Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Подготовка этой рукописи была частично поддержана Исследовательским управлением армии США (W911NF2010321) и стартовыми фондами Университета штата Аризона для P.-L.C.

1. Подготовка тефлонового блока
<ol><li>Приготовьте тефлоновый блок из химически стойкой смолы PTFE (политетрафторэтилен). Сделайте отверстия на блоке с помощью общего сверла, за которым следуют размеры, обозначенные на рисунке 1.</li>
</ol>2. Однослойный...

Липидный монослой является мощным инструментом, способствующим росту крупных 2D-кристаллов для структурных исследований биологических макромолекул. Для успешного приготовления интактного липидного монослоя на границе раздела воздух-вода настоятельно рекомендуется, чтобы липиды бы?...

Дифракция электронов через 2D-кристаллы или спиральные массивы белков может достигать субнанометровых разрешений в благоприятных случаях1,2,3. Особый интерес представляют восстановленные 2D мембранные белковые массивы или кристаллы в их почти нативных средах1. Поскольку кристалл действует как усилитель сигнала, усиливая интенсивность структурных факторов на определенных пространственных частотах, электронная кристаллография позволяет зондирование мишени с меньшим размером при высоких разрешениях, таких как малые молекулы, чем для крио-ЭМ с одной частицей. Электронный пучок может быть дифрагирован упорядоченным 2D-массивом белков, генерируя дифракционную картину или изображение решетки в зависимости от того, где плоскость изображения записывается надетекторе 4. Затем дифракционные интенсивности могут быть извлечены и обработаны для реконструкции 2D-проекционной структуры кристалла. Электроны имеют большее поперечное сечение рассеяния, чем рентгеновские лучи, и его рассеяние в основном следует модели Резерфорда, основанной на кулоновском взаимодействии между электронами и заряженными атомами в молекуле5. Толщина 2D мембранных кристаллов обычно составляет менее 100 нм, пригодных для передачи электронов без динамического рассеяния, происходящего в образце6. Было показано, что электронно-кристаллографические исследования можно использовать мощный инструмент для исследования структурной информации с высоким разрешением мембранных белков илипидно-белковых взаимодействий7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17.
Монослой липидов представляет собой один единственный липидный слой, состоящий из фосфолипидов, плотно упакованных на границераздела 6воздух-вода, который может способствовать образованию 2D-массива для растворимых белков или белков периферических мембран18. В зависимости от плотности липидов и их бокового давления молекулы липидов могут образовывать упорядоченный 2D-массив на границе раздела воздух-вода с их ацильными цепями, расширенными до воздуха и гидрофильных головных групп, выставленных в водномрастворе1,6,19. Липидная головная группа может взаимодействовать с белками посредством электростатического взаимодействия или может быть модифицирована для обеспечения метки сродства для связывания определенного белкового домена. Например, DOGS-NTA-Ni (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил)иминодиуксусная кислота)сукцинил]2-Ni2+)часто используется при формировании липидного монослоя для связывания белков с полигистидовой меткой 20,21,22. Также холерный токсин В может связывать определенный пентасахарид ганглиозида GM1 в липидном монослое для структурных исследований23,24. Закрепляя белки на липидных головных группах, липидный монослой может способствовать формированию 2D-массивов, которые являются тонкими для электронно-кристаллографических исследований с высоким разрешением. Липидный монослойный метод был использован в электронной кристаллографии для структурных исследований белков, таких как стрептавидин2,25,аннексин V26,холерический токсин27, E. coli gyrase B субъединица28, E. coli РНК-полимераза25,29,30,белки оболочки карбоксисомы31 и капсидные белки ВИРУСА ВИЧ-132 и вируса мышиного лейкоза Молони 33.Из-за стабильности и химических свойств липидного монослоя были исследованы различные применения для подготовки образцов для крио-ЭМ-визуализации34. Однако для формирования белкового массива потребуется оптимизация.
Здесь мы предоставляем подробные сведения об общей подготовке липидных монослоев для крио-ЭМ-визуализации и некоторые соображения, которые могут повлиять на качество образующихся монослоев.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

Электронная кристаллография является мощным инструментом для определения структуры высокого разрешения. Макромолекулы, такие как растворимые или мембранные белки, могут быть выращены в высокоупорядоженные двумерные (2D) кристаллы при благоприятных условиях. Качество выращенных 2D-кристаллов имеет решающее значение для разрешения окончательной реконструкции с помощью обработки 2D-изображений. На протяжении многих лет липидные монослои использовались в качестве поддерживающего слоя для содействия 2D-кристаллизации белков периферических мембран, а также растворимых белков. Этот метод также может быть применен к 2D-кристаллизации интегральных мембранных белков, но требует более обширных эмпирических исследований для определения условий моющего средства и диализа для содействия разделению на монослой. Липидный монослой образуется на границе раздела воздух-вода таким образом, что полярные липидные головные группы остаются гидратированными в водной фазе, а неполярные, ацильные цепи, хвосты перегоняются в воздух, нарушая поверхностное натяжение и сплющивая поверхность воды. Заряженная природа или отличительные химические фрагменты головных групп обеспечивают сродство к белкам в растворе, способствуя связыванию для формирования 2D-массива. Вновь образованный монослой с 2D-массивом может быть легко перенесен в электронный микроскоп (ЭМ) на медной сетке с углеродным покрытием, используемой для подъема и поддержки кристаллического массива. В этой работе мы описываем липидную монослойную методологию криогенной электронно-микроскопической (крио-ЭМ) визуализации.

