Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
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この原稿の作成は、部分的に米国陸軍研究事務所(W911NF2010321)とアリゾナ州立大学のスタートアップ資金P.-L.Cに支援されました。

1. テフロンブロックの準備
<ol><li>耐薬品性PTFE(ポリテトラフルオロエチレン)樹脂からテフロンブロックを調製します。一般的なドリルを使用してブロックに穴を開け、その後に 図 1に示した寸法を使用します。</li>
</ol>2. 単層脂質製剤
注:推定動作時間:30〜45分
<ol><li>脂質ストック調製<ol>
<li>0.01 mg/mL 脂?...

脂質単層は、生体高分子の構造研究のための大きな2D結晶の成長を促進する強力なツールです。空気と水の界面で無傷の脂質単層を作製するには、実験当日に脂質を新たに調製することを強く推奨します。粉末形態で購入した脂質は、リン脂質35を溶解するために一般的に使用されるクロロホルム:メタノール溶媒の混合物を使用して溶解する必要があります。クロロホルム:?...

2D結晶またはタンパク質のヘリカルアレイを介した電子回折は、好ましい症例1、2、3においてサブナノメートル分解能を達成することができる。特に興味深いのは、2D膜タンパク質アレイまたは結晶をほぼネイティブ環境で再構成する1.結晶は特定の空間周波数での構造因子の強度を高める信号増幅器として機能するため、電子結晶学は、単粒子クライオEMよりも小分子などの高解像度で小さいサイズのターゲットを探査することを可能にします。電子ビームは、順序付けられた2Dアレイのタンパク質によって回折することができ、画像面が検出器4に記録される場所に応じて回折パターンまたは格子画像を生成する。回折強度を抽出し、結晶の2D投影構造を再構築するために処理することができます。電子はX線よりも大きな散乱断面を有し、その散乱は主に分子5内の電子と荷電原子とのクーロン相互作用に基づくラザフォードモデルに従う。2D膜結晶の厚さは、通常100nm未満であり、試料6内で動的散乱が起きることなく電子透過に適している。電子結晶学的研究は、膜タンパク質および脂質タンパク質相互作用の高分解能構造情報を7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17に対して強力なツールとして得ることを示している。
脂質単層は、空気水界面6で密に詰められたリン脂質からなる1つの脂質層であり、可溶性タンパク質または末梢膜タンパク質18に対する2Dアレイ形成を補助することができる。脂質の密度とそれらの横圧に応じて、脂質分子は、水溶液1、6、19に露出したアシル鎖および親水性ヘッドグループに拡張された空気と水界面に秩序ある2Dアレイを形成することができる。脂質ヘッドグループは、静電相互作用を介してタンパク質と相互作用することができ、または特定のタンパク質ドメインに結合する親和性タグを提供するように改変することができる。例えば、DOGS-NTA-Ni(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸)2-Ni2+]は、ポリヒスチジンタグ20、21、22でタンパク質を結合する脂質単層を形成する際によく使用される。また、コレラ毒素Bは、構造研究23,24のための脂質単層にガングリオシドGM1の特定の五糖類を結合することができる。脂質のヘッドグループにタンパク質を固定することにより、脂質単層は、高解像度の電子結晶学的研究のために薄い2Dアレイの形成を支援することができます。脂質単層法は、ストレプトアビジン2、25、アネキシンV26、コレラ毒素27、大腸菌ジラーゼBサブユニット28、大腸菌RNAポリメラーゼ25、29、30、カルボキシ性シェルタンパク質31およびHIV-12血糖血症のタンパク質の構造研究のために電子結晶学に使用されてきた33.脂質単層の安定性と化学的性質のために、サンプル調製のための異なる用途がクライオEMイメージング34のために検討されている。しかし、タンパク質アレイ形成には最適化が必要です。
ここでは、クライオEMイメージングのための脂質単層の一般的な調製の詳細と、形成された単層の品質に影響を与える可能性のあるいくつかの考慮事項を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

電子結晶学は、高解像度の構造決定のための強力なツールです。可溶性または膜タンパク質などの高分子は、好条件下で高度に順序付けられた二次元(2D)結晶に成長させることができます。成長した2D結晶の品質は、2D画像処理による最終的な再構成の分解能にとって非常に重要です。脂質単層は、末梢膜タンパク質や可溶性タンパク質の2D結晶化を促進する支持層として長年にわたり使用されてきました。この方法は、一体膜タンパク質の2D結晶化にも適用できますが、単層への仕切りを促進するために洗剤および透析条件を決定するために、より広範な経験調査が必要です。脂質単層は、水相および非極性のアシル鎖、尾部が空気中に仕切り、表面張力を破り、水面を平らにするような、空気水界面に形成される脂質一層である。頭部群の荷電性または特徴的な化学部分は、溶液中のタンパク質に親和性を提供し、2Dアレイ形成のための結合を促進する。2Dアレイを備えた新しく形成された単層は、結晶アレイを持ち上げて支持するために使用されるカーボンコート銅格子上の電子顕微鏡(EM)に容易に移動することができる。本研究では、極低温電子顕微鏡(クライオ-EM)イメージングのための脂質単層法学的方法論を説明する。

EMグリッド上に堆積した脂質単層は、染色せずに透過型電子顕微鏡(TEM)下で可視化することができる。この単層存在は、ビーム経路に標本を含まない領域とのコントラスト差によって認識することができる。脂質単層被覆率の領域は、空のホールを通る電子ビームは散乱がなく、明るい照明を示すため、カバレッジのない領域よりも局所的なコントラストが低い(図3)。</p...

