Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
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이 원고의 준비는 부분적으로 P.-L.C에 미 육군 연구 실 (W911NF2010321)과 애리조나 주립 대학 시작 기금에 의해 지원되었다.

1. 테플론 블록 준비
<ol><li>화학성 PTFE(폴리테트라플루오로로틸렌) 수지로부터 테플론 블록을 준비합니다. 일반 드릴을 사용하여 블록에 구멍을 만들고 그림 1에표시된 치수를 만듭니다.</li>
</ol>2. 모노레이어 지질 제제
참고: 예상 작동 시간: 30-45분
<ol><li>지질 재고 준비<ol>
<li>9:1 (v/v) 클로로폼/메탄올에 0.01 ...

지질 단층은 생물학적 거대 분자의 구조 연구를 위한 대형 2D 결정의 성장을 용이하게 하는 강력한 도구입니다. 공기-물 인터페이스에서 온전한 지질 단층층을 성공적으로 준비하기 위해 지질 아실 체인의 산화가 단층의 포장 중단으로 이어질 수 있고 그로 인한 결정 형성에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 실험 당일에 지질을 신선하게 준비하는 것이 좋습니다. 분말 형태로 구입한 지질은 일반적?...

2D 결정 또는 단백질의 헬릭 어레이를 통한 전자 회절은 유리한 경우1,2,3에서하위 나노미터 분해능을 달성할 수 있다. 특히 관심은 근원 환경1에서2D 멤브레인 단백질 어레이 또는 결정으로 재구성된다. 결정은 특정 공간 주파수에서 구조 적 인자의 강도를 향상시키는 신호 증폭기역할을하기 때문에, 전자 결정학은 단일 입자 저온-EM에 대한 것보다 작은 분자와 같은 고해상도에서 더 작은 크기로 대상을 프로빙 할 수 있습니다. 전자 빔은 주문된 2D 단백질 배열에 의해 확산될 수 있으며, 검출기4에이미지 평면이 기록되는 위치에 따라 회절 패턴 또는 격자 이미지를 생성한다. 그 때 디질화 된 강도는 추출 및 크리스탈의 2D 프로젝션 구조를 재구성하기 위해 처리 될 수있다. 전자는 엑스레이보다 더 큰 산란 단면을 가지며, 그 산란은 주로 분자5에서전자와 충전된 원자 사이의 쿨롬 상호 작용을 기반으로 하는 러더포드 모델을 따릅니다. 2D 멤브레인 결정의 두께는 일반적으로 100 nm 미만이며, 표본6내에서 발생하는 동적 산란없이 전자 전송에 적합합니다. 전자 결정학적 연구는 멤브레인 단백질및 지질 단백질 상호작용7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17의고해상도 구조 정보를 조사하는 강력한 도구로 나타났다.
지질 단층은 공기-물 인터페이스6에서조밀하게 포장된 인지질으로 구성된 단일 지질 층으로, 용해성 단백질 또는 말초막단백질(18)에대한 2D 어레이 형성을 지원할 수 있다. 지질의 밀도와 측면 압력에 따라 지질 분자는 수성 용액1,6,19에노출된 공기 및 친수성 헤드그룹에 확장된 아실 사슬을 사용하여 공기-물 인터페이스에 정렬된 2D 어레이를 형성할 수 있다. 지질 헤드그룹은 정전기 상호작용을 통해 단백질과 상호작용할 수 있거나 특정 단백질 도메인을 결합하기 위한 친화성 태그를 제공하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카박스티펜틸)이 iminodiacetic acid]]2-Ni 2+)는폴리-히티딘 태그20,21로단백질을 묶는 지질 단층층을 형성하는 데 자주 사용된다. 또한, 콜레라 독소 B는 구조적 연구를 위한 지질 단층에서 간질산 GM1의 특정 펜타카라이드를 결합할 수있다(23,24). 지질 헤드그룹에 단백질을 고정함으로써 지질 단층은 고해상도 전자 결정연구를 위해 얇은 2D 어레이의 형성을 지원할 수 있습니다. 지질 단층 기술은 단백질의 구조 연구를 위한 전자 결정학에서 사용되었습니다, 예를 들어 스트렙타비딘2,25,부속서 V26,콜레라 독소27, 대장균 RNA 폴리머라제25,29,30,카박스형 쉘 단백질31 및 HIV-132 및 몰론 황두균 바이러스의 캡시드 단백질 33.지질 단층의 안정성 과 화학적 특성으로 인해, 시료 준비를 위한 다른 응용 분야는 극저온-EM이미징(34)에대해 탐구되었다. 그러나, 단백질 어레이 형성을 위해 최적화가 필요합니다.
여기에서, 우리는 극저온-EM 화상 진찰을 위한 지질 단층의 일반적인 준비의 광대한 세부 사항 및 형성된 단층의 질에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 고려사항을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

