Name: sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Bu makalenin hazırlanması, ABD Ordu Araştırma Ofisi (W911NF2010321) ve Arizona Eyalet Üniversitesi başlangıç fonları tarafından P.-L.C kısmen desteklendi.

1. Teflon blok hazırlığı
<ol><li>Teflon bloğunu kimyasallara dayanıklı PTFE (politetrafloroetilen) reçinesinden hazırlayın. Genel bir matkap ve ardından Şekil 1'deetiketlenen boyutları kullanarak blokta delikler açın.</li>
</ol>2. Monolayer lipid hazırlama
NOT: Tahmini çalışma süresi: 30-45 dakika
<ol><li>Lipid stok hazırlığı<ol>
<li>8,91 mL kloroform, 0,99 mL metanol ve 10 mg/mL...

Lipid monolayer, biyolojik makromoleküllerin yapısal çalışmaları için büyük 2D kristallerin büyümesini kolaylaştıran güçlü bir araçtır. Hava-su arayüzünde bozulmamış bir lipid monolayerini başarıyla hazırlamak için, lipitlerin deney günü taze olarak hazırlanması şiddetle tavsiye edilir, çünkü lipid akil zincirinin oksitlenmesi monolayerde paketleme bozulmasına yol açabilir ve ortaya çıkan kristal oluşumunu olumsuz yönde etkileyebilir. Toz halinde satın alınan lipitler, fosfolipid...

2D kristaller veya sarmal protein dizileri aracılığıyla elektron kırınımı, uygun durumlarda nanometre altı çözünürlükleri elde edebilir1,2,3. Özellikle ilgi çekici olan, 2D membran protein dizileri veya kristalleri yakın yerel ortamlarında yeniden inşa edilir1. Bir kristal, belirli uzamsal frekanslardaki yapısal faktörlerin yoğunluklarını artıran bir sinyal amplifikatörü görevi gördüğü için, elektron kristalografisi, tek parçacıklı kriyo-EM'ye göre küçük moleküller gibi yüksek çözünürlüklerde daha küçük boyutlu bir hedefin yoklasını sağlar. Elektron ışını, görüntü düzleminin dedektör4'tekaydedildiği yere bağlı olarak bir kırınım deseni veya kafes görüntüsü oluşturarak, sipariş edilen bir 2D protein dizisi tarafından dağıtılabilir. Dağınık yoğunluklar daha sonra kristalin 2D projeksiyon yapısını yeniden oluşturmak için çıkarılabilir ve işlenebilir. Elektronlar X ışınlarından daha büyük bir saçılma kesitlerine sahiptir ve saçılımı çoğunlukla elektronlar ve moleküldeki yüklü atomlar arasındaki Coulomb etkileşimini temel alan Rutherford modelini izler5. 2D membran kristallerinin kalınlıkları genellikle 100 nm'den azdır, numune6içinde dinamik saçılma olmadan elektron iletimi için uygundur. Elektron kristalografik çalışmalarının membran proteinlerinin ve lipid-protein etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü yapısal bilgilerini araştırmak için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Lipid monolayer, hava suyu arayüzünde yoğun olarak paketlenmiş fosfolipidlerden oluşan tek bir lipit tabakasıdır6Çözünür proteinler veya periferik membran proteinleri için 2D dizi oluşumuna yardımcı olabilir18. Lipitlerin yoğunluğuna ve yanal basıncına bağlı olarak, lipid molekülleri, havaya uzatılan akil zincirleri ve sulu çözelti 1,6,19'damaruz kalan hidrofilik kafa grupları ile hava-su arayüzünde sıralı bir2Ddizi oluşturabilir. Lipid kafa grubu elektrostatik etkileşim yoluyla proteinlerle etkileşime girebilir veya belirli bir protein etki alanını bağlamak için bir benzeşim etiketi sağlamak için değiştirilebilir. Örneğin, DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-[(N-(5-amino-1-karboksipentyl)iminodi süksinil]2- Ni2+) proteinleri poli-histidin etiketi20 , 21,22 ile bağlamak için genellikle bir lipid monolayeroluştururkenkullanılır. Ayrıca, kolera toksini B, ganglioside GM1'in belirli bir pentasaccharide'ini yapısal çalışmalar için bir lipid monolayerine bağlayabilir23,24. Lipid kafa gruplarına proteinleri tutturarak, lipid monolayer yüksek çözünürlüklü elektron kristalografik çalışmalar için ince olan 2D dizilerin oluşumuna yardımcı olabilir. Lipid monolayer tekniği elektron kristalografisinde proteinlerin yapısal etütlerinde kullanılmıştır, streptavidin2,25, annexin V26, kolera toksini27, E. coli gyrase B alt bira28, E. coli RNA polimeraz25,29,30, karboksiom kabuk proteinleri31 ve HIV-132 ve Moloney murine lösemi virüsünün kapsid proteinleri gibi 33. Lipid monolayer stabilitesi ve kimyasal özelliği nedeniyle, kriyo-EM görüntüleme için numune hazırlama için farklı uygulamalar araştırılmıştır34. Bununla birlikte, protein dizisi oluşumu için optimizasyona ihtiyaç duyulacaktır.
Burada, lipid monolayerlerin kriyo-EM görüntüleme için genel hazırlığı ve oluşan monolayerlerin kalitesini etkileyebilecek bazı hususlar hakkında kapsamlı ayrıntılar sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14:0 PC (DMPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 
			1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulb for small pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator vacuum</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>55207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF413-50</td>
			<td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &#181;m hole, 1.3 &#181;m space</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Diameter 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (25 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>87930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (500 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>203080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1775-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon block</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55UK05</td>
			<td>60 &#181;L wells with side injection ports, manually made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78325</td>
			<td>Various styles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-996</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies

Elektron kristalografisi yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için güçlü bir araçtır. Çözünür veya membran proteinleri gibi makromoleküller uygun koşullar altında yüksek dereceli iki boyutlu (2D) kristaller halinde yetiştirilebilir. Yetiştirilen 2D kristallerin kalitesi, 2D görüntü işleme yoluyla nihai yeniden yapılandırmanın çözümü için çok önemlidir. Yıllar içinde lipid monolayerler, periferik membran proteinlerinin yanı sıra çözünür proteinlerin 2D kristalizasyonunu teşvik etmek için destekleyici bir tabaka olarak kullanılmıştır. Bu yöntem, integral membran proteinlerinin 2D kristalizasyonuna da uygulanabilir, ancak tek katmanlıya bölünmeyi teşvik etmek için deterjan ve diyaliz koşullarını belirlemek için daha kapsamlı ampirik inceleme gerektirir. Hava-su arayüzünde, polar lipid kafa gruplarının sulu fazda nemlendirilmesi ve polar olmayan, akil zincirleri, kuyrukların havaya bölünmesi, yüzey gerilimini kırması ve su yüzeyini düzleştirmesi için bir lipid monolayer oluşur. Baş gruplarının yüklü doğası veya ayırt edici kimyasal moieties, çözeltideki proteinler için benzeşim sağlayarak 2D dizi oluşumu için bağlamayı teşvik eder. 2D dizili yeni oluşturulmuş bir monolayer, kristal diziyi kaldırmak ve desteklemek için kullanılan karbon kaplı bir bakır ızgara üzerinde bir elektron mikroskobuna (EM) kolayca aktarılabilir. Bu çalışmada kriyojenik elektron mikroskobik (kriyo-EM) görüntüleme için lipid monolayer metodolojisini anlatıyoruz.

EM ızgarasına biriken bir lipid monolayer, lekelenmeden bir iletim elektron mikroskobu (TEM) altında görselleştirilebilir. Monolayer varlığı, kiriş yolunda herhangi bir örnek olmadan alandan kontrast farkı ile tanınabilir. Lipid monolayer kapsama alanına sahip alanlar, kapsama alanı olmayanlara göre daha düşük yerel kontrasta sahiptir, çünkü boş deliklerden geçen elektron ışını saçılmaz ve daha parlak bir aydınlatma gösterir (Şekil 3).
<p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies at JoVE.com

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Lipid monolayerler, on yıllardır yapısal çalışmalar için iki boyutlu (2D) protein kristalleri oluşturmak için bir temel olarak kullanılmaktadır. Hava-su arayüzünde stabildirler ve elektron görüntüleme için ince bir destekleyici malzeme olarak hizmet verebilirler. Burada lipid monolayerlerinin biyolojik çalışmalara hazırlanması konusunda kanıtlanmış adımları sunuyoruz.

