Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

הכנת כתב יד זה נתמכה חלקית על ידי משרד המחקר של צבא ארה"ב (W911NF2010321) וקרנות ההפעלה של אוניברסיטת אריזונה ל- P.-L.C.

1. הכנת בלוק טפלון
<ol><li>הכן את בלוק הטפלון משרף PTFE עמיד לכימיקלים (פוליטרפלואורואתילן). בצעו חורים בבלוק באמצעות תרגיל כללי ואחריו הממדים המסומנים באיור 1.</li>
</ol>2. הכנת שומנים חד-שכבתיים
הערה: זמן פעולה משוער: 30- 45 דקות
<ol><li>הכנת...

monolayer שומנים הוא כלי רב עוצמה המאפשר את הצמיחה של גבישים 2D גדולים למחקרים מבניים של macromolecules ביולוגי. כדי להכין בהצלחה monolayer שומנים שלם בממשק מי האוויר, מומלץ מאוד כי השומנים מוכנים טרי ביום הניסוי, כי חמצון של שרשרת סיל השומנים יכול להוביל שיבוש אריזה monolayer להשפיע לרעה על היווצרות הגביש המת?...

עקיפה אלקטרונית באמצעות גבישים דו-ממדיים או מערכים שליים של חלבונים יכולה להשיג רזולוציות תת-ננומטר במקרים חיוביים1,2,3. עניין מיוחד הם reconsuted 2D קרום חלבונים מערכים או גבישים בסביבות הקרובות שלהם1. מכיוון שמגבר אות פועל כמגבר אותות המגביר את עוצמות הגורמים המבניים בתדרים מרחביים ספציפיים, קריסטלוגרפיה אלקטרונית מאפשרת לבחן מטרה בגודל קטן יותר ברזולוציות גבוהות, כגון מולקולות קטנות, מאשר אלה של קריו-EM של חלקיק יחיד. קרן האלקטרונים יכולה להיות מפוזרת על ידי מערך דו-ממדי מסודר של חלבונים, יצירת תבנית עקיפה או תמונת סריג בהתאם למקום שבו מישור התמונה נרשם בגלאי4. לאחר מכן ניתן לחלץ ולעבד את עוצמות ההקרנה הדו-ממדיות כדי לשחזר מבנה הקרנה דו-ממדי של הגביש. אלקטרונים יש חתך פיזור גדול יותר מאשר צילומי רנטגן ופיזורו בעיקר בעקבות מודל רתרפורד המבוסס על אינטראקציית קולון בין האלקטרונים לבין האטומים הטעונים במולקולה5. העוביים של גבישי ממברנה 2D הם בדרך כלל פחות מ 100 ננומטר, מתאים להעברת אלקטרונים ללא פיזור דינמי המתרחש בתוך דגימה6. מחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים הוכחו ככלי רב עוצמה לחקור מידע מבני ברזולוציה גבוהה של חלבוני ממברנה ואינטראקציות חלבון שומנים7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
חד-שכבתית היא שכבה אחת של שומנים המורכבת מפוספוליפידים ארוזים בצפיפות בממשק מי אוויר6, אשר יכול לסייע היווצרות מערך 2D עבור חלבונים מסיסים או חלבונים ממברנה היקפית18. בהתאם לצפיפות השומנים והלחץ הרוחב שלהם, מולקולות השומנים יכולות ליצור מערך 2D מסודר בממשק מי האוויר עם שרשראות האציל שלהם המורחבות לאוויר וקבוצות ראש הידרופיליות שנחשפו בתמיסה מימית1,6,19. קבוצת הראש של השומנים יכולה לקיים אינטראקציה עם חלבונים באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית או שניתן לשנות אותה כדי לספק תג זיקה כדי לקשור תחום חלבון מסוים. לדוגמה, כלבים-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-גלייצרו-3-[(N-(5-אמינו-1-קרבוקסיפנטיל)חומצה ימינודיקטית)סוצ'יניל]2- Ni2+) משמש לעתים קרובות ליצירת מונולייר שומנים כדי לקשור את החלבונים עם תג פולי-היסטידין20,21,22. כמו כן, רעלן כולרה B יכול לקשור פנטסקכריד מסוים של ganglioside GM1 ב monolayer שומנים למחקרים מבניים23,24. על ידי עיגון החלבונים על קבוצות הראש של השומנים, monolayer השומנים יכול לסייע בהיווצרות של מערכים 2D כי הם דקים עבור מחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. טכניקת חד שכבתית השומנים שימשה בקריסטלוגרפיה אלקטרונית למחקרים מבניים של חלבונים, כגון סטרפטאבידין2,25, annexin V26, רעלן כולרה27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA פולימראז25,29,30, חלבוני קליפה קרבוקסיתום31 וחלבוני קבסיד של נגיף ה- HIV-1 1 32 ומולוני מורין לוקמיה 33.בשל היציבות והרכוש הכימי של monolayer השומנים, יישומים שונים להכנת מדגם נחקרו עבור הדמיה cryo-EM34. עם זאת, יהיה צורך באופטימיזציה להיווצרות מערך חלבונים.
כאן, אנו מספקים פרטים נרחבים על ההכנה הכללית של monolayers השומנים עבור הדמיה cryo-EM וכמה שיקולים שיכולים להשפיע על איכות monolayers שנוצר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