전자 결정학은 고해상도 구조 측정을 위한 강력한 도구입니다. 수용성 또는 막 단백질과 같은 거대 분자는 유리한 조건하에서 고도로 정렬된 2차원(2D) 결정으로 재배될 수 있다. 2D 이미지 처리를 통해 최종 재구성의 해상도에 성장된 2D 결정의 품질은 매우 중요합니다. 수년에 걸쳐, 지질 단층은 용해성 단백질뿐만 아니라 말초 막 단백질의 2D 결정화를 촉진하기 위해 지원 층으로 사용되었습니다. 이 방법은 또한 일체형 막 단백질의 2D 결정화에 적용될 수 있지만 단층으로 분할을 촉진하기 위해 세제 및 투석 조건을 결정하기 위해 보다 광범위한 경험적 조사가 필요합니다. 지질 단층은 극지 지질 헤드 그룹이 수성 상에서 수분을 유지하고 비 극성, 아실 체인, 꼬리 분할을 공기로 분할하여 표면 장력을 깨고 수면을 평평하게 하는 공기-물 인터페이스에서 형성됩니다. 헤드 그룹의 충전 된 자연 또는 독특한 화학 적 moieties는 용액의 단백질에 대한 친화력을 제공하여 2D 어레이 형성에 대한 결합을 촉진합니다. 2D 어레이를 가진 새로 형성된 단층은 결정 배열을 들어 올리고 지원하는 데 사용되는 탄소 코팅 구리 그리드에서 전자 현미경(EM)으로 쉽게 이송될 수 있다. 이 작품에서, 우리는 극저온 전자 현미경 (극저온-EM) 화상 진찰을 위한 지질 단층 방법론을 기술합니다.

EM 그리드에 증착된 지질 단층은 염색없이 전송 전자 현미경(TEM)으로 시각화될 수 있다. 단층의 존재는 빔 경로에 시편이 없는 영역과 의대조 차이로 인식될 수 있다. 지질 단층 커버리지가 있는 영역은 비어 있는 구멍을 통해 전자 빔이 산란되지 않고 더 밝은조명(도 3)을나타내기 때문에 커버리지가 없는 영역보다 국부적 대비가 낮습니다.
2D 단층 결정?...

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Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

