Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
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La preparación de este manuscrito fue parcialmente apoyada por la Oficina de Investigación del Ejército de los Estados Unidos (W911NF2010321) y los fondos iniciales de la Universidad Estatal de Arizona para P.-L.C.

1. Preparación del bloque de teflón
<ol><li>Prepare el bloque de teflón a partir de resina de PTFE (politetrafluoroetileno) resistente a los productos químicos. Haga taladros en el bloque utilizando un taladro general seguido de las dimensiones etiquetadas en la Figura 1.</li>
</ol>2. Preparación lipídica monocapa
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 30- 45 minutos
<ol><li>Preparación de stoc...

Una monocapa lipídica es una poderosa herramienta que facilita el crecimiento de grandes cristales 2D para estudios estructurales de macromoléculas biológicas. Para preparar con éxito una monocapa lipídica intacta en la interfaz aire-agua, se recomienda encarecidamente que los lípidos se preparen recién el día del experimento, ya que la oxidación de la cadena de acil lipídico podría provocar la interrupción del empaquetamiento en la monocapa y afectar negativamente la formación de cristales resultante. Los l...

La difracción de electrones a través de cristales 2D o matrices helicoidales de proteínas puede lograr resoluciones subnanométricas en casos favorables1,2,3. De particular interés son las matrices reconstituidas de proteínas de membrana 2D o cristales en sus entornos casi nativos1. Debido a que un cristal actúa como un amplificador de señal que mejora las intensidades de los factores estructurales a frecuencias espaciales específicas, la cristalografía electrónica permite sondear un objetivo con un tamaño más pequeño a altas resoluciones, como moléculas pequeñas, que las de la crio-EM de una sola partícula. El haz de electrones puede ser difractado por una matriz ordenada 2D de proteínas, generando un patrón de difracción o una imagen de red dependiendo de dónde se registre el plano de la imagen en el detector4. Las intensidades difractadas se pueden extraer y procesar para reconstruir una estructura de proyección 2D del cristal. Los electrones tienen una sección transversal de dispersión más grande que los rayos X y su dispersión sigue principalmente el modelo de Rutherford basado en la interacción de Coulomb entre los electrones y los átomos cargados en la molécula5. Los espesores de los cristales de membrana 2D suelen ser inferiores a 100 nm, adecuados para la transmisión de electrones sin dispersión dinámica que ocurre dentro de la muestra6. Se ha demostrado que los estudios cristalográficos electrónicos son una herramienta poderosa para sondear información estructural de alta resolución de proteínas de membrana e interacciones lípido-proteína7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Una monocapa lipídica es una sola capa lipídica compuesta de fosfolípidos densamente empaquetados en una interfaz aire-agua6, que puede ayudar a la formación de la matriz 2D para proteínas solubles o proteínas de membrana periférica18. Dependiendo de la densidad de los lípidos y su presión lateral, las moléculas lipídicas pueden formar una matriz 2D ordenada en la interfaz aire-agua con sus cadenas de acilo extendidas al aire y grupos de cabeza hidrofílicos expuestos en la solución acuosa1,6,19. El grupo de cabeza lipídica puede interactuar con las proteínas a través de la interacción electrostática o puede modificarse para proporcionar una etiqueta de afinidad para unirse a un dominio proteico específico. Por ejemplo, el DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) se utiliza a menudo en la formación de una monocapa lipídica para unir las proteínas con una etiqueta de poli-histidina20,21,22. Además, la toxina B del cólera puede unirse a un pentasacárido particular del gangliósido GM1 en una monocapa lipídica para estudios estructurales23,24. Al anclar las proteínas en los grupos de cabeza de lípidos, la monocapa lipídica puede ayudar a la formación de las matrices 2D que son delgadas para estudios cristalográficos de electrones de alta resolución. La técnica de monocapa lipídica se ha utilizado en cristalografía electrónica para estudios estructurales de proteínas, como la estreptavidina2,25,la anexina V26,la toxina del cólera27,la subunidad28de la E. coli girasa B, la ARN polimerasa25,29,30,las proteínas de la cubierta del carboxisoma31 y las proteínas de la cápside del VIH-132 y el virus de la leucemia murina de Moloney 33. Debido a la estabilidad y propiedad química de la monocapa lipídica, se han explorado diferentes aplicaciones para la preparación de muestras para la obtención de imágenes crio-EM34. Sin embargo, la optimización será necesaria para la formación de matrices de proteínas.
Aquí, proporcionamos detalles extensos de la preparación general de monocapas lipídicas para imágenes crio-EM y algunas consideraciones que podrían afectar la calidad de las monocapas formadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

La cristalografía electrónica es una herramienta poderosa para la determinación de estructuras de alta resolución. Las macromoléculas como las proteínas solubles o de membrana se pueden cultivar en cristales bidimensionales (2D) altamente ordenados en condiciones favorables. La calidad de los cristales 2D cultivados es crucial para la resolución de la reconstrucción final a través del procesamiento de imágenes 2D. A lo largo de los años, las monocapas lipídicas se han utilizado como capa de soporte para fomentar la cristalización 2D de proteínas de membrana periférica, así como proteínas solubles. Este método también se puede aplicar a la cristalización 2D de proteínas de membrana integral, pero requiere una investigación empírica más extensa para determinar las condiciones de detergente y diálisis para promover la partición a la monocapa. Se forma una monocapa lipídica en la interfaz aire-agua de tal manera que los grupos de cabeza lipídica polar permanecen hidratados en la fase acuosa y las cadenas de acilo no polares, las colas se dividen en el aire, rompiendo la tensión superficial y aplanando la superficie del agua. La naturaleza cargada o las partículas químicas distintivas de los grupos de cabeza proporcionan afinidad por las proteínas en solución, promoviendo la unión para la formación de matrices 2D. Una monocapa recién formada con la matriz 2D se puede transferir fácilmente a un microscopio electrónico (EM) en una rejilla de cobre recubierta de carbono utilizada para levantar y soportar la matriz cristalina. En este trabajo, describimos una metodología monocapa lipídica para imágenes criogénicas microscópicas electrónicas (crio-EM).

