Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

A preparação deste manuscrito foi parcialmente apoiada pelo Escritório de Pesquisa do Exército dos EUA (W911NF2010321) e fundos de inicialização da Universidade Estadual do Arizona para p.-L.C.

1. Preparação do bloco de Teflon
<ol><li>Prepare o bloco de Teflon a partir de resina PTFE resistente a produtos químicos (politetrafluoroetileno). Faça furos no bloco usando uma broca geral seguida pelas dimensões rotuladas na Figura 1.</li>
</ol>2. Preparação lipídica de monocamadas
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 30-45 minutos
<ol><li>Preparação de estoque lipídida<ol>
<li>Prepare u...

Uma monocamada lipídica é uma ferramenta poderosa que facilita o crescimento de grandes cristais 2D para estudos estruturais de macromoléculas biológicas. Para preparar com sucesso uma monocamada lipídica intacta na interface ar-água, é fortemente recomendável que os lipídios sejam preparados recentemente no dia do experimento, pois a oxidação da cadeia lipídica do acil pode levar à interrupção da embalagem na monocamada e afetar negativamente a formação de cristais resultante. Lipídios comprados em for...

A difração eletrônica através de cristais 2D ou matrizes helicoidais de proteínas podem alcançar resoluções subnômetros em casos favoráveis1,2,3. De particular interesse são matrizes de proteína de membrana 2D reconstituídas ou cristais em seus ambientes quase nativos1. Como um cristal age como um amplificador de sinal aumentando a intensidade dos fatores estruturais em frequências espaciais específicas, a cristalografia eletrônica permite sondar um alvo com um tamanho menor em altas resoluções, como pequenas moléculas, do que aquelas para crio-EM de uma única partícula. O feixe de elétrons pode ser difracionado por uma matriz 2D ordenada de proteínas, gerando um padrão de difração ou uma imagem de rede, dependendo de onde o plano de imagem é gravado no detector4. As intensidades ditracadas podem então ser extraídas e processadas para reconstruir uma estrutura de projeção 2D do cristal. Os elétrons têm uma seção transversal de dispersão maior do que os raios-X e sua dispersão segue principalmente o modelo rutherford baseado na interação coulomb entre os elétrons e os átomos carregados na molécula5. As espessuras dos cristais de membrana 2D são geralmente inferiores a 100 nm, adequadas para transmissão eletrônica sem dispersão dinâmica ocorrendo dentro da amostra6. Estudos cristalográficos eletrônicos têm se mostrado uma poderosa ferramenta para sondar informações estruturais de alta resolução de proteínas de membrana e interações lipídica-proteínas7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Uma monocamada lipídica é uma única camada lipídica composta de fosfolipídios densamente embalados em uma interface ar-água6, que pode auxiliar a formação de matriz 2D para proteínas solúveis ou proteínas de membrana periférica18. Dependendo da densidade dos lipídios e de sua pressão lateral, as moléculas lipídicas podem formar uma matriz 2D ordenada na interface ar-água com suas correntes de aciis estendidas ao ar e grupos de cabeça hidrofílicos expostos na solução aquosa1,6,19. O headgroup lipídico pode interagir com proteínas através da interação eletrostática ou pode ser modificado para fornecer uma etiqueta de afinidade para ligar um domínio proteico específico. Por exemplo, os DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)imino ácido diacético)succinyl]2- Ni2+) é frequentemente usado na formação de uma monocamada lipídica para ligar as proteínas com uma tag poli-histidina20,21,22. Além disso, a toxina da cólera B pode ligar um pentasacarídeo particular do ganglioside GM1 em uma monocamada lipídica para estudos estruturais23,24. Ancorando as proteínas nos grupos de cabeça lipídicos, a monocamada lipídica pode auxiliar na formação das matrizes 2D que são finas para estudos cristalográficos de alta resolução. A técnica de monocamadas lipídica tem sido usada na cristalografia eletrônica para estudos estruturais de proteínas, tais como streptavidin2,25, anexo V26, cólera toxina27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA polymerase25,29,30, carboxysome shell proteins31 e as proteínas capsid do vírus HIV-1 32 e Mol muroneyine leucemia 33. Devido à estabilidade e propriedade química da monocamide lipídica, diferentes aplicações para preparação da amostra foram exploradas para a imagem crio-EM34. No entanto, a otimização será necessária para a formação de matrizes proteicas.
Aqui, fornecemos extensos detalhes da preparação geral de monocamadas lipídicas para imagens crio-EM e algumas considerações que podem afetar a qualidade das monocamadas formadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

A cristalografia eletrônica é uma ferramenta poderosa para a determinação da estrutura de alta resolução. Macromoléculas como proteínas solúveis ou membranas podem ser cultivadas em cristais bidimensionais altamente ordenados (2D) em condições favoráveis. A qualidade dos cristais 2D cultivados é crucial para a resolução da reconstrução final via processamento de imagem 2D. Ao longo dos anos, monocamadas lipídicas têm sido usadas como uma camada de suporte para promover a cristalização 2D de proteínas de membrana periférica, bem como proteínas solúveis. Este método também pode ser aplicado à cristalização 2D de proteínas de membrana integral, mas requer uma investigação empírica mais extensa para determinar condições de detergente e diálise para promover o particionamento da monocamadas. Uma monocamada lipídica se forma na interface ar-água de tal forma que os grupos de cabeça lipídica polar permanecem hidratados na fase aquosa e nas cadeias aciíticas não polares, divisória de caudas no ar, quebrando a tensão superficial e achatando a superfície da água. A natureza carregada ou as características químicas distintas dos grupos chefes fornecem afinidade por proteínas em solução, promovendo a vinculação para a formação de matriz 2D. Uma monocamada recém-formada com a matriz 2D pode ser prontamente transferida para um microscópio eletrônico (EM) em uma grade de cobre revestida de carbono usada para levantar e suportar a matriz cristalina. Neste trabalho, descrevemos uma metodologia de monocamadas lipídica para imagens microscópicas de elétrons criogênicos (crio-EM).

