Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Förberedelsen av detta manuskript stöddes delvis av US Army Research Office (W911NF2010321) och Arizona State University startfonder till P.-L.C.

1. Teflon block förberedelse
<ol><li>Förbered teflonblocket från kemiskt resistent PTFE (polytetrafluoreten) harts. Gör hål på blocket med en allmän borr följt av måtten i figur 1.</li>
</ol>2. Beredning av monolayer lipid
OBS: Beräknad driftstid: 30- 45 minuter
<ol><li>Lipid lagerberedning<ol>
<li>Bered en 0,01 mg/ml lipidblandning i 9:1 (v/v) kloroform/metanol med 8,91 ml kloroform, 0,99 ml ...

En lipidmonalayer är ett kraftfullt verktyg som underlättar tillväxten av stora 2D-kristaller för strukturella studier av biologiska makromolekyler. För att framgångsrikt förbereda en intakt lipidmonalayer vid luft-vattengränssnittet rekommenderas starkt att lipiderna framställs ny på experimentets dag, eftersom oxidering av lipidasylkedjan kan leda till förpackningsstörningar i monoskiktet och påverka den resulterande kristallbildningen negativt. Inköpta lipider i pulverform bör lösas upp med en blandnin...

Elektrondiffraktion genom 2D-kristaller eller spiralformade matriser av proteiner kan uppnå sub nanometerupplösning igynnsamma fall 1,2,3. Av särskilt intresse är rekonstituerade 2D-membranproteinmatriser eller kristaller i deras nära infödda miljöer1. Eftersom en kristall fungerar som en signalförstärkare som förbättrar intensiteten hos de strukturella faktorerna vid specifika rumsliga frekvenser, gör elektronkristallografi det möjligt att sondera ett mål med en mindre storlek vid höga upplösningar, såsom små molekyler, än de för enpartikel cryo-EM. Elektronstrålen kan diffracted av en ordnad 2D-samling proteiner, vilket genererar ett diffraktionsmönster eller en gitterbild beroende på var bildplanet registreras pådetektorn 4. De diffracted intensiteterna kan sedan extraheras och bearbetas för att rekonstruera en 2D-projektionsstruktur av kristallen. Elektroner har ett större spridningssnitt än röntgenstrålar och dess spridning följer mestadels Rutherford-modellen baserat på Coulomb-interaktionen mellan elektronerna och de laddade atomerna imolekylen 5. Tjocklekarna på 2D-membrankristaller är vanligtvis mindre än 100 nm, lämpliga för elektronöverföring utan dynamisk spridning som förekommer inom prov6. Elektronkristallografiska studier har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att undersöka högupplöst strukturell information om membranproteiner och lipidproteininteraktioner7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
En lipidmonalayer är ett enda lipidskikt bestående av fosfolipider tätt packade vid ett luftvattengränssnitt6, vilket kan hjälpa 2D-matrisbildningen för lösliga proteiner eller perifera membranproteiner18. Beroende på lipidens densitet och deras laterala tryck kan lipidmolekylerna bilda en ordnad 2D-matris på luft-vattengränssnittet med sina asylkedjor som är utsträckta till luft- och hydrofila huvudgrupper som exponeras ivattenlösningen 1,6,19. Lipidhuvudgruppen kan interagera med proteiner via elektrostatisk interaktion eller kan modifieras för att ge en affinitetstagg för att binda en specifik proteindomän. Till exempel används DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) ofta för att bilda en lipidmonalayer för att binda proteinerna med en poly-histidin tagg20,21,22. Koleratoxin B kan också binda en viss pentasackarid av ganglioside GM1 i en lipidmonalayer för strukturella studier23,24. Genom att förankra proteinerna på lipidhuvudgrupperna kan lipidmonoskiktet hjälpa bildandet av de 2D-matriser som är tunna för högupplösta elektronkristallografiska studier. Lipidmonoskiktstekniken har använts i elektronkristallografi för strukturella studier av proteiner, såsom streptavidin2,25, annexin V26, koleratoxin27, E. coli gyrase B underavdelning28, E. coli RNA polymeras25,29,30, karbinom skalproteiner31 och kapsidproteinerna i HIV-132 och Moloney murin leukemi virus 33.På grund av lipidmonaggarens stabilitet och kemiska egenskaper har olika tillämpningar för provberedning undersökts för cryo-EM imaging34. Optimering kommer dock att behövas för proteinmatrisbildning.
Här ger vi omfattande detaljer om den allmänna förberedelsen av lipidmonoskikt för cryo-EM-avbildning och några överväganden som kan påverka kvaliteten på de bildade monoskikten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

Elektronkristallografi är ett kraftfullt verktyg för högupplösningsstrukturbestämning. Makromolekyler som lösliga eller membranproteiner kan odlas till högbeställda tvådimensionella (2D) kristaller under gynnsamma förhållanden. Kvaliteten på de odlade 2D-kristallerna är avgörande för upplösningen av den slutliga återuppbyggnaden via 2D-bildbehandling. Under årens lopp har lipidmonoskikt använts som ett stödjande skikt för att främja 2D-kristallisering av perifera membranproteiner samt lösliga proteiner. Denna metod kan också tillämpas på 2D-kristallisering av integrerade membranproteiner men kräver mer omfattande empirisk undersökning för att bestämma tvättmedel och dialys villkor för att främja partitionering till monolayer. En lipidmonalayer bildas vid luft-vattengränssnittet så att polarläpphuvudgrupperna förblir hydratiserade i vattenfasen och de icke-polära, aylkedjorna, svansarna delar sig i luften, bryter ytspänningen och plattar ut vattenytan. Huvudgruppernas laddade natur eller distinkta kemiska moieties ger affinitet för proteiner i lösning, vilket främjar bindning för 2D-matrisbildning. Ett nybildat monoskikt med 2D-matrisen kan lätt överföras till ett elektronmikroskop (EM) på ett kolbelagt kopparnät som används för att lyfta och stödja den kristallina matrisen. I detta arbete beskriver vi en lipid monolayer metodik för kryogena elektron mikroskopisk (cryo-EM) imaging.