Una monocapa lipídica depositada en la rejilla EM se puede visualizar bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) sin tinción. La presencia monocapa se puede reconocer por la diferencia de contraste del área sin ningún espécimen en la trayectoria del haz. Las áreas que tienen cobertura de monocapa lipídica tienen un contraste local más bajo que las que no tienen cobertura, ya que el haz de electrones a través de los agujeros vacíos no tiene dispersión y muestra una iluminación más brillante<strong...

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Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Las monocapas lipídicas se han utilizado como base para formar cristales de proteína bidimensionales (2D) para estudios estructurales durante décadas. Son estables en la interfaz aire-agua y pueden servir como un material de soporte delgado para la obtención de imágenes electrónicas. Aquí presentamos los pasos comprobados en la preparación de monocapas lipídicas para estudios biológicos.

Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A lo largo de los años, las monocapas lipídicas se han utilizado como capa de soporte para fomentar la cristalización 2D de proteínas de membrana periférica, así como proteínas solubles. Este método también se puede aplicar a la cristalización 2D, como algunas proteínas de membrana integrales. Pero requiere una investigación empírica más extensa para determinar las condiciones de detergente y diálisis para promover la partición a la monocapa lipídica.Se forma una monocapa lipídica en la interfaz aire-agua, de modo que los grupos de cabeza polar del lípido permanecen hidratados en la fase acuosa. Y las colas de acilo no polares de la partición lipídica a la interfaz de agua de aire, que rompe la tensión superficial y aplana la superficie del agua. La naturaleza de la carga las sustancias químicas distintivas de los grupos de cabeza lipídica proporcionan la afinidad por las proteínas en solución.Promover la unión y, en principio, la formación de matrices 2D. Cualquier cristal 2D formado en una monocapa lipídica se puede transferir fácilmente al microscopio electrónico en una rejilla EM recubierta de carbono que se utiliza para levantar y apoyar la matriz cristalina en la capa lipídica. Describimos en este manuscrito, una metodología de monocapa lipídica para imágenes de microscopía electrónica criogénica.Preparación monocapa lipídica. Preparación de stock de lípidos, prepare una mezcla de lípidos de 0.01 mg por ml en 9: 1 volumen a volumen cloroformo, metanol. Utilizando 8,91 ml de cloroformo y 0,99 ml de metanol y 0,1 ml de una solución lipídica de 10 mg por ml.Preparación de placas de teflón. Sonicar una placa de teflón en un baño de metanol durante cinco minutos. Lavar con agua caliente durante 15 minutos y luego enjuagar con agua destilada.Secar la placa de teflón en un desecado durante 30 minutos y mantenerla al vacío hasta su uso. Formación de monocapa lipídica en reservorio tampón. El tiempo estimado de funcionamiento será de una hora y media.Coloque un papel de filtro tipo uno en una placa de Petri y coloque el bloque de teflón sobre el papel de filtro. Llene los pozos de la placa de teflón con 60 microlitros de tampón. Agregue cuidadosamente la mezcla líquida sobre la superficie del tampón gota a gota.Idealmente un microlitro por gota usando una jeringa Hamilton. Humedezca el papel de filtro con agua destilada y mantenga la humedad en la placa de Petri. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos, el cloroformo debe evaporarse y se debe formar una monocapa de lípidos en la superficie de los tampones.Aplicación de una rejilla EM sobre una monocapa lipídica. Tiempo estimado de funcionamiento de una hora y media. Coloque suavemente una rejilla EM recubierta de carbono sin brillo descargando carbono hacia abajo en la superficie de cada depósito de amortiguación.Inyecte cuidadosamente proteínas en el pozo de inyección lateral, use concentraciones finales de proteínas en el pozo alrededor de un micromolar. Incubar 60 minutos a temperatura ambiente. Inyecte suavemente aproximadamente de 20 a 30 microlitros de tampón en el puerto de inyección del sitio para elevar la rejilla por encima de la superficie del bloque de teflón.Esto le permite recoger la rejilla con un par de pinzas y levantarla verticalmente de la gota. Resultados representativos. Una monocapa lipídica depositada en una rejilla EM se puede visualizar bajo el microscopio electrónico de transmisión sin tinción de contraste.La presencia de monocapa se puede reconocer, por la diferencia de contraste del área sin ningún espécimen en esa trayectoria del haz. Las áreas que tienen cobertura de monocapa lipídica tienen un contraste más bajo que las que no tienen cobertura. Dado que el haz de electrones a través de los agujeros vacíos no tiene dispersión, muestra una iluminación más brillante.En conclusión, el método de la monocapa lipídica ofrece una oportunidad para estudiar las estructuras de las proteínas debido a su simplicidad. Puede proporcionar un enfoque alternativo para facilitar el proceso de cristalización 2D.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Una preparación de muestra de plasma para espectrometría de masas utilizando una estación de trabajo automatizada

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparación de muestras para espectrometría de masas de ionización por electrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparación de muestras TMT para la presentación de instalaciones proteómicas y análisis de datos posteriores

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Flujo de trabajo y herramientas para la detección de fragmentos cristalográficos en el Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Preparación de películas de soporte de muestra en microscopía electrónica de transmisión utilizando un bloque de flotación de soporte

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Estudios de asociación multiómica a gran escala de todo el genoma (Mo-GWAS): Directrices para la preparación y normalización de muestras

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparación de rejillas de muestra de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...