Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Utarbeidelsen av dette manuskriptet ble delvis støttet av US Army Research Office (W911NF2010321) og Arizona State University oppstartsmidler til P.-L.C.

1. Forberedelse av Teflon-blokk
<ol><li>Forbered Teflon-blokken fra kjemisk motstandsdyktig PTFE (polytetrafluoretylen) harpiks. Lag hull på blokken ved hjelp av en generell bor etterfulgt av dimensjonene som er merket i figur 1.</li>
</ol>2. Monolayer lipid forberedelse
MERK: Beregnet driftstid: 30-45 minutter
<ol><li>Lipid lager forberedelse<ol>
<li>Forbered en 0,01 mg/ml lipidblanding i 9:1 (v/v) kl...

En lipidmonolayer er et kraftig verktøy som letter veksten av store 2D-krystaller for strukturelle studier av biologiske makromolekyler. For å kunne forberede en intakt lipidmonolayer ved luftvannsgrensesnittet, anbefales det sterkt at lipidene fremstilles ferskt på eksperimentets dag, fordi oksidasjon av lipidakylkjeden kan føre til pakkeforstyrrelser i monolayeren og påvirke den resulterende krystalldannelsen negativt. Kjøpte lipider i pulverform skal oppløses ved hjelp av en blanding av kloroform: metanolløsni...

Elektrondiffraksjon gjennom 2D-krystaller eller spiralformede matriser av proteiner kan oppnå sub-nanometeroppløsninger i gunstige tilfeller1,2,3. Av spesiell interesse er rekonstituerte 2D-membranproteinmatriser eller krystaller i deres nesten innfødte miljøer1. Fordi en krystall fungerer som en signalforsterker som forbedrer intensitetene til strukturfaktorene ved spesifikke romlige frekvenser, gjør elektronkrystallografi det mulig å undersøke et mål med en mindre størrelse ved høye oppløsninger, for eksempel små molekyler, enn de for single-partikkel cryo-EM. Elektronstrålen kan diffracted av en bestilt 2D-matrise av proteiner, generere et diffraksjonsmønster eller et gitterbilde avhengig av hvor bildeplanet er registrert pådetektoren 4. De diffracted intensitetene kan deretter ekstraheres og behandles for å rekonstruere en 2D-projeksjonsstruktur av krystallen. Elektroner har et større spredningstverrsnitt enn røntgenstråler, og spredningen følger for det meste Rutherford-modellen basert på Coulomb-samspillet mellom elektronene og de ladede atomene imolekylet 5. Tykkelsen på 2D-membrankrystaller er vanligvis mindre enn 100 nm, egnet for elektronoverføring uten dynamisk spredning som forekommer i prøve6. Elektronkrystallografiske studier har vist seg å være et kraftig verktøy for å sondere høyoppløselig strukturell informasjon om membranproteiner og lipidproteininteraksjoner7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
En lipidmonolayer er et enkelt lipidlag sammensatt av fosfolipider tett pakket ved et luftvannsgrensesnitt6, som kan hjelpe 2D-matriseformasjonen for løselige proteiner eller perifere membranproteiner18. Avhengig av lipidenes tetthet og deres laterale trykk, kan lipidmolekylene danne en bestilt 2D-matrise på luftvannsgrensesnittet med deres akrylkjeder utvidet til luft- og hydrofile hodegrupper eksponert i vandig løsning1,6,19. Lipidhodegruppen kan samhandle med proteiner via elektrostatisk interaksjon eller kan endres for å gi en affinitetskode for å binde et bestemt proteindomene. Eksempel: DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) brukes ofte til å danne en lipidmonolayer for å binde proteinene med en poly-histidin tag20,21,21,2 . Også kolera toksin B kan binde et bestemt pentasaccharide av ganglioside GM1 i en lipid monolayer for strukturelle studier23,24. Ved å forankre proteinene på lipidhodegruppene kan lipidmonolayeren hjelpe dannelsen av 2D-matrisene som er tynne for høyoppløselige elektronkrystallografiske studier. Lipidmonolayerteknikken har blitt brukt i elektronkrystallografi for strukturelle studier av proteiner, som streptavidin2,25, annexin V26, kolera toksin27, E. coli gyrase B subenhet28, E. coli RNA polymerase25,29,30, karboksysom skallproteiner31 og capsid proteiner av HIV-132 og Moloney murine leukemi virus 33. På grunn av stabiliteten og den kjemiske egenskapen til lipidmonolayeren, har forskjellige bruksområder for prøvepreparering blitt utforsket for kryo-EM-avbildning34. Optimalisering vil imidlertid være nødvendig for proteinmatrisedannelse.
Her gir vi omfattende detaljer om den generelle utarbeidelsen av lipidmonolayers for kryo-EM-avbildning og noen hensyn som kan påvirke kvaliteten på de dannede monolayers.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