수년에 걸쳐 지질 단층은 용해성 단백질뿐만 아니라 말초 막 단백질의 2D 결정화를 촉진하기 위한 지지 층으로 사용되어 왔습니다. 이 방법은 또한 2D 결정화에 적용될 수 있습니다, 몇몇 일체형 막 단백질로. 그러나 지질 단층으로 분할을 촉진하기 위해 세제 및 투석 조건을 결정하기 위해 보다 광범위한 경험적 조사가 필요합니다.지질 단층은 공기 물 인터페이스에서 형성되어 지질의 극지 헤드 그룹이 수성 상에서 수분을 유지합니다. 그리고 지질 분할의 비 극성 아실 꼬리는 공기 물 인터페이스에, 이는 표면 장력을 깨고 물 표면을 평평하게. 전하 자연 지질 헤드 그룹의 독특한 화학 적 moieties 용액단백질에 대 한 친화성을 제공 합니다.바인딩을 촉진하고 원칙적으로 2D 어레이 형성을 촉진합니다. 지질 단층상상에 형성된 모든 2D 결정은 지질 층의 결정 배열을 들어 올리고 지원하는 데 사용되는 탄소 코팅 된 EM 그리드에서 전자 현미경으로 쉽게 전달 될 수 있습니다. 우리는 극저온 전자 현미경 현미경 화상 진찰을 위한 지질 단층 방법론, 이 원고에서 기술했습니다.지질 단층 준비. 지질 재고 제제는 9:1 부피클로로포, 메탄올에 ml 지질 혼합물 당 0.01 mg을 준비한다. 클로로폼 8.91 ml와 메탄올 0.99 ml, 0.1 ml 의 지질 용액 10 ml를 사용 하 여.테플론 플레이트 준비. 메탄올 욕조에서 테플론 접시를 5분간 초음파 처리합니다. 뜨거운 물로 15분간 씻은 다음 증류수로 헹구습니다.테플론 플레이트를 건조한 상태에서 30분 간 건조시키고 사용할 때까지 진공 상태로 유지합니다. 버퍼 저장소에 지질 단층의 형성. 예상 작동 시간은 1시간 반이 소요됩니다.페트리 접시에 1형 필터 용지를 놓고 필터 용지 위에 테플론 블록을 정렬합니다. 60 마이크로리터의 완충제로 테플론 플레이트의 우물을 채웁니다. 조심스럽게 드롭에 의해 버퍼 표면 드롭의 상단에 액체 혼합물을 추가합니다.해밀턴 주사기를 사용하여 드롭당 마이크로리터 1개를 사용하는 것이 이상적입니다. 필터 용지에 증류수로 적시고 페트리 접시에 습도를 유지합니다. 60분 동안 실온에서 배양하면 클로로폼이 증발해야 하며 완충제 표면에 지질의 단층이 형성되어야 한다.지질 단층상에 EM 그리드를 적용합니다. 예상 작동 시간 1 시간 반. 탄소 코팅 된 EM 그리드를 각 버퍼 저장소의 표면에 빛을 방출하지 않고 부드럽게 놓습니다.조심스럽게 측면 주입에 단백질을 주입, 하나의 마이크로 몰러 주위에 잘에 최종 단백질 농도를 사용. 실온에서 60분 동안 배양하세요. 테플론 블록의 표면 위에 그리드를 올리기 위해 약 20~30마이크로리터의 완충제를 사이트 사출 포트에 부드럽게 주입한다.이렇게 하면 핀셋한 쌍으로 그리드를 선택하고 물방울에서 수직으로 들어 올릴 수 있습니다. 대표적인 결과. EM 그리드에 증착된 지질 단층은 대조적 인 염색없이 전송 전자 현미경으로 시각화 될 수 있습니다.단층의 존재는 해당 빔 경로에 있는 시편이 없는 영역과 대조차이로 인식될 수 있다. 지질 단층 범위가 있는 지역은 엄호가 없는 그들 보다는 더 낮은 대비가 있습니다. 빈 구멍을 통해 전자 빔이 흩어져 있지 않으므로 더 밝은 조명을 보여줍니다.결론적으로, 지질 단층 방법은 단순성 때문에 단백질 구조를 공부할 수 있는 기회를 제공합니다. 2D 결정화 과정을 용이하게 하기 위한 대안적 접근법을 제공할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

헬름홀츠 젠트럼 베를린에서 결정화 조각 검사를 위한 워크플로우 및 도구

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

지원 부동 블록을 사용하여 전송 전자 현미경 검사법에서 샘플 지원 필름의 준비

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

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대규모 다중 오믹스 게놈 전체 연관 연구 (Mo-GWAS) : 샘플 준비 및 정상화에 대한 지침

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...