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Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

脂質単層は、構造研究のための2次元(2D)タンパク質結晶を形成するための基礎として何十年も使用されてきました。それらは空気水の界面で安定しており、電子のイメージ投射のための薄い支持材料として役立つことができる。ここでは、生物学的研究のための脂質単層を調製するための実証済みのステップを紹介します。

電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

脂質単層は、末梢膜タンパク質の2D結晶化を促進する支持層として、そして可溶性タンパク質として長年にわたって使用されてきました。この方法は、いくつかの一体性膜タンパク質として、2D結晶化にも適用することができる。しかし、脂質単層への分割を促進するために、洗剤および透析条件を決定するために、より広範な経験調査が必要です。空気水界面に脂質単層が形成され、脂質の極性ヘッド基が水相で水和したままとなるようである。そして、空気水界面への脂質仕切りの非極性アシルテールは、表面張力を破り、水面を平らにします。脂質ヘッド基の特徴的な化学部分が電荷性質により、溶液中のタンパク質に対する親和性を提供します。結合を促進し、原則として2Dアレイ形成を行う。脂質単層上に形成された任意の2D結晶は、脂質層上の結晶アレイを持ち上げ、支持するために使用される炭素被覆EMグリッド上の電子顕微鏡に容易に移すことができる。この原稿では、極低温電子顕微鏡イメージングのための脂質単層方法論について述べた。脂質単層製剤。脂質ストック調製物は、1ml当たり0.01mgを、クロロホルム、メタノールの体積に9:1体積で調製する。8.91 mlのクロロホルムと0.99 mlのメタノールと0.1 mlの1mlの脂質溶液を使用した。テフロンプレート調製。メタノールバスでテフロンプレートを5分間超音波処理します。お湯で15分洗い、蒸留水で洗い流します。テフロンプレートを乾燥させて30分間乾燥させ、使用するまで真空状態に保ちます。緩衝槽上の脂質単層の形成推定運転時間は1時間半です。ペトリ皿にタイプ1のフィルターペーパーを入れ、濾紙の上にテフロンブロックを並べます。テフロンプレートのウェルに60マイクロリットルのバッファーを充填します。慎重にバッファー表面のドロップの上に液体混合物を追加します。理想的には、ハミルトンシリンジを使用して1滴あたり1マイクロリットル。フィルターペーパーを蒸留水で濡らし、ペトリ皿の湿度を保ちます。室温で60分間インキュベートすると、クロロホルムが蒸発し、バッファーの表面に脂質の単層が形成されるべきである。脂質単層上のEMグリッドの適用推定運転時間 1 時間半。各バッファーリザーバーの表面にカーボンサイドを排出するグローなしで、カーボンコーティングされたEMグリッドを穏やかに配置します。慎重にサイド注入によくタンパク質を注入し、1つのマイクロモルの周りのウェルで最終的なタンパク質濃度を使用します。室温で60分インキュベートします。約 20 ~ 30 マイクロリットルのバッファーをサイト注入ポートに静かに注入し、グリッドを Teflon ブロックの表面の上に上げます。これにより、ピンセットでグリッドを拾い上げ、液滴から垂直に持ち上げます。代表結果。EMグリッド上に堆積した脂質単層は、コントラスト染色を行うことなく透過型電子顕微鏡下で可視化することができます。この単層存在は、そのビーム経路に標本を含まない領域とのコントラスト差によって認識することができる。脂質単層被覆率を有する領域は、カバレッジのない領域よりもコントラストが低い。空の穴を通る電子ビームは散乱しないため、明るい照明を示します。結論として、脂質単層法は、その単純性のためにタンパク質構造を研究する機会を提供する。2D結晶化のプロセスを容易にする代替アプローチを提供してもよい。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

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Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

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Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

自動ワークステーションを用いた質量分析のためのプラズマサンプル調製

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Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

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A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

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The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

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支持浮遊ブロックを用いた透過電子顕微鏡におけるサンプル支持膜の作製

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

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大規模マルチオミクスゲノムワイド関連研究(Mo-GWAS):サンプル調製と正規化のためのガイドライン

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Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

クライオ電子顕微鏡用高温サンプルグリッドの作製

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...