Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31772124 و 31972239) وجامعة فوجيان للزراعة والغابات (Grant KSYLX014).

تم نشر نطاطات الأوراق البالغة غير الخبيثة في مركز أبحاث الفيروسات المنقولة بالنواقل في جامعة فوجيان للزراعة والغابات ، الصين.
1. تربية الحشرات غير المميتة
<ol><li>قم بتربية البالغين على شتلات الأرز في قفص مكعب بحجم 40 سم × 35 سم × 20 سم (الطول × العرض × الارتفاع). احتفظ بجانب واحد م?...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

يلعب اللعاب الذي تفرزه الغدد اللعابية مباشرة للحشرات الماصة للثقب دورا محوريا لأنه يهضم ويزيل السموم من الأنسجة المضيفة والعوامل البيولوجية عبر المملكة في المضيفين1،3،4. العوامل البيولوجية عبر المملكة ، بما في ذلك المستنبطات والمستجيبا...

إن طريقة انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات ذات النواقل والمضيف ، وهي مشكلة أساسية ، هي في حدود العلوم البيولوجية. تنتقل العديد من الفيروسات النباتية ذات الأهمية الزراعية أفقيا عن طريق ناقلات الحشرات1. يتم نقل أكثر من نصف فيروسات النبات بواسطة الحشرات النصفية ، بما في ذلك حشرات المن ، والذباب الأبيض ، ونطاطات الأوراق ، ونطاطات النبات ، والتريبس. هذه الحشرات لها سمات مميزة تمكنها من نقل فيروسات النبات بكفاءة1. لديهم أجزاء فم مص خارقة ويتغذون على النسغ من اللحاء ونسيج الخشب ، ويفرزون لعابهم1،2،3،4. مع تطوير وتحسين التقنيات ، أصبح تحديد المكونات اللعابية وتحليلها وظيفيا محورا جديدا للبحث المكثف. تشمل البروتينات اللعابية المعروفة في اللعاب العديد من الإنزيمات ، مثل البكتينستيراز ، السليولاز ، البيروكسيديز ، الفوسفاتيز القلوي ، أوكسيديز البوليفينول ، والسكراز ، من بين أمور أخرى5،6،7،8،9،10،11،12،13. تشتمل البروتينات الموجودة في اللعاب أيضا على المحفزات التي تؤدي إلى استجابة دفاع المضيف ، وبالتالي تغيير أداء الحشرات ، والمستجيبات التي تثبط دفاع المضيف ، مما يعزز لياقة الحشرات والمكونات التي تحفز الاستجابات المرضية للمضيف14،15،16،17. لذلك ، تعتبر بروتينات اللعاب مواد حيوية للتواصل بين الحشرات والمضيفين. أثناء انتقال الفيروسات ، يحتوي اللعاب الذي تفرزه الغدد اللعابية للحشرات الخبيثة الماصة للثقب أيضا على بروتينات فيروسية. تستخدم المكونات الفيروسية تدفق اللعاب لإطلاقها من الحشرة إلى مضيف النبات. لذلك ، فإن لعاب الحشرات يسد التفاعل الثلاثي التغذية بين الفيروس والناقل والمضيف. يساعد التحقيق في الوظيفة البيولوجية لبروتينات اللعاب التي تفرزها الحشرات الخبيثة على فهم العلاقة بين الفيروس والناقل والمضيف.
بالنسبة للفيروسات الحيوانية ، أفيد أن لعاب البعوض يتوسط في انتقال وإمراض فيروس غرب النيل (WNV) وفيروس حمى الضنك (DENV). يعزز بروتين اللعاب AaSG34 تكاثر فيروس حمى الضنك -2 وانتقاله ، بينما يعزز بروتين اللعاب AaVA-1 انتقال فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا (ZIKV) عن طريق تنشيط الالتهام الذاتي18,19. يمكن لبروتين اللعاب D7 من البعوض أن يثبط عدوى فيروس حمى الضنك في المختبر وفي الجسم الحي عن طريق التفاعل المباشر مع فيروسات DENV وبروتين غلاف DENVالمؤتلف 20. في الفيروسات النباتية ، يحفز فيروس تجعد الأوراق الصفراء للطماطم (TYLCV) بروتين لعابية الذبابة البيضاء Bsp9 ، الذي يثبط مناعة مضيف النبات بوساطة WRKY33 ، لزيادة تفضيل وأداء الذباب الأبيض ، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة انتقال الفيروسات21. نظرا لأن الدراسات حول الدور الذي تلعبه البروتينات اللعابية الحشرية في المضيفين النباتيين قد تخلفت عن دراسات المضيفين من الحيوانات ، فإن هناك حاجة ماسة إلى نظام مستقر وموثوق للكشف عن البروتينات اللعابية في المضيفين النباتيين.
ينتقل فيروس النبات المعروف باسم فيروس قزم الأرز (RDV) بواسطة نطاط الأوراق Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) بكفاءة عالية وبطريقة إكثارية مستمرة22,23. تم الإبلاغ لأول مرة عن انتقال RDV عن طريق ناقل الحشرات ويسبب مرضا شديدا للأرز في آسيا24,25. الفيريون هو كروي ثنائي السطوح ومزدوج الطبقات ، وتحتوي الطبقة الخارجية على بروتين القفيصة الخارجي P822. فترة انتقال الدورة الدموية ل RDV في N. cincticeps هي 14 يوما26،27،28،29،30. عندما يصل RDV إلى الغدد اللعابية ، يتم إطلاق الفيروسات في تجاويف مخزنة في اللعاب في الغدد اللعابية عبر آلية تشبه الإخراجالخلوي 23. فيتلوجينين (Vg) هو سلائف بروتين الصفار الضرورية لتطور البويضات في الحشراتالأنثوية 31،32،33. تحتوي معظم أنواع الحشرات على نسخة Vg واحدة على الأقل من 6-7 كيلو بايت ، والتي تشفر بروتين سلائف يبلغ حوالي 220 كيلو دالتون. يمكن عادة شق سلائف البروتين في Vg إلى شظايا كبيرة (140 إلى 190 كيلو دالتون) وشظايا صغيرة (<50 كيلو دالتون) قبل دخول المبيض18,19. كشف التحليل البروتيني السابق عن وجود الببتيدات المشتقة من Vg في اللعاب المفرز لنطاط الأوراق Recilia dorsalis ، على الرغم من أن وظيفتها غير معروفة (بيانات غير منشورة). تم الإبلاغ حديثا عن أن Vg ، الذي يفرز عن طريق الفم من نطاطات النبات ، يعمل كمستجيب لإتلاف دفاعات النباتات34. من غير المعروف ما إذا كان يمكن أيضا إطلاق Vg of N. cincticeps إلى مضيف النبات مع تدفق اللعاب ، ومن ثم يمكن أن يلعب دورا في النبات للتداخل مع دفاعات النبات. لمعالجة ما إذا كانت N. cincticeps تستغل البروتينات اللعابية ، مثل Vg ، لتثبيط أو تنشيط دفاعات النبات ، فإن الخطوة الأولى هي تحديد البروتينات التي يتم إطلاقها للنبات أثناء التغذية. من المحتمل أن يكون فهم طريقة تحديد البروتينات اللعابية الموجودة في النبات ضروريا لشرح وظيفة بروتينات اللعاب والتفاعلات بين Hemiptera والنباتات.
في البروتوكول المقدم هنا ، يتم استخدام N. cincticeps كمثال لتوفير طريقة لفحص وجود البروتينات اللعابية في مضيف النبات الذي يتم إدخاله من خلال تغذية الحشرات. يفصل البروتوكول في المقام الأول جمع واكتشاف البروتينات اللعابية وهو مفيد لمزيد من التحقيق في معظم hemipterans.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

