten
<ol><li>Lipid-Stoffaufbereitung<ol>
<li>Ein 0,01 mg/ml Lipidgemi...

Eine Lipidmonoschicht ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das das Wachstum großer 2D-Kristalle für Strukturstudien biologischer Makromoleküle erleichtert. Um eine intakte Lipidmonoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche erfolgreich vorzubereiten, wird dringend empfohlen, die Lipide am Tag des Experiments frisch aufzubereiten, da eine Oxidation der Lipid-Acylkette zu einer Packungsstörung in der Monoschicht führen und die resultierende Kristallbildung beeinträchtigen könnte. Gekaufte Lipide in Pulverform sollten mi...

Elektronenbeugung durch 2D-Kristalle oder spiralförmige Arrays von Proteinen können in günstigen Fällen Sub-Nanometer-Auflösungen erreichen1,2,3. Von besonderem Interesse sind rekonstituierte 2D-Membranproteinarrays oder Kristalle in ihren nahezu nativen Umgebungen1. Da ein Kristall als Signalverstärker fungiert, der die Dichte der strukturellen Faktoren bei bestimmten räumlichen Frequenzen erhöht, ermöglicht die Elektronenkristallographie die Sondierung eines Ziels mit einer kleineren Größe bei hohen Auflösungen, z. B. kleinen Molekülen, als bei Einzelpartikel-Kryo-EM. Der Elektronenstrahl kann durch ein geordnetes 2D-Array von Proteinen gebeugt werden, wodurch ein Beugungsmuster oder ein Gitterbild erzeugt wird, je nachdem, wo die Bildebene auf demDetektor aufgezeichnetwird 4 . Die gebeugten Intensitäten können dann extrahiert und verarbeitet werden, um eine 2D-Projektionsstruktur des Kristalls zu rekonstruieren. Elektronen haben einen größeren Streuquerschnitt als Röntgenstrahlen und ihre Streuung folgt größtenteils dem Rutherford-Modell, das auf der Coulomb-Wechselwirkung zwischen den Elektronen und den geladenen Atomen imMolekül basiert 5. Die Dicken von 2D-Membrankristallen betragen in der Regel weniger als 100 nm, geeignet für die Elektronenübertragung ohne dynamische Streuung innerhalb der Probe6. Elektronenkristallographische Studien haben sich als leistungsfähiges Werkzeug erwiesen, um hochauflösende Strukturinformationen von Membranproteinen und Lipid-Protein-Interaktionen zu untersuchen7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Eine Lipidmonoschicht ist eine einzelne Lipidschicht, die aus Phospholipiden besteht, die dicht an einer Luft-Wasser-Grenzfläche6gepackt sind und die 2D-Array-Bildung für lösliche Proteine oder periphere Membranproteine unterstützen können18. Abhängig von der Dichte der Lipide und ihrem lateralen Druck können die Lipidmoleküle ein geordnetes 2D-Array an der Luft-Wasser-Grenzfläche bilden, wobei ihre acylketten auf die Luft ausgedehnt sind und hydrophile Kopfgruppen in der wässrigen Lösung1,6,19freigelegt werden . Die Lipidkopfgruppe kann über elektrostatische Interaktion mit Proteinen interagieren oder modifiziert werden, um ein Affinitäts-Tag bereitzustellen, um eine bestimmte Proteindomäne zu binden. Zum Beispiel wird das DOGS-NTA-Ni (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2-Ni2+ ) häufig bei der Bildung einer Lipidmonoschicht verwendet, um die Proteine mit einem Poly-Histidin-Tag20,21,22zu binden . Auch das Choleratoxin B kann ein bestimmtes Pentasaccharid von Gangliosid GM1 in einer Lipidmonoschicht für Strukturstudienbinden 23,24. Durch die Verankerung der Proteine auf den Lipidkopfgruppen kann die Lipidmonoschicht die Bildung der dünnen 2D-Arrays für hochauflösende elektronenkristallographische Studien unterstützen. Die Lipid-Monolayer-Technik wurde in der Elektronenkristallographie für Strukturstudien von Proteinen wie Streptavidin2,25, Annexin V26, Choleratoxin27, E. coli gyrase B Untereinheit28, E. coli RNA Polymerase25,29,30, Carboxysomenschalenproteine31 und die Kapsidproteine des HIV-132 und Moloney murinen Leukämievirus verwendet 33. Aufgrund der Stabilität und chemischen Eigenschaften der Lipidmonoschicht wurden verschiedene Anwendungen für die Probenvorbereitung für die Kryo-EM-Bildgebung untersucht34. Für die Bildung von Protein-Arrays ist jedoch eine Optimierung erforderlich.
Hier geben wir ausführliche Details zur allgemeinen Herstellung von Lipidmonoschichten für die Kryo-EM-Bildgebung und einige Überlegungen, die die Qualität der gebildeten Monoschichten beeinflussen könnten.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