Elektronkrystallografi er et kraftig verktøy for høyoppløselig strukturbestemmelse. Makromolekyler som løselige eller membranproteiner kan dyrkes til høyt bestilte todimensjonale (2D) krystaller under gunstige forhold. Kvaliteten på de dyrkede 2D-krystallene er avgjørende for oppløsningen av den endelige rekonstruksjonen via 2D-bildebehandling. Gjennom årene har lipidmonolayers blitt brukt som et støttelag for å fremme 2D-krystallisering av perifere membranproteiner samt løselige proteiner. Denne metoden kan også brukes på 2D-krystallisering av integrerte membranproteiner, men krever mer omfattende empirisk undersøkelse for å bestemme vaskemiddel og dialyseforhold for å fremme partisjonering til monolayeren. En lipidmonolayer dannes ved luftvannsgrensesnittet slik at de polare lipidhodegruppene forblir hydrert i den vandige fasen og de ikke-polare acylkjedene, halene partisjonerer seg i luften, bryter overflatespenningen og flater ut vannoverflaten. Hodegruppenes ladede natur eller særegne kjemiske moieties gir affinitet for proteiner i løsning, og fremmer binding for 2D-matrisedannelse. Et nyformet monolag med 2D-arrayet kan enkelt overføres til et elektronmikroskop (EM) på et karbonbelagt kobbergitter som brukes til å løfte og støtte det krystallinske arrayet. I dette arbeidet beskriver vi en lipidmonolayermetodikk for kryogen elektronmikroskopisk (kryo-EM) avbildning.

En lipidmonolayer avsatt på EM-rutenettet kan visualiseres under et transmisjonselektronmikroskop (TEM) uten farging. Monolayerens tilstedeværelse kan gjenkjennes av kontrastforskjellen fra området uten noen prøve i strålebanen. Områder som har lipidmonolayerdekning har lavere lokal kontrast enn de uten dekning, siden elektronstrålen gjennom de tomme hullene ikke har spredning og viser en lysere belysning (Figur 3).
For å screene betingelsene for 2D monola...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Lipidmonolayers har blitt brukt som grunnlag for å danne todimensjonale (2D) proteinkrystaller for strukturelle studier i flere tiår. De er stabile ved luftvannsgrensesnittet og kan fungere som et tynt støttemateriale for elektronavbildning. Her presenterer vi de påviste trinnene for å forberede lipidmonolayers for biologiske studier.