קריסטלוגרפיה אלקטרונית היא כלי רב עוצמה לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה. מקרומולקולים כגון חלבונים מסיסים או ממברנה ניתן לגדל גבישים דו ממדיים מסודרים מאוד (2D) בתנאים נוחים. איכות הגבישים הדו-מימדיים הגדלים חיונית לרזולוציה של השחזור הסופי באמצעות עיבוד תמונה דו-מימדית. במהלך השנים, monolayers השומנים שימשו שכבה תומכת כדי לטפח את התגבשות 2D של חלבונים ממברנה היקפית, כמו גם חלבונים מסיסים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על התגבשות דו-צדדית של חלבונים ממברנה אינטגרליים, אך דורשת חקירה אמפירית נרחבת יותר כדי לקבוע תנאי דטרגנט ודיאליזה כדי לקדם חלוקה למונו-שכבתית. מונולייר שומנים נוצר בממשק מי האוויר כך שקבוצות ראש השומנים הקוטביות נשארות לחות בשלב מימי ושרשראות אציל שאינן קוטביות, זנבות המחיצות לאוויר, שוברות את מתח פני השטח ומשתחות את פני המים. הטבע הטעון או moieties כימי ייחודי של קבוצות הראש לספק זיקה חלבונים בתמיסה, קידום כריכה להיווצרות מערך 2D. ניתן להעביר בקלות מנובייה חדשים עם מערך דו-ממדי למיקרוסקופ אלקטרונים (EM) על רשת נחושת מצופה פחמן המשמשת להרמה ותמיכה במערך הגבישי. בעבודה זו, אנו מתארים מתודולוגיית חד שכבתית שומנים עבור הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM).

ניתן לדמיין מפיל שומנים המופקדים ברשת ה-EM תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) ללא כתמים. נוכחות monolayer ניתן לזהות על ידי ההבדל בניגוד מהאזור ללא כל דגימה בנתיב הקרן. אזורים בעלי כיסוי חד-שכבתי של שומנים יש ניגודיות מקומית נמוכה יותר מאלה ללא כיסוי, שכן קרן האלקטרונים דרך החורים הריקים אין פיזו...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

שומנים חד-שכבתיים שימשו כבסיס ליצירת גבישי חלבון דו-ממדיים (דו-ממדיים) למחקרים מבניים במשך עשרות שנים. הם יציבים בממשק מי האוויר ויכולים לשמש כחומר תומך דק להדמיית אלקטרונים. כאן אנו מציגים את הצעדים המוכחים על הכנת monolayers השומנים למחקרים ביולוגיים.