Uma monocamada lipídica depositada na grade EM pode ser visualizada sob um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) sem coloração. A presença da monocamadas pode ser reconhecida pela diferença de contraste da área sem qualquer espécime no caminho do feixe. As áreas que possuem cobertura de monocamadas lipídicas têm menor contraste local do que as sem cobertura, uma vez que o feixe de elétrons através dos orifícios vazios não tem dispersão e mostra uma iluminação mais brilhante(...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Monocamadas lipídicas têm sido usadas como base para a formação de cristais proteicos bidimensionais (2D) para estudos estruturais por décadas. Eles são estáveis na interface ar-água e podem servir como um material de suporte fino para imagens eletrônicas. Aqui apresentamos os passos comprovados na preparação de monocamadas lipídicas para estudos biológicos.

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Ao longo dos anos, as monocamadas lipídicas têm sido usadas como uma camada de suporte para promover a cristalização 2D de proteínas de membrana periférica, bem como proteínas solúveis. Este método também pode ser aplicado à cristalização 2D, como algumas proteínas de membrana integral. Mas requer uma investigação empírica mais extensa para determinar condições de detergente e diálise para promover partição para a monocameira lipídica.Uma monocamada lipídica se forma na interface da água do ar, de modo que os grupos polares da cabeça do lipídio permaneçam hidratados na fase aquosa. E as caudas acimais não polares da partição lipídica à interface da água do ar, que quebra a tensão da superfície e achata a superfície da água. A natureza da carga as distintas moieties químicas dos grupos de cabeça lipídica fornecem a afinidade por proteínas em solução.Promovendo a vinculação e, em princípio, a formação de matriz 2D. Quaisquer cristais 2D formados em uma monocamada lipídica podem ser prontamente transferidos para o microscópio eletrônico em uma grade EM revestida de carbono que é usada para levantar e apoiar a matriz cristalina na camada lipídica. Descrevemos neste manuscrito, uma metodologia de monocamadas lipídica para imagens de microscopia eletrônica criogênica.Preparação de monocamadas lipídicas. Preparação de caldo lipídido, prepare uma mistura lipídica de 0,01 mg por ml em volume 9:1 para volume de clorofórmio, metanol. Utilizando 8,91 ml de clorofórmio e 0,99 ml de metanol e 0,1 mls de uma solução lipídica de 10 mg por ml.Preparação da placa de Teflon. Sonicate uma placa de Teflon em um banho de metanol por cinco minutos. Lave com água quente por 15 minutos e enxágue com água destilada.Seque a placa de Teflon em um dessecado por 30 minutos e mantenha-a sob vácuo até usar. Formação de monocamadas lipídicas no reservatório tampão. O tempo estimado de funcionamento será de uma hora e meia.Coloque um papel filtro tipo um em uma placa de Petri e disponha o bloco Teflon em cima do papel do filtro. Encha os poços da placa Teflon com 60 microliters de tampão. Adicione cuidadosamente a mistura líquida em cima da superfície do buffer gota a gota.Idealmente um microliter por gota usando uma seringa Hamilton. Molhe o papel filtro com água destilada e mantenha a umidade na placa de Petri. Incubar à temperatura ambiente por 60 minutos, o clorofórmio deve evaporar e uma monocamada de lipídio na superfície dos tampões deve ser formada.Aplicação de uma grade EM em uma monocamadas lipídica. Tempo estimado de operação em uma hora e meia. Coloque suavemente uma rede EM revestida de carbono sem o lado de carbono de descarga de brilho para baixo na superfície de cada reservatório tampão.Injete cuidadosamente proteínas no poço de injeção lateral, use concentrações de proteínas finais no poço em torno de um micromolar. Incubar 60 minutos em temperatura ambiente. Injete suavemente aproximadamente 20 a 30 microliters de tampão na porta de injeção do local para elevar a grade acima da superfície do bloco Teflon.Isso permite que você pegue a grade com um par de pinças e levante-a verticalmente da gota. Resultados representativos. Uma monocamada lipídica depositada em uma grade EM pode ser visualizada sob o microscópio eletrônico de transmissão sem coloração de contraste.A presença da monocamadas pode ser reconhecida, pela diferença de contraste da área sem qualquer espécime nesse caminho de feixe. As áreas que possuem cobertura de monocamadas lipídicas têm contraste menor do que as sem cobertura. Uma vez que o feixe de elétrons através dos buracos vazios não tem dispersão, ele mostra uma iluminação mais brilhante.Em conclusão, o método de monocamadas lipídica oferece uma oportunidade para estudar estruturas proteicas devido à sua simplicidade. Pode fornecer uma abordagem alternativa para facilitar o processo de cristalização 2D.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Uma preparação de amostra de plasma para espectrometria de massa usando uma estação de trabalho automatizada

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Fluxo de trabalho e ferramentas para triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Preparação de filmes de suporte à amostra em microscopia eletrônica de transmissão usando um bloco de flutuação de suporte

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Estudos de associação multi-omics em larga escala (Mo-GWAS): Diretrizes para preparação e normalização de amostras

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...