Prøvepreparering ved hjelp av en Lipid Monolayer-metode for elektronkrystallografiske studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Gjennom årene har lipidmonlayers blitt brukt som et støttelag for å fremme 2D-krystallisering av perifere membranproteiner, samt løselige proteiner. Denne metoden kan også brukes på 2D-krystallisering, som noen integrerte membranproteiner. Men krever mer omfattende empirisk undersøkelse for å bestemme vaskemiddel og dialyseforhold for å fremme partisjonering til lipidmonolayeren.En lipidmonolayer dannes ved luftvanngrensesnittet, slik at polarhodegruppene til lipiden forblir hydrert i den vandige fasen. Og de ikke-polare acylhalene på lipidpartisjonen til luftvanngrensesnittet, som bryter overflatespenningen og flater vannoverflaten. Ladningsnaturen de karakteristiske kjemiske moieties av lipidhodegruppene gir affiniteten for proteiner i løsning.Fremme binding, og i prinsippet 2D-matrisedannelse. Alle 2D-krystaller dannet på en lipidmonolayer kan enkelt overføres til elektronmikroskopet på et karbonbelagt EM-rutenett som brukes til å løfte og støtte det krystallinske arrayet på lipidlaget. Vi beskrev i dette manuskriptet en lipid monolayer metodikk for kryogen elektronmikroskopiavbildning.Lipid monolayer forberedelse. Lipid lagerpreparat, lag en 0,01 mg per ml lipidblanding i 9: 1 volum til volumklorform, metanol. Bruk av 8,91 ml kloroform og 0,99 ml metanol og 0,1 ml av en 10 mg per ml lipidoppløsning.Teflon plate forberedelse. Soniker en Teflon-tallerken i et metanolbad i fem minutter. Vask med varmt vann i 15 minutter og skyll deretter med destillert vann.Tørk Teflonplaten i en tørketrommel i 30 minutter og hold den under vakuum til bruk. Dannelse av lipidmonolayer på bufferreservoar. Beregnet driftstid vil være en og en halv time.Legg et type ett filterpapir i en Petri-tallerken og ordne Teflon-blokken oppå filterpapiret. Fyll brønnene på Teflon-platen med 60 mikroliter buffer. Tilsett forsiktig flytende blanding på toppen av bufferoverflaten dråpe for dråpe.Ideelt sett en mikroliter per dråpe ved hjelp av en Hamilton-sprøyte. Fukt filterpapiret med destillert vann og hold fuktigheten i Petri-parabolen. Inkuber ved romtemperatur i 60 minutter, kloroformen skal fordampe og en monolayer av lipid på overflaten av bufferne skal dannes.Påføring av et EM-rutenett på en lipidmonolayer. Beregnet driftstid en og en halv time. Plasser forsiktig et karbonbelagt EM-rutenett uten å lyse ut karbonsiden ned på overflaten av hvert bufferreservoar.Injiser proteiner forsiktig i sideinjeksjonsbrønnen, bruk endelige proteinkonsentrasjoner i brønnen rundt en mikromolar. Inkuber 60 minutter ved romtemperatur. Injiser forsiktig omtrent 20 til 30 mikroliter buffer i injeksjonsporten på stedet for å heve rutenettet over overflaten av Teflon-blokken.Dette gjør at du kan plukke opp rutenettet med et par pinsett og løfte det vertikalt av dråpen. Representative resultater. En lipidmonolayer avsatt på et EM-rutenett kan visualiseres under transmisjonselektronmikroskopet uten kontrastfarging.Monolayerens tilstedeværelse kan gjenkjennes, av kontrastforskjellen fra området uten noen prøve i den strålebanen. Områder som har lipidmonolayerdekning har lavere kontrast enn de uten dekning. Siden elektronstrålen gjennom de tomme hullene ikke har spredning, viser den en lysere belysning.Til slutt gir lipidmonolayermetoden en mulighet til å studere proteinstrukturer på grunn av sin enkelhet. Det kan gi en alternativ tilnærming for å lette prosessen med 2D-krystallisering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En plasmaprøve forberedelse for massespektrometri ved hjelp av en automatisert arbeidsstasjon

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse for proteomics facility innsending og påfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Arbeidsflyt og verktøy for krystallografisk fragmentscreening ved Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Utarbeidelse av prøvestøttefilmer i transmisjonselektronmikroskopi ved hjelp av en støtteflytblokk

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Store multiomikk Genom-brede foreningsstudier (Mo-GWAS): Retningslinjer for prøveforberedelse og normalisering

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...