Липидный монослой, нанесенный на электромагнитную сетку, может быть визуализирован под просвечивающим электронным микроскопом (ТЭМ) без окрашивания. Присутствие монослоя можно распознать по контрастной разнице с областью без какого-либо образца на пути луча. Области, которые имеют ли...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Липидные монослои использовались в качестве основы для формирования двумерных (2D) белковых кристаллов для структурных исследований на протяжении десятилетий. Они стабильны на границе раздела воздух-вода и могут служить тонким поддерживающей материалом для электронной визуализации. Здесь мы представляем проверенные этапы подготовки липидных монослоев для биологических исследований.

Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

На протяжении многих лет липидные монослои использовались в качестве поддерживающего слоя для содействия 2D-кристаллизации белков периферических мембран, а также растворимых белков. Этот метод также может быть применен к 2D-кристаллизации, как некоторые интегральные мембранные белки. Но требуется более обширное эмпирическое исследование для определения моющих и диализных условий, способствующих разделению на липидный монослой.На границе раздела воздушной воды образуется липидный монослой, так что полярные головные группы липидов остаются гидратированными в водной фазе. А неполярные ацильные хвосты липидного перегородки с воздушной водной границей раздела, что нарушает поверхностное натяжение и выравнивает водную гладь. Характер заряда отличительных химических фрагментов групп головок липидов обеспечивает сродство к белкам в растворе.Содействие связыванию, и в принципе формированию 2D-массива. Любые 2D-кристаллы, образованные на липидном монослое, могут быть легко перенесены в электронный микроскоп на ЭМ-сетке с углеродным покрытием, которая используется для подъема и поддержки кристаллической решетки на липидном слое. В этой рукописи мы описали липидную монослойную методологию для криогенной электронной микроскопии.Липидный монослойный препарат. Препарат липидного запаса, готовят 0,01 мг на мл липидной смеси в объеме 9:1 к объему хлороформа, метанола. Используют 8,91 мл хлороформа и 0,99 мл метанола и 0,1 мл 10 мг на мл липидного раствора.Подготовка тефлоновой пластины. Обшивайте тефлоновую пластину ультразвуком в метаноловой ванне в течение пяти минут. Промыть горячей водой в течение 15 минут, а затем промыть дистиллированной водой.Высушите тефлоновую пластину в высушиваемом в течение 30 минут и держите ее под вакуумом до использования. Образование липидного монослоя на буферном резервуаре. Расчетное время работы составит полтора часа.Поместите фильтровальную бумагу типа один в чашку Петри и разложите тефлоновый блок поверх фильтровальной бумаги. Заполните колодцы тефлоновой плиты 60 микролитами буфера. Осторожно добавляйте жидкую смесь поверх буферной поверхности капля за каплей.В идеале один микролитр на каплю с помощью шприца Гамильтона. Смочите фильтровальную бумагу дистиллированной водой и сохраните влажность в чашке Петри. Инкубировать при комнатной температуре в течение 60 минут, хлороформ должен испариться и на поверхности буферов должен образоваться монослой липидов.Нанесение ЭМ сетки на липидный монослой. Расчетное время работы полтора часа. Аккуратно поместите ЭМ-сетку с углеродным покрытием без свечения, выбрасывая углерод стороной вниз на поверхность каждого буферного резервуара.Осторожно вводите белки в боковую инъекционную скважину, используйте конечные концентрации белка в колодце вокруг одного микромоляра. Инкубировать 60 минут при комнатной температуре. Осторожно вводят примерно от 20 до 30 микролитров буфера в отверстие для впрыска, чтобы поднять сетку над поверхностью тефлонового блока.Это позволяет подобрать сетку парой пинцетов и поднять ее вертикально с капельки. Репрезентативные результаты. Липидный монослой, нанесенный на электромагнитную сетку, может быть визуализирован под просвечивающим электронным микроскопом без контрастного окрашивания.Монослойное присутствие может быть распознано по контрастной разнице с областью без какого-либо образца на этом лучевом пути. Области, которые имеют липидное монослойное покрытие, имеют более низкую контрастность, чем те, которые не имеют покрытия. Поскольку электронный пучок через пустые дыры не имеет рассеяния, он показывает более яркое освещение.В заключение, липидный монослойный метод предлагает возможность изучения белковых структур благодаря своей простоте. Это может обеспечить альтернативный подход для облегчения процесса 2D-кристаллизации.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Подготовка образца плазмы для масс-спектрометрии с использованием автоматизированной рабочей станции

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Рабочий процесс и инструменты для скрининга кристаллографических фрагментов в Берлинском центре Гельмгольца

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Подготовка образцов опорных пленок в просвечивающей электронной микроскопии с использованием опорного флотационного блока

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Крупномасштабные мультиомные исследования геномных ассоциаций (Mo-GWAS): руководство по подготовке и нормализации образцов

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...