En lipidmonalayer som deponeras på EM-nätet kan visualiseras under ett transmissionselektronmikroskop (TEM) utan färgning. Monoskiktsnärvaron kan kännas igen av kontrastskillnaden från området utan något prov i strålbanan. Områden som har lipidmonagertäckning har lägre lokal kontrast än de som inte har täckning, eftersom elektronstrålen genom de tomma hålen inte har någon spridning och visar en ljusare belysning (figur 3).
För att screena villkor...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Lipidmonoskikt har använts som grund för att bilda tvådimensionella (2D) proteinkristaller för strukturella studier i årtionden. De är stabila vid luft-vatten-gränssnittet och kan fungera som ett tunt stödmaterial för elektronavbildning. Här presenterar vi de beprövade stegen för att förbereda lipidmonoskikt för biologiska studier.

Provberedning med lipidmonalayermetod för elektronkristallkroografiska studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Under åren har lipidmonolayers använts som ett stödjande skikt för att främja 2D-kristallisering av perifera membranproteiner, liksom lösliga proteiner. Denna metod kan också tillämpas på 2D-kristallisering, som vissa integrerade membranproteiner. Men kräver mer omfattande empirisk undersökning för att bestämma tvättmedel och dialys villkor för att främja partitionering till lipid monolayer.En lipidmonolayer bildas vid luftvattengränssnittet, så att lipidens polära huvudgrupper förblir hydratiserade i vattenfasen. Och de icke-polära akrylsvansarna i lipidpartitionen till luftvattengränssnittet, vilket bryter ytspänningen och plattar vattenytan. Laddningsnaturen lipidhuvudgruppernas distinkta kemiska munterhet ger affiniteten för proteiner i lösning.Främja bindning och i princip 2D-matrisbildning. Alla 2D-kristaller som bildas på ett lipidmonolayer kan lätt överföras till elektronmikroskopet på ett kolbelagt EM-galler som används för att lyfta och stödja den kristallina matrisen på lipidskiktet. Vi beskrivs i detta manuskript, en lipid monolayer metodik för cryogenic elektron mikroskopi imaging.Lipid monolayer förberedelse. Lipid lager beredning, förbereda en 0,01 mg per ml lipidblandning i 9: 1 volym till volym kloroform, metanol. Användning av 8,91 ml kloroform och 0, 99 ml metanol och 0, 1 ml av en 10 mg per ml lipidlösning.Teflon tallrik förberedelse. Sonikera en Teflon tallrik i ett metanolbad i fem minuter. Tvätta med varmt vatten i 15 minuter och skölj sedan med destillerat vatten.Torka teflonplattan i en torkad i 30 minuter och håll den under vakuum tills den används. Bildning av lipidmonolayer på buffertbehållaren. Beräknad driftstid kommer att vara en och en halv timme.Placera ett filterpapper av typ ett i en Petriskål och placera teflonblocket ovanpå filterpapperet. Fyll brunnarna på Teflonplattan med 60 mikroliter buffert. Tillsätt försiktigt flytande blandning ovanpå buffertytan droppe för droppe.Helst en mikroliter per droppe med en Hamilton-spruta. Fukta filterpapperet med destillerat vatten och håll luftfuktigheten i Petri-skålen. Inkubera vid rumstemperatur i 60 minuter, kloroformen ska avdunsta och ett monoskikt av lipid på buffertens yta bör bildas.Applicering av ett EM-rutnät på ett lipidmonolayer. Beräknad driftstid en och en halv timme. Placera försiktigt ett kolbelagt EM-galler utan glöd som lossar kolsidan ner på ytan av varje buffertbehållare.Injicera försiktigt proteiner i sidoinjektionen väl, använd slutliga proteinkoncentrationer i brunnen runt en mikromolar. Inkubera 60 minuter vid rumstemperatur. Injicera försiktigt cirka 20 till 30 mikroliter buffert i injektionsporten för att höja gallret ovanför teflonblockets yta.Detta gör att du kan plocka upp gallret med ett par pincett och lyfta det vertikalt från droppen. Representativa resultat. Ett lipidmonolayer som deponeras på ett EM-rutnät kan visualiseras under transmissionselektronmikroskopet utan kontrastfärgning.Monolayernärvaron kan kännas igen, genom kontrastskillnaden från området utan något prov i den strålbanan. Områden som har lipidmonolayertäckning har lägre kontrast än de utan täckning. Eftersom elektronstrålen genom de tomma hålen inte har någon spridning visar den en ljusare belysning.Sammanfattningsvis erbjuder lipidmonolayermetoden en möjlighet att studera proteinstrukturer på grund av dess enkelhet. Det kan ge ett alternativt tillvägagångssätt för att underlätta processen med 2D-kristallisering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Ett plasmaprovförberedelse för masspektrometri med hjälp av en automatiserad arbetsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Arbetsflöde och verktyg för kristallografisk fragmentscreening på Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Förberedelse av provstödsfilmer i transmissionselektronmikroskopi med hjälp av ett stödflötblock

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Storskaliga Multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): Riktlinjer för provberedning och normalisering

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...