تنقل ناقلات الحشرات أفقيا العديد من الفيروسات النباتية ذات الأهمية الزراعية. ينتقل أكثر من نصف فيروسات النبات عن طريق الحشرات النصفية التي لها أجزاء فم خارقة مصة. أثناء انتقال الفيروس ، يربط لعاب الحشرات مضيف الفيروس الناقل لأن اللعاب ينقل الفيروسات ، وبروتينات الحشرات ، تحفز أو تثبط الاستجابة المناعية للنباتات من الحشرات إلى مضيفات النباتات. أصبح تحديد البروتينات اللعابية وتحليلها وظيفيا مجالا جديدا للتركيز في مجال البحث في تفاعلات الفيروسات المنقولة بالمفصليات مع المضيف. يوفر هذا البروتوكول نظاما للكشف عن البروتينات في لعاب نطاطات الأوراق باستخدام مضيف النبات. ومن الأمثلة على ذلك ناقل نطاط الأوراق Nephotettix cincticeps المصاب بفيروس قزم الأرز (RDV). يمكن الكشف عن vitellogenin وبروتين القفيصة الخارجي الرئيسي P8 من RDV المتجه بواسطة لعاب N. cincticeps في وقت واحد في نبات الأرز الذي يتغذى عليه N. cincticeps. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لاختبار البروتينات اللعابية التي يتم الاحتفاظ بها بشكل عابر في مضيف النبات بعد تغذية الحشرات. ويعتقد أن نظام الكشف هذا سيفيد دراسة تفاعلات فيروس نصف الدم أو النبات النصفي.