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

במהלך השנים, Monolayers השומנים שימשו שכבה תומכת כדי לטפח את התגבשות 2D של חלבונים ממברנה היקפית, כמו גם חלבונים מסיסים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על התגבשות 2D, כמו כמה חלבונים ממברנה אינטגרלי. אבל דורש חקירה אמפירית נרחבת יותר כדי לקבוע תנאי דטרגנט ודיאליזה כדי לקדם חלוקה למונולייטר השומנים.מונולייר שומנים נוצר בממשק מי האוויר, כך קבוצות הראש הקוטבי של השומנים להישאר hydrated בשלב מימי. וזנבות האציל הלא קוטביים של מחיצת השומנים לממשק מי האוויר, אשר שובר את מתח פני השטח ומשטח את פני המים. אופי המטען של moieties כימי ייחודי של קבוצות ראש השומנים לספק את הזיקה לחלבונים בתמיסה.קידום כריכה, ובאופן עקרוני מערך 2D. כל גבישי 2D שנוצרו על monolayer שומנים ניתן להעביר בקלות לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים על רשת EM מצופה פחמן המשמש להרים ולתמוך במערך גבישי על שכבת השומנים. תיארנו בכתב היד הזה, מתודולוגיית חד-שכבתית שומנית להדמיית מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית.הכנת חד-שכבתית שומנים. הכנת מלאי השומנים, להכין 0.01 מ"ג לתערובת שומנים מ"ל בנפח 9:1 כדי נפח כלורופורם, מתנול. שימוש 8.91 מ"ל של כלורופורם ו 0.99 מ"ל של מתנול ו 0.1 מיליליטר של 10 מ"ג לכל תמיסת שומנים מ"ל.הכנת צלחת טפלון. סוניקאט צלחת טפלון באמבט מתנול במשך חמש דקות. לשטוף עם מים חמים במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים.מייבשים את צלחת הטפלון במיובש במשך 30 דקות ושומרים אותה תחת ואקום עד לשימוש. היווצרות של חד שכבתית שומנים על מאגר חיץ. זמן הפעולה המשוער יהיה שעה וחצי.מניחים נייר סינון מסוג אחד בצלחת פטרי ומסדרים את בלוק הטפלון על גבי נייר המסנן. מלאו את בארות צלחת הטפלון ב-60 מיקרוליטרים של חוצץ. מוסיפים בזהירות תערובת נוזלית על גבי משטח המאגר טיפה אחר טיפה.באופן אידיאלי מיקרוליטר אחד לכל טיפה באמצעות מזרק המילטון. מרטיבים את נייר הסינון במים מזוקקים ושומרים על לחות בצלחת הפטרי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות, כלורופורם צריך להתאדות ו monolayer של שומנים על פני השטח של המאגרים צריך להיווצר.יישום של רשת EM על monolayer שומנים. זמן פעולה משוער שעה וחצי. הניחו בעדינות רשת EM מצופה פחמן מבלי שזוהר משחרר את צד הפחמן כלפי מטה על פני השטח של כל מאגר חיץ.בזהירות להזריק חלבונים לתוך הזרקת הצד היטב, להשתמש בריכוזים חלבון סופי בבאר סביב micromolar אחד. לדגור 60 דקות בטמפרטורת החדר. הזריקו בעדינות כ-20 עד 30 מיקרוליטרים של חוצץ ביציאת הזרקת האתר כדי להעלות את הרשת מעל פני השטח של בלוק הטפלון.זה מאפשר לך להרים את הרשת עם זוג פינצטה ולהרים אותו אנכית את טיפה. תוצאות מייצגות. ניתן לדמיין מנמולר שומנים המופקד על רשת EM תחת מיקרוסקופ אלקטרונים השידור ללא כתמי ניגודיות.ניתן לזהות את נוכחות השונאי, על ידי הבדל הניגודיות מהאזור ללא כל דגימה בנתיב הקרן. אזורים בעלי כיסוי חד-שכבתי עם שומנים יש ניגודיות נמוכה יותר מאשר אלה ללא כיסוי. מכיוון שלקרן האלקטרונים דרך החורים הריקים אין פיזור, היא מראה תאורה בהירה יותר.לסיכום, שיטת monolayer השומנים מציעה הזדמנות ללמוד מבני חלבון בשל הפשטות שלה. זה עשוי לספק גישה חלופית כדי להקל על התהליך של התגבשות 2D.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

הכנת סרטי תמיכה לדוגמה במיקרוסקופיית אלקטרונים שידור באמצעות בלוק הצפה תומך

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

מחקרי אסוציאציה רב-גנומית בקנה מידה גדול (Mo-GWAS): קווים מנחים להכנת דגימות ונורמליזציה

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...