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Yıllar içinde lipid Monolayers, periferik membran proteinlerinin yanı sıra çözünür proteinlerin 2D kristalizasyonunu teşvik etmek için destekleyici bir katman olarak kullanılmıştır. Bu yöntem, bazı integral membran proteinleri olarak 2D kristalizasyona da uygulanabilir. Ancak lipid monolayer'a bölünmeyi teşvik etmek için deterjan ve diyaliz koşullarını belirlemek için daha kapsamlı ampirik araştırma gerektirir.Hava suyu arayüzünde bir lipid monolayer oluşur, böylece lipit kutup kafa grupları sulu fazda nemli kalır. Ve lipid bölümünün polar olmayan akil kuyrukları, yüzey gerilimini kıran ve su yüzeyini düzleyen hava suyu arayüzüne. Yük doğası lipid kafa gruplarının ayırt edici kimyasal moieties çözelti proteinler için benzeşim sağlar.Bağlamayı ve ilke 2B dizi oluşumunu teşvik etme. Bir lipid monolayer üzerinde oluşturulan herhangi bir 2D kristal, lipid tabakasındaki kristal diziyi kaldırmak ve desteklemek için kullanılan karbon kaplı bir EM ızgarası üzerinde elektron mikroskobuna kolayca aktarılabilir. Kriyojenik elektron mikroskopi görüntüleme için lipid monolayer metodolojisi olan bu yazıda açıklanmıştır.Lipid monolayer hazırlığı. Lipid stok hazırlığı, hacim kloroform, metanol için 9:1 hacimde ml lipid karışımı başına 0.01 mg hazırlayın. 8.91 ml kloroform ve 0.99 ml metanol ve ml lipid çözeltisi başına 10 mg'ın 0.1 ml'si kullanılarak.Teflon plaka hazırlığı. Beş dakika boyunca metanol banyosunda bir Teflon tabağı sonicate. Sıcak suyla 15 dakika yıkayın ve ardından damıtılmış su ile durulayın.Teflon plakayı 30 dakika boyunca kurumuş bir şekilde kurulayın ve kullanıma kadar vakum altında tutun. Tampon rezervuarında lipid monolayer oluşumu. Tahmini çalışma süresi bir buçuk saat olacaktır.Petri kabına bir tip bir filtre kağıdı yerleştirin ve Teflon bloğunu filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Teflon plakanın kuyularını 60 mikrolitre tamponla doldurun. Tampon yüzeyinin üzerine damla damla sıvı karışım dikkatlice ekleyin.Hamilton şırıngası kullanarak damla başına ideal olarak bir mikroliter. Filtre kağıdını damıtılmış suyla ıslatın ve Petri kabında nemi koruyun. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatırılması, kloroformun buharlaşması ve tamponların yüzeyinde bir tek katmanlı lipit oluşması gerekir.Lipid monolayer üzerinde em ızgara uygulaması. Tahmini çalışma süresi bir buçuk saat. Karbon tarafı buharlaştırmadan karbon kaplı bir EM ızgarasını her tampon rezervuarın yüzeyine hafifçe yerleştirin.Proteinleri yan enjeksiyona dikkatlice enjekte edin, bir mikromolar etrafındaki kuyuda son protein konsantrasyonlarını kullanın. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatır. Izgarayı Teflon bloğunun yüzeyinin üzerine çıkarmak için site enjeksiyon portuna yaklaşık 20 ila 30 mikrolitre tamponu hafifçe enjekte edin.Bu, ızgarayı bir çift cımbızla almanızı ve damlacığı dikey olarak kaldırmanızı sağlar. Temsili sonuçlar. Em ızgarasına biriken bir lipid monolayer, kontrast boyama olmadan iletim elektron mikroskobu altında görselleştirilebilir.Monolayer varlığı, bu kiriş yolunda herhangi bir örnek olmadan alandan kontrast farkı ile tanınabilir. Lipid monolayer kapsamına sahip alanlar, kapsama alanı olmayanlara göre daha düşük kontrasta sahiptir. Boş deliklerden geçen elektron ışınlarının saçılması olmadığından daha parlak bir aydınlatma gösterir.Sonuç olarak, lipid monolayer yöntemi basitliği nedeniyle protein yapılarını incelemek için bir fırsat sunar. 2D kristalleşme sürecini kolaylaştırmak için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Otomatik İş İstasyonu Kullanarak Kütle Spektrometresi Için Plazma Numune Spektrometresi Hazırlığı

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Destek Yüzdürme Bloğu Kullanılarak İletim Elektron Mikroskopisinde Numune Destek Filmlerinin Hazırlanması

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Büyük Ölçekli Multi-omik Genom Çapında İlişkilendirme Çalışmaları (Mo-GWAS): Numune Hazırlama ve Normalleştirme Kılavuzları

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...