يوضح الشكل 1 جميع الخطوات في هذا البروتوكول: تربية الحشرات ، واكتساب الفيروسات ، وجمع البروتينات اللعابية عن طريق تغذية الأرز ، واللطخة الغربية. أظهرت نتائج البقع الغربية أنه لوحظت نطاقات محددة ومتوقعة تبلغ حوالي 220 كيلو دالتون في عينات تغذية الأرز والغدد اللعابية لل?...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام مضيف النبات للكشف عن البروتينات اللعابية لنطاط الأوراق والبروتينات الفيروسية النباتية التي تطلقها ناقلات نطاط الأوراق.

الكشف عن الفيروسات والبروتينات اللعابية لناقل نطاط الأوراق في مضيف النبات

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

يوفر هذا البروتوكول تقنية للكشف عن البروتينات اللعابية لنطاطات الأوراق والمضيفات النباتية لمزيد من التحقيق في وظيفة هذه البروتينات في مضيفات النبات. هذه التقنية سهلة التنفيذ والنظام مستقر وقابل للتكرار. يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة أيضا في الكشف عن البروتينات اللعابية للفالج والمضيفات النباتية الأخرى.للبدء ، قم بتربية نطاطات الأوراق البالغة على شتلات الأرز في قفص مكعب 40 × 35 × 20 سم. احتفظ بجانب واحد من القفص مغطى بشبكة مقاومة للحشرات للتهوية. ضع الأقفاص مع نطاطات الأوراق في حاضنة تحتوي على وحدة تحكم رطوبة مدمجة عند 26 درجة مئوية مع رطوبة نسبية من 60 إلى 75٪ تحت فترة تصوير 16 ساعة ضوء وثماني ساعات مظلمة.مرة واحدة في الأسبوع ، استخدم شفاطا لنقل جميع البالغين برفق من قفصهم إلى قفص جديد يحتوي على شتلات الأرز الطازجة. اسمح لأكثر من 200 شخص بالغ بالتزاوج ووضع البيض في الأرز. احتفظ بشتلات الأرز القديمة حتى تظهر الحوريات وتربية هذه الحوريات الجديدة غير الخبيثة إلى المرحلة الثانية.باستخدام الشافطة ، انقل بعناية الحوريات الثانية غير الخبيثة إلى أنبوب مزرعة زجاجي لمدة ساعة إلى ساعتين من أجل الجوع. ثم حرر الحوريات في قفص يحتوي على نبات أرز مصاب بفيروس قزم الأرز يزرع في أصيص ويسمح للحوريات بالتغذي على نبات الأرز المصاب لمدة يومين. بعد يومين ، انقل هذه الحوريات بعناية إلى قفص جديد يحتوي على شتلات أرز طازجة خالية من الفيروسات ، واسمح للحوريات بالتغذي على شتلات الأرز الخالية من الفيروسات لمدة 12 يوما لإكمال فترة انتقال الدورة الدموية لفيروس قزم الأرز.لجمع البروتينات اللعابية ، قم بإعداد خمسة أقفاص تغذية صغيرة تشبه الأنابيب مغطاة بشبكة مقاومة للحشرات من أحد طرفيها. بعد حصر 15 إلى 20 نطاط أوراق في كل قفص تغذية ، قم بتغطية الطرف الآخر من القفص بسجادة رغوية رقيقة. ثبت شتلة أرز واحدة بين نهاية القفص وحصيرة رغوية بأشرطة ، مما يضمن أن نطاطات الأوراق في قفص التغذية يمكن أن تتغذى على شتلات الأرز المعرضة لداخل القفص.اغمر جذور الشتلات في الماء حتى يبقى نبات الأرز على قيد الحياة ، واترك نطاطات الأوراق تتغذى عليها لمدة يومين. بعد يومين ، قم بإزالة نطاطات الأوراق من أقفاص التغذية الخاصة بهم واجمع شتلات الأرز التي تتغذى عليها نطاطات الأوراق. قطع الشتلات خارج القفص واستعادة مناطق تغذية الشتلات.قم بإعداد 1x Tris-Glycine buffer عن طريق تخفيف 200 مل من المخزن المؤقت 5x المحضر مع 800 ملليلتر من الماء المعقم. ثم قم بإعداد 10x TBS buffer والأوتوكلاف الحل عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت لعينة البروتين 4x.