Die Elektronenkristallographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur hochauflösenden Strukturbestimmung. Makromoleküle wie lösliche oder Membranproteine können unter günstigen Bedingungen zu hochgeordneten zweidimensionalen (2D) Kristallen gezüchtet werden. Die Qualität der gezüchteten 2D-Kristalle ist entscheidend für die Auflösung der finalen Rekonstruktion mittels 2D-Bildverarbeitung. Im Laufe der Jahre wurden Lipidmonoschichten als unterstützende Schicht verwendet, um die 2D-Kristallisation von peripheren Membranproteinen sowie löslichen Proteinen zu fördern. Diese Methode kann auch auf die 2D-Kristallisation integraler Membranproteine angewendet werden, erfordert jedoch umfangreichere empirische Untersuchungen, um Waschmittel- und Dialysebedingungen zu bestimmen, um die Aufteilung auf die Monoschicht zu fördern. An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich eine Lipidmonoschicht, so dass die polaren Lipidkopfgruppen in der wässrigen Phase hydratisiert bleiben und die unpolaren Acylketten, Schwänze sich in die Luft aufteilen, die Oberflächenspannung brechen und die Wasseroberfläche abflachen. Die geladene Natur oder die charakteristischen chemischen Bestandteile der Kopfgruppen bieten eine Affinität für Proteine in Lösung und fördern die Bindung für die Bildung von 2D-Arrays. Eine neu gebildete Monoschicht mit dem 2D-Array kann leicht in ein Elektronenmikroskop (EM) auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter übertragen werden, das zum Heben und Unterstützen des kristallinen Arrays verwendet wird. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Lipid-Monolayer-Methodik für die kryogene elektronenmikroskopische (Kryo-EM) Bildgebung.