ثم قم بإعداد المخزن المؤقت للنقل عن طريق خلط 800 ملليلتر من المخزن المؤقت Tris-Glycine مع 200 ملليلتر من الميثانول. أخيرا ، قم بإعداد محلول TBST بإضافة 100 ملليلتر من 10x TBS وثلاثة ملليلتر من Tween 20 إلى 900 ملليلتر من الماء المعقم. للكشف عن البروتينات اللعابية والفيروسية ، قم بطحن 0.1 جرام من عينات الأرز بالنيتروجين السائل حتى يصبح النسيج مسحوقا.ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة البروتين 4x إلى العينة واغلي لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي العينات ونقل الطافية إلى قارورة جديدة. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة على جل SDS-PAGE وقم بتشغيلها في مخزن مؤقت Tris-Glycine عند 150 فولت لمدة 45 إلى 60 دقيقة.أثناء تشغيل الجل ، ضع غشاء نيتروسليلوز 0.45 ميكرون ومستلزمات شطيرة أخرى في مخزن النقل المؤقت لمدة 30 دقيقة. بعد الجري ، قم بوضع شطيرة الجل ونقله لمدة 90 إلى 120 دقيقة عند 100 فولت في المخزن المؤقت للنقل. بعد اكتمال النشاف ، ضع الغشاء في محلول مانع للحليب الجاف 7٪ منزوع الدسم في TBST واحتضانه لمدة 20 دقيقة.بعد ذلك ، أضف جسما مضادا ضد فيروس قزم الأرز P8 أو vitellogenin واحتضان الغشاء لمدة ساعتين أو طوال الليل. بعد الحضانة ، اغسل الغشاء باستخدام TBST ثلاث مرات مع حضانة لمدة خمس دقائق بين كل غسلة. ثم أضف الماعز المضاد للأرانب IgG كجسم مضاد ثانوي واحتضان الغشاء لمدة 60 إلى 90 دقيقة.استخدم مجموعة ECL Western للكشف الكيميائي في كواشف الكشف المختلطة واحد واثنان في المجموعة بنسبة واحد إلى واحد. ضع الغشاء على الكاشف المختلط واحتضان اللطخة لمدة خمس دقائق. استنزاف الكاشف الزائد والتقاط صورة كيميائية ولونية للغشاء.الجمع بين الصور لرؤية هذا الأخير مع عصابات البروتين. أظهر تحليل اللطخة الغربية للكشف عن vitellogenin نطاقات محددة ومتوقعة من حوالي 220 كيلو دالطن في تغذية نباتات الأرز والغدد اللعابية للحشرات. في المقابل ، لم يلاحظ أي شريط في النباتات غير التغذية ، مما يشير إلى إطلاق فيتلوجينين في مضيف النبات كبروتين لعابي.أظهر تحليل اللطخة الغربية للكشف عن بروتين P8 لفيروس قزم الأرز نطاقا محددا ومتوقعا يبلغ حوالي 46 كيلودالطن في النباتات المغذية وأجسام الحشرات الخبيثة. في المقابل ، لم يلاحظ أي شريط في النباتات غير المغذية وأجسام نطاط الأوراق غير الخبيثة ، مما يثبت أنه يمكن أيضا اكتشاف البروتينات الفيروسية في النباتات المغذية. يجب أن يؤخذ في الاعتبار التحميل الفيروسي في نطاطات الأوراق وتوقيت الكشف والنسخ المتماثلة أثناء تنفيذ هذا البروتوكول.يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لدراسة البعوض الذي ينقل الفيروسات المنقولة بالمفصليات.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

تشريح الغدد اللعابية والمعي المتوسط ​​من AE. بعوض البعوض

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

فيروس من صنع جين إسكات (VIGS) في نيكوتيانا benthamiana والطماطم

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

الأجرعية بوساطة الفيروسات إسكات الجينات المستحثة الفحص في القطن

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic الأحيائي كأداة فحص لمواد متطايرة النبات المضيف

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

غليكان التنميط من البوليمرات جدار الخلية النباتية باستخدام [ميكروأرس]

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

الجسم الدهون نظام الثقافة الجهاز في بعوض الزاعجة المصرية، ناقل للفيروس Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...