Eine auf dem EM-Gitter abgeschiedene Lipidmonoschicht kann unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ohne Färbung visualisiert werden. Die Monoschichtpräsenz ist an der Kontrastdifferenz zur Fläche ohne Probe im Strahlengang zu erkennen. Bereiche mit Lipid-Monolayer-Abdeckung haben einen geringeren lokalen Kontrast als solche ohne Abdeckung, da der Elektronenstrahl durch die leeren Löcher keine Streuung aufweist und eine hellere Beleuchtung zeigt (Abbildung 3).
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Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Im Laufe der Jahre wurden Lipidmonoschichten als Stützschicht verwendet, um die 2D-Kristallisation von peripheren Membranproteinen sowie löslichen Proteinen zu fördern. Diese Methode kann auch auf die 2D-Kristallisation angewendet werden, wie einige integrale Membranproteine. Erfordert jedoch umfangreichere empirische Untersuchungen zur Bestimmung der Waschmittel- und Dialysebedingungen, um die Partitionierung in die Lipidmonoschicht zu fördern.An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich eine Lipid-Monoschicht, so dass die polaren Kopfgruppen des Lipids in der wässrigen Phase hydratisiert bleiben. Und die unpolaren Acylschwänze der Lipidverteilung zur Luft-Wasser-Grenzfläche, die die Oberflächenspannung bricht und die Wasseroberfläche abflacht. Die Ladungsnatur die charakteristischen chemischen Anteile der Lipidkopfgruppen liefern die Affinität für Proteine in Lösung.Förderung der Bindung und im Prinzip der 2D-Array-Bildung. Alle 2D-Kristalle, die auf einer Lipidmonoschicht gebildet werden, können leicht in das Elektronenmikroskop auf einem kohlenstoffbeschichteten EM-Gitter übertragen werden, das zum Anheben und Unterstützen des kristallinen Arrays auf der Lipidschicht verwendet wird. Wir haben in diesem Manuskript eine Lipid-Monolayer-Methodik für die kryogene Elektronenmikroskopie-Bildgebung beschrieben.Lipid-Monolayer-Vorbereitung. Lipidstockzubereitung, herstellung einer Lipidmischung von 0,01 mg pro ml in 9:1 Volumen zu Volumen Chloroform, Methanol. Unter Verwendung von 8,91 ml Chloroform und 0,99 ml Methanol und 0,1 ml einer Lipidlösung von 10 mg pro ml.Zubereitung von Teflonplatten. Beschallen Sie eine Teflonplatte in einem Methanolbad für fünf Minuten. Mit heißem Wasser für 15 Minuten waschen und dann mit destilliertem Wasser abspülen.Trocknen Sie die Teflonplatte in einer getrockneten 30 Minuten und bewahren Sie sie bis zum Gebrauch unter Vakuum auf. Bildung von Lipid-Monoschicht auf Pufferreservoir. Die geschätzte Betriebszeit beträgt eineinhalb Stunden.Legen Sie ein Filterpapier vom Typ eins in eine Petrischale und ordnen Sie den Teflonblock auf dem Filterpapier an. Füllen Sie die Vertiefungen der Teflonplatte mit 60 Mikrolitern Puffer. Fügen Sie vorsichtig flüssigkeitsmischung auf die Pufferoberfläche Tropfen für Tropfen hinzu.Idealerweise ein Mikroliter pro Tropfen mit einer Hamilton-Spritze. Befeuchten Sie das Filterpapier mit destilliertem Wasser und halten Sie die Feuchtigkeit in der Petrischale. Bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubieren, das Chloroform sollte verdampfen und eine Monoschicht aus Lipid auf der Oberfläche der Puffer gebildet werden.Auftragen eines EM-Gitters auf eine Lipid-Monoschicht. Geschätzte Betriebszeit eineinhalb Stunden. Platzieren Sie vorsichtig ein kohlenstoffbeschichtetes EM-Gitter ohne Glühen, das Kohlenstoff von der Seite nach unten auf die Oberfläche jedes Pufferbehälters ableitet.Injizieren Sie vorsichtig Proteine in den seitlichen Injektionsbrunnen, verwenden Sie die endgültigen Proteinkonzentrationen in der Vertiefung um ein Mikromolar. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Injizieren Sie vorsichtig etwa 20 bis 30 Mikroliter Puffer in den Injektionsanschluss der Stelle, um das Gitter über die Oberfläche des Teflonblocks anzuheben.Auf diese Weise können Sie das Gitter mit einer Pinzette aufnehmen und vertikal vom Tropfen abheben. Repräsentative Ergebnisse. Eine auf einem EM-Gitter abgeschiedene Lipidmonoschicht kann unter dem Transmissionselektronenmikroskop ohne Kontrastfärbung sichtbar gemacht werden.Das Vorhandensein von Monoschichten kann an der Kontrastdifferenz zu dem Bereich ohne Probe in diesem Strahlengang erkannt werden. Bereiche mit Lipid-Monolayer-Abdeckung haben einen geringeren Kontrast als Bereiche ohne Abdeckung. Da der Elektronenstrahl durch die leeren Löcher keine Streuung aufweist, zeigt er eine hellere Beleuchtung.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Lipid-Monolayer-Methode aufgrund ihrer Einfachheit die Möglichkeit bietet, Proteinstrukturen zu untersuchen. Es kann einen alternativen Ansatz bieten, um den Prozess der 2D-Kristallisation zu erleichtern.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Eine Plasma-Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie mit einer automatisierten Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow und Tools für das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Herstellung von Probenträgerfilmen in der Transmissionselektronenmikroskopie mit einem Stütz-Floatationsblock

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-scale Multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): Richtlinien für die Probenvorbereitung und